本發(fā)明屬于煙草制品生物學效應評價技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測口含煙制品對細胞過氧化氫酶酶活力影響的方法。
背景技術(shù)：
隨著人們對健康的關(guān)注越來越高，對煙草產(chǎn)品提出了更高的要求，不但要有較好的口感，而且要盡可能的減少人體的不良感受?？诤瑹熤破繁苊饬藗鹘y(tǒng)卷煙制品燃燒所產(chǎn)生的復雜混合物所帶來的危害，現(xiàn)階段已成為國外煙草公司從傳統(tǒng)卷煙制品轉(zhuǎn)向的新方向之一。根據(jù)產(chǎn)品的組分及形態(tài)特點，口含煙制品分為傳統(tǒng)含煙葉原料的Snus型口含煙制品和不含煙葉原料的新型口含煙制品(如煙草含片)。口含煙研發(fā)人員在產(chǎn)品配方設計初期將不同組份按照不同比例組合調(diào)配，形成具有不同風格的初選配方，再結(jié)合化學評價和感官評價對配方進行不斷篩選調(diào)整形成最終的產(chǎn)品配方。然而初選配方數(shù)量眾多，全部進行感官評價耗時耗力，且感官評價側(cè)重于對產(chǎn)品的風格口感進行篩選，如何利用生物學測試指標對產(chǎn)品初選配方進篩選，以獲得降低人體不良感受的產(chǎn)品配方，目前尚屬探索階段，無統(tǒng)一的標準方法。
機體在遭受各種不利刺激時，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導致組織損傷。過氧化氫(H2O2)是活性氧自由基中的重要一種，過氧化氫酶(CAT)能夠催化過氧化氫分解成氧和水，對其進行測定，可用于產(chǎn)品初選配方的進一步篩選，以獲得降低人體不良感受的產(chǎn)品配方。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種檢測口含煙制品對細胞過氧化氫酶酶活力影響的方法，為電子煙制品的安全性評估提供參考。
本發(fā)明公開一種檢測口含煙制品對細胞過氧化氫酶酶活力影響的方法，包括以下步驟：
(1)受試物的前處理；
(2)人口腔角質(zhì)細胞單細胞懸浮液的制備；
(3)人口腔角質(zhì)細胞單細胞懸浮液的細胞濃度的計算；
(4)人口腔角質(zhì)細胞單細胞懸浮液的細胞接種；
(5)受試物的分組；
(6)受試物檢測劑量的設定；
(7)受試物培養(yǎng)品的制備；
(8)受試物的孵育；
(9)受試物孵育品的收集；
(10)受試物孵育品的裂解離心；
(11)標準曲線的測定；
(12)受試物孵育品的測定；
(13)蛋白濃度測定；
(14)過氧化氫酶酶活力計算。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，上述的方法，包括以下具體步驟：
(1)受試物的前處理：準確稱取1.0g口含煙制品，加入30mL無血清培養(yǎng)基，于37℃下靜置24h，萃取，萃取后先用定性濾紙進行初濾除渣處理，再用0.45μm有機濾膜過濾除菌，得到待測液；
(2)人口腔角質(zhì)細胞單細胞懸浮液的制備：人口腔角質(zhì)細胞復蘇后，接種到細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5vt％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的匯合和形態(tài)情況，待細胞長至90％的匯合率時，移除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用磷酸緩沖液洗兩次，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質(zhì)量：體積；單層孵育約1-2min，用成纖維細胞培養(yǎng)基懸起，形成單細胞懸浮液；
(3)人口腔角質(zhì)細胞單細胞懸浮液的細胞濃度的計算：用血球計數(shù)板計數(shù)法對步驟(2)得到人口腔角質(zhì)細胞單細胞懸浮液的細胞濃度進行計算，計算出每毫升人口腔角質(zhì)細胞單細胞懸浮液的活細胞數(shù)；
(4)人口腔角質(zhì)細胞單細胞懸浮液的細胞接種：將步驟(3)計數(shù)后的人口腔角質(zhì)細胞單細胞懸浮液加入OKM細胞培養(yǎng)基稀釋至2.0×105個/mL，再按接種量為4mL/皿，接種到直徑為60mm細胞培養(yǎng)皿中，將細胞培養(yǎng)板置于37℃、5vt％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h；
(5)受試物的分組：將受試物分為兩組：細胞對照組和檢測樣品組；各組的構(gòu)成為：細胞對照組為OKM細胞生長培養(yǎng)基上種植人口腔角質(zhì)細胞；檢測樣品組為在OKM細胞生長培養(yǎng)基上種植人口腔角質(zhì)細胞并添加受試物；
