本發(fā)明涉及一種基于對巰基苯胺修飾金納米棒的食源性致病菌檢測方法，具體涉及以巰基苯胺修飾的金納米棒顆粒作為增強基底，利用核酸適配體DNA與食源性致病菌競爭性與適配體結(jié)合導(dǎo)致核酸適配體構(gòu)象變化，結(jié)合拉曼光譜技術(shù)實現(xiàn)食源性致病菌的快速、靈敏檢測。

背景技術(shù)：

食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，對人類健康造成很大危害，是食品安全的重大隱患。常用的食源性致病菌分析方法目前主要有傳統(tǒng)的微生物檢驗技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、儀器分析技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)?，F(xiàn)有的這些分析方法雖各有優(yōu)勢，但都存在一定的局限性，或者前處理步驟復(fù)雜、時間長，或者儀器設(shè)備龐大昂貴等。鑒于申請人在材料、生物技術(shù)及拉曼技術(shù)等方面積累了良好的工作基礎(chǔ)，本發(fā)明擬構(gòu)建一套顯微拉曼光譜系統(tǒng)，深入研究快速、靈敏的食源性致病菌檢測方法，該方法適用于食品安全、環(huán)境監(jiān)測等技術(shù)領(lǐng)域。

目前，利用核酸適配體DNA與食源性致病菌競爭性與適配體結(jié)合導(dǎo)致核酸適配體構(gòu)象變化，結(jié)合拉曼光譜技術(shù)實現(xiàn)食源性致病菌的快速、靈敏檢測鮮為報道。本發(fā)明作為一種新興的食源性致病菌檢測方法，實現(xiàn)了食源性微生物快速、靈敏檢測分析。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了一種基于對巰基苯胺修飾金納米棒的食源性致病菌檢測方法，其靈敏度高、可靠性強、檢測速度快，實現(xiàn)了食源性致病菌的檢測分析，適用于食品安全、環(huán)境監(jiān)測等技術(shù)領(lǐng)域。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案：以食源性致病菌為研究對象，以巰基苯胺修飾的金納米棒顆粒作為增強基底，食源性致病菌核酸適配體通過強大的靜電吸附作用吸附在巰基苯胺修飾的金納米棒顆粒表面，從而保護金納米棒顆粒在鹽溶液環(huán)境下不發(fā)生聚集現(xiàn)象，然而，當(dāng)核酸適配體互補DNA與食源性致病菌共同存在于檢測溶液中時，由于核酸適配體互補DNA與食源性致病菌競爭性地與核酸適配體發(fā)生特異性結(jié)合，導(dǎo)致適配體構(gòu)象嚴(yán)重變化，進而導(dǎo)致巰基苯胺修飾的金納米棒顆粒在鹽溶液中的聚集差異；通過自主搭建的顯微拉曼光譜系統(tǒng)，測定上述混合溶液拉曼信號，得到不同濃度食源性致病菌存在時巰基苯胺染料的拉曼圖譜，實現(xiàn)對食源性致病菌的定量檢測，并在牛奶實際樣品中進行方法可行性驗證。該檢測方法適用于食品安全、環(huán)境監(jiān)測等技術(shù)領(lǐng)域。

上述的一種基于對巰基苯胺修飾金納米棒的食源性致病菌檢測方法，所制備金納米棒是采用種子生長法，以十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和含有雙鍵的陰離子十二烷基苯基磺酸鈉(SDBS)作為表面活性劑膠束模板，在可溶性金源、可溶性銀鹽、抗壞血酸、硼氫化鈉共同存在的酸性條件下，經(jīng)過陳化所得。同時，制備過程中，通過調(diào)節(jié)不同表面活性劑濃度，考察其對金納米棒尺寸、形貌、長徑比、光學(xué)性質(zhì)對表面增強拉曼信號的影響。最終，將優(yōu)化后金納米棒的形貌、等離子體共振吸收(LSPR)進行表征。

上述的一種基于對巰基苯胺修飾金納米棒的食源性致病菌檢測方法，所搭建顯微拉曼光譜系統(tǒng)是將拉曼光譜技術(shù)與顯微成像技術(shù)的獨特性質(zhì)相結(jié)合，既可用于拉曼光譜檢測研究，還可通過顯微模塊，用于微觀領(lǐng)域的拉曼光譜同步分析，實現(xiàn)不同技術(shù)之間的優(yōu)勢互補，為食源性微生物快速檢測提供優(yōu)勢平臺。

上述的一種基于對巰基苯胺修飾金納米棒的食源性致病菌檢測方法，核酸適配體序列為：5’-SH-TAT GGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTT GAC ATT ATG ACA G-3’。核酸適配體互補DNA序列為：5'-NH2-CAA CAC GTG CCC AAC-3'。

上述的一種基于對巰基苯胺修飾金納米棒的食源性致病菌檢測方法，采用圓二色譜表征核酸適配體與食源性致病菌特異性結(jié)合能力，以及核酸適配體互補DNA與食源性致病菌共同存在時導(dǎo)致核酸適配體構(gòu)象變化現(xiàn)象。

