本發(fā)明涉及抗體的檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及重組Neu蛋白檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
副豬嗜血桿菌?。℉P）能引起豬的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、漿膜炎、腦膜炎，常在仔豬保育階段發(fā)病，死亡率可達(dá)50%。隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模的迅速擴(kuò)大和養(yǎng)豬模式的改變，近幾年本病流行趨勢(shì)日趨嚴(yán)重，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最為嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病之一。因此，快速、準(zhǔn)確地診斷該病以便采取相應(yīng)的措施，是成功預(yù)防和控制本病的關(guān)鍵。
目前，基層實(shí)驗(yàn)室對(duì)本病的診斷任停留在流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀和病理變化分析，結(jié)合細(xì)菌學(xué)診斷。然而，副豬嗜血桿菌與其他引起豬呼吸道疾病的臨床癥狀非常相似，易混淆。已證實(shí)副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道的常在菌，但臨床上進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定時(shí)，其分離率較低，主要是該菌的分離培養(yǎng)易受抗生素或化學(xué)治療劑等因素的影響，營(yíng)養(yǎng)條件要求高，保存時(shí)間短。因此，傳統(tǒng)的診斷技術(shù)已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代豬病發(fā)展的需求，應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)及免疫學(xué)技術(shù)，找到一種檢測(cè)或診斷副豬嗜血桿菌的候選抗原，建立一種快速、簡