(6)受試物檢測劑量的設定：將受試物，即電子煙原液分為5個非零劑量：12.5％樣品萃取液、25％樣品萃取液、50％樣品萃取液、75％樣品萃取液、100％樣品萃取液；
(7)受試物培養(yǎng)品的制備：移除步驟(4)中直徑為60mm細胞培養(yǎng)皿內(nèi)的成纖維細胞培養(yǎng)基，再按步驟(5)進行分組，各組的構(gòu)成為：細胞對照組為OKM細胞培養(yǎng)基+人口腔角質(zhì)細胞；檢測樣品組為OKM細胞培養(yǎng)基+人口腔角質(zhì)細胞+受試物，并使檢測樣品組的最終濃度分別為步驟(6)設定的劑量；用OKM細胞培養(yǎng)基將每孔液體體積補足至4mL；
(8)受試物的孵育：將步驟(7)加樣后的直徑為60mm細胞培養(yǎng)皿置于37℃、5vt％CO2培養(yǎng)箱中孵育24h；
(9)受試物孵育品的收集：去除步驟(8)中的培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液洗一遍，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質(zhì)量：體積；單層孵育約1-2min，用成纖維細胞培養(yǎng)液懸起，1000rpm低溫離心10min；
(10)受試物孵育品的裂解離心：收集步驟(9)得到的細胞，加入100μL細胞裂解液，冰浴裂解，裂解后收集細胞，1600rpm低溫離心10min，取上清液待后續(xù)測定；
(11)標準曲線的測定：取0、12.5、25、50、75μL配制好的5mmol/L過氧化氫溶液至1.5mL離心管中，分別加入過氧化氫酶檢測緩沖液稀釋至最后體積為100μL混勻，各取4μL加入96孔板，加入200μL配制好的顯色液，25℃孵育至少15min后酶標儀測定520nm處吸光度；；
(12)受試物孵育品的測定：在不同離心管內(nèi)加入40μL樣品待測液，空白對照組加入40μL過氧化氫酶檢測緩沖液；隨后分別加入10μL的250mmol/L過氧化氫溶液，迅速混勻，25℃反應5min；加入450μL過氧化氫酶反應終止液振蕩混勻終止反應；在塑料離心管內(nèi)加入40μL過氧化氫酶檢測緩沖液，再加入10μL已終止并混勻的上述反應體系，混勻，從中取最終反應體系液體10μL加入96孔板，再加入200μL配制好的顯色工作液。25℃孵育15min后測定A520；
(13)蛋白濃度測定：測定樣品蛋白濃度；
(14)過氧化氫酶酶活力計算：
a.根據(jù)步驟(11)測定的標準溶液吸光度值繪制標準曲線：
A520＝k[過氧化氫微摩爾數(shù)]+b，由標準曲線計算出k和b的值；
b.計算出樣品中殘余的過氧化氫摩爾數(shù)：
殘余過氧化氫微摩爾數(shù)＝(A520-b)/k
c.過氧化氫酶酶活力計算：
[樣品過氧化氫酶酶活力]＝([空白對照殘余過氧化氫微摩爾數(shù)]－[樣品殘余過氧化氫微摩爾數(shù)])×[稀釋倍數(shù)]/(5min×40μL×[蛋白濃度])。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，步驟(5)中所述的OKM細胞為Oral Keratinocyte Medium細胞。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，步驟(10)所述的細胞裂解液購買于碧云天公司，是一種在非變性條件下裂解細胞的裂解液。
本發(fā)明有益效果：
本發(fā)明對口含煙制品對細胞過氧化氫酶酶活力影響進行了綜合研究，確定了口含煙制品的檢測劑量，以及口含煙制品前處理方法，制定了一種適用于檢測口含煙制品對細胞過氧化氫酶酶活力影響的方法。
本發(fā)明對樣品的有效處理、檢測劑量的優(yōu)化設定以及靶細胞的正確選擇，使得本方法能夠準確有效的檢測口含煙制品對細胞過氧化氫酶酶活力影響的方法。
具體實施方式
下面將結(jié)合具體實例對本發(fā)明做詳細描述，但并不限制本發(fā)明。
本發(fā)明針對2種國外市售口含煙制品對人口腔角質(zhì)過氧化氫酶酶活力影響的方法。
(1)受試物的前處理：準確稱取1.0g口含煙制品，加入30mL無血清培養(yǎng)基，于37℃下靜置24h，萃取，萃取后先用定性濾紙進行初濾除渣處理，再用0.45μm有機濾膜過濾除菌，得到待測液；
(2)人口腔角質(zhì)細胞單細胞懸浮液的制備：人口腔角質(zhì)細胞復蘇后，接種到細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5vt％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的匯合和形態(tài)情況，待細胞長至90％的匯合率時，移除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用磷酸緩沖液洗兩次，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質(zhì)量：體積；單層孵育約1-2min，用成纖維成纖維細胞培養(yǎng)基懸起，形成單細胞懸浮液；