上述的一種基于對巰基苯胺修飾金納米棒的食源性致病菌檢測方法，所述的食源性致病菌至少包含大腸桿菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、布魯氏菌、空腸彎曲菌、沙門氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、霍亂弧菌等。

上述的一種基于對巰基苯胺修飾金納米棒的食源性致病菌檢測方法，該方法包括如下具體步驟：

1)食源性致病菌樣本準(zhǔn)備：首先將微生物的菌株分別接于Luria-Bertani培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)24h，然后以轉(zhuǎn)速5000g離心5min，棄上清液，并用超純水清洗三次，分別重新分散于超純水。最后將所獲得的細(xì)菌菌液分別進行10倍梯度稀釋，獲得8個梯度的菌液儲存?zhèn)溆?，同時采用菌落平板計數(shù)法分別確定細(xì)菌具體的菌落數(shù)量。

2)增強基底制備：增強基底金納米棒的合成是利用種子生長法，在十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(0.2M)膠束水溶液中加入硝酸銀?；旌衔锓磻?yīng)20min，直到顏色變成紅葡萄酒。隨后，將硫酸鈉加入至混合溶液中進行進一步生長。最終，將硫化處理后的金納米棒收集離心(9000轉(zhuǎn)，30分鐘)，用純水洗三次，最后分散在超純水中。取對巰基苯胺(100μL，1.2mM)與1mL制備金納米棒混合，連續(xù)震蕩反應(yīng)5h，得到以對巰基苯胺修飾的金納米棒顆粒增強基底。

3)拉曼光譜采集：首先，將優(yōu)化后100μL 20mM氯化鈉溶液及100μL 20mM核酸適配體溶液加入到上述制備的80μL對巰基苯胺修飾的金納米棒混合物中，隨后，將150μL核酸適配體互補DNA與不同濃度食源性致病菌依次分別加入至相同體積上述混合溶液中，37℃連續(xù)震蕩反應(yīng)3h，最終，分別取檢測體系溶液300uL于96孔板中，利用所搭建顯微拉曼光譜系統(tǒng)在800-930nm波長范圍內(nèi)進行拉曼光譜測定，在此，拉曼光譜的激光波長設(shè)定為785nm。

4)牛奶中食源性致病菌加標(biāo)回收檢測：利用加標(biāo)回收結(jié)合本發(fā)明設(shè)計的檢測方法實現(xiàn)液態(tài)牛奶樣本中的食源性致病菌。檢測前需要對樣本進行預(yù)處理。首先取5ml牛奶于10℃，7000g轉(zhuǎn)速下離心10min，棄去上層乳脂，將沉淀用超純水稀釋20倍，靜置后將上清液用過濾器過濾，收集濾液。最后采用本試驗設(shè)計方法檢測牛奶樣本中的食源性致病菌濃度，并與所添加的濃度作對比。

與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

本發(fā)明所制備金納米棒是采用種子生長法，以十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和含有雙鍵的陰離子十二烷基苯基磺酸鈉(SDBS)作為表面活性劑膠束模板，在可溶性金源、可溶性銀鹽、抗壞血酸、硼氫化鈉共同存在的酸性條件下，經(jīng)過陳化所得。同時，制備過程中，通過調(diào)節(jié)不同表面活性劑濃度，考察其對金納米棒尺寸、形貌、長徑比、光學(xué)性質(zhì)對表面增強拉曼信號的影響。最終，將優(yōu)化后金納米棒的形貌、等離子體共振吸收(LSPR)進行表征。

本發(fā)明所所搭建顯微拉曼光譜系統(tǒng)是將拉曼光譜技術(shù)與顯微成像技術(shù)的獨特性質(zhì)相結(jié)合，既可用于拉曼光譜檢測研究，還可通過顯微模塊，用于微觀領(lǐng)域的拉曼光譜同步分析，實現(xiàn)不同技術(shù)之間的優(yōu)勢互補，為食源性微生物快速檢測提供優(yōu)勢平臺。

本發(fā)明涉及的一種基于對巰基苯胺修飾金納米棒的食源性致病菌檢測方法易于操作，靈敏度高，檢測范圍廣、檢測速度快，在食品安全、環(huán)境監(jiān)測等技術(shù)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

本發(fā)明涉及的核酸適配體序列為：5’-SH-TAT GGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTT GAC ATT ATG ACA G-3’。核酸適配體互補DNA序列為：5'-NH₂-CAA CAC GTG CCC AAC-3'。

本發(fā)明采用圓二色譜表征核酸適配體與食源性致病菌特異性結(jié)合能力及核酸適配體DNA與食源性致病菌共同存在時導(dǎo)致核酸適配體構(gòu)象變化現(xiàn)象。

本發(fā)明涉及的所述的食源性致病菌至少包含大腸桿菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、布魯氏菌、空腸彎曲菌、沙門氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、霍亂弧菌等。

附圖說明

圖1為合成增強基底表征：(A)為金納米棒透射電鏡圖；(B)為金納米棒散射圖；

圖2為試驗方法檢測結(jié)果；(A)為試驗檢測的不同濃度鼠傷寒沙門氏菌拉曼光譜曲線；(B)為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式

實施實例1

為了進一步驗證本發(fā)明所述方法對食源性致病微生物進行檢測，本發(fā)明實例，以鼠傷寒沙門氏菌為例，具體操作步驟如下：

(1)鼠傷寒沙門氏菌樣本準(zhǔn)備：首先將鼠傷寒沙門氏菌的菌株分別接于Luria-Bertani培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)24h，然后以轉(zhuǎn)速5000g離心5min，棄上清液，并用超純水清洗三次，分別重新分散于超純水。最后將所獲得的細(xì)菌菌液分別進行10倍梯度稀釋，獲得8個梯度的菌液儲存?zhèn)溆茫瑫r采用菌落平板計數(shù)法分別確定細(xì)菌具體的菌落數(shù)量。

(2)增強基底制備：增強基底金納米棒的合成是利用種子生長法，在十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(0.2M)膠束水溶液中加入硝酸銀?；旌衔锓磻?yīng)20min，直到顏色變成紅葡萄酒。隨后，將硫酸鈉加入至混合溶液中進行進一步生長。最終，將硫化處理后的金納米棒收集離心(9000轉(zhuǎn)，30分鐘)，用純水洗三次，最后分散在超純水中。取對巰基苯胺(100μL，1.2mM)與1mL制備金納米棒混合，連續(xù)震蕩反應(yīng)5h，得到以對巰基苯胺修飾的金納米棒顆粒增強基底。圖1為合成增強基底表征：(A)為金納米棒透射電鏡圖；(B)為金納米棒散射圖；

(3)拉曼光譜采集：首先，將優(yōu)化后100μL 20mM氯化鈉溶液及100μL 20mM核酸適配體溶液加入到上述制備的80μL對巰基苯胺修飾的金納米棒混合物中，隨后，將150μL核酸適配體互補DNA與不同濃度鼠傷寒沙門氏菌依次分別加入至相同體積上述混合溶液中，37℃連續(xù)震蕩反應(yīng)3h，最終，分別取檢測體系溶液300uL于96孔板中，在800-930nm波長范圍內(nèi)進行拉曼光譜測定，在此，拉曼光譜的激光波長設(shè)定為785nm。圖2為試驗方法檢測結(jié)果：(A)為試驗檢測的不同濃度鼠傷寒沙門氏菌拉曼光譜曲線；(B)為標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(4)牛奶中鼠傷寒沙門氏菌加標(biāo)回收檢測：利用加標(biāo)回收結(jié)合本發(fā)明設(shè)計的檢測方法實現(xiàn)液態(tài)牛奶樣本中的鼠傷寒沙門氏菌。檢測前需要對樣本進行預(yù)處理。首先取5ml牛奶于10℃，7000g轉(zhuǎn)速下離心10min，棄去上層乳脂，將沉淀用超純水稀釋20倍，靜置后將上清液用過濾器過濾，收集濾液。最后采用本試驗設(shè)計方法檢測牛奶樣本中的食源性致病菌濃度，并與所添加的濃度作對比。

綜上，本發(fā)明涉及一種基于對巰基苯胺修飾金納米棒的食源性致病菌檢測方法。該方法為：以食源性致病菌為研究對象，以巰基苯胺修飾的金納米棒顆粒作為增強基底，食源性致病菌核酸適配體通過強大的靜電吸附作用吸附在巰基苯胺修飾的金納米棒顆粒表面，從而保護金納米棒顆粒在鹽溶液環(huán)境下不發(fā)生聚集現(xiàn)象，然而，當(dāng)核酸適配體互補DNA與食源性致病菌共同存在于檢測溶液中時，由于核酸適配體互補DNA與食源性致病菌競爭性地與核酸適配體發(fā)生特異性結(jié)合，導(dǎo)致適配體構(gòu)象嚴(yán)重變化，進而導(dǎo)致巰基苯胺修飾的金納米棒顆粒在鹽溶液中的聚集差異；通過自主搭建的顯微拉曼光譜系統(tǒng)，測定上述混合溶液拉曼信號，得到不同濃度食源性致病菌存在時巰基苯胺染料的拉曼圖譜，實現(xiàn)對食源性致病菌的定量檢測，并在牛奶實際樣品中進行方法可行性驗證。該檢測方法適用于食品安全、環(huán)境監(jiān)測等技術(shù)領(lǐng)域。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示意性實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 江蘇大學(xué)

<120> 一種基于對巰基苯胺修飾金納米棒的食源性致病菌檢測方法

<130> 一種基于對巰基苯胺修飾金納米棒的食源性致病菌檢測方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caacacgtgc ccaac 15