(3)人口腔角質(zhì)細胞單細胞懸浮液的細胞濃度的計算：用血球計數(shù)板計數(shù)法對步驟(2)得到人口腔角質(zhì)細胞單細胞懸浮液的細胞濃度進行計算，計算出每毫升人口腔角質(zhì)細胞單細胞懸浮液的活細胞數(shù)；
(4)人口腔角質(zhì)細胞單細胞懸浮液的細胞接種：將步驟(3)計數(shù)后的人口腔角質(zhì)細胞單細胞懸浮液加入OKM細胞培養(yǎng)基稀釋至2.0×105個/mL，再按接種量為4mL/皿，接種到60mm細胞培養(yǎng)皿中，將細胞培養(yǎng)板置于37℃、5vt％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h；
(5)受試物的分組：將受試物分為兩組：細胞對照組和檢測樣品組；各組的構(gòu)成為：細胞對照組為OKM細胞生長培養(yǎng)基上種植人口腔角質(zhì)細胞；檢測樣品組為在OKM細胞生長培養(yǎng)基上種植人口腔角質(zhì)細胞并添加受試物；
(6)受試物檢測劑量的設定：將受試物，即電子煙原液分為5個非零劑量：12.5％樣品萃取液、25％樣品萃取液、50％樣品萃取液、75％樣品萃取液、100％樣品萃取液；
(7)受試物培養(yǎng)品的制備：移除步驟(4)中直徑為60mm細胞培養(yǎng)皿內(nèi)的成纖維細胞培養(yǎng)基，再按步驟(5)進行分組，各組的構(gòu)成為：細胞對照組為OKM細胞培養(yǎng)基+人口腔角質(zhì)細胞；檢測樣品組為OKM細胞培養(yǎng)基+人口腔角質(zhì)細胞+受試物，并使檢測樣品組的最終濃度分別為步驟(6)設定的劑量；用OKM細胞培養(yǎng)基將每孔液體體積補足至4mL；
(8)受試物的孵育：將步驟(7)加樣后的直徑為60mm細胞培養(yǎng)皿置于37℃、5vt％CO2培養(yǎng)箱中孵育24h；
(9)受試物孵育品的收集：去除步驟(8)中的培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液洗一遍，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質(zhì)量：體積；單層孵育約1-2min，用成纖維細胞培養(yǎng)液懸起，1000rpm低溫離心10min；
(10)受試物孵育品的裂解離心：收集步驟(9)得到的細胞，加入100μL細胞裂解液，冰浴裂解，裂解后收集細胞，1600rpm低溫離心10min，取上清液待后續(xù)測定；
(11)標準曲線的測定：取0、12.5、25、50、75μL配制好的5mmol/L過氧化氫溶液至1.5mL離心管中，分別加入過氧化氫酶檢測緩沖液稀釋至最后體積為100μL混勻，各取4μL加入96孔板，加入200μL配制好的顯色液，25℃孵育至少15min后酶標儀測定520nm處吸光度；；
(12)受試物孵育品的測定：在不同離心管內(nèi)加入40μL樣品待測液，空白對照組加入40μL過氧化氫酶檢測緩沖液；隨后分別加入10μL的250mmol/L過氧化氫溶液，迅速混勻，25℃反應5min；加入450μL過氧化氫酶反應終止液振蕩混勻終止反應；在塑料離心管內(nèi)加入40μL過氧化氫酶檢測緩沖液，再加入10μL已終止并混勻的上述反應體系，混勻，從中取最終反應體系液體10μL加入96孔板，再加入200μL配制好的顯色工作液。25℃孵育15min后測定520nm處的吸光度A520；
(13)蛋白濃度測定：測定樣品蛋白濃度；
(14)過氧化氫酶酶活力計算：
a.根據(jù)步驟(11)測定的標準溶液吸光度值繪制標準曲線：
A520＝k[過氧化氫微摩爾數(shù)]+b，由標準曲線計算出k和b的值；
b.計算出樣品中殘余的過氧化氫摩爾數(shù)：
殘余過氧化氫微摩爾數(shù)＝(A520-b)/k
c.過氧化氫酶酶活力計算：
[樣品過氧化氫酶酶活力]＝([空白對照殘余過氧化氫微摩爾數(shù)]－[樣品殘余過氧化氫微摩爾數(shù)])×[稀釋倍數(shù)]/(5min×40μL×[蛋白濃度])。
表1 2種口含煙制品對人成纖維細胞HOK過氧化氫酶酶活性的影響
由試驗結(jié)果可以看出，在本發(fā)明方法給出的樣品處理方法、檢測劑量條件下，樣品1#、2#在檢測劑量范圍內(nèi)對HOK細胞的過氧化氫酶酶活性存在影響，且有劑量效應關(guān)系，與0劑量組相比存在顯著差異(p<0.05)；樣品1#在檢測劑量范圍內(nèi)與樣品2#相比存在顯著差異(p<0.05)；以上結(jié)果顯示，不同的口含煙對HOK細胞的過氧化氫酶酶活性的影響存在差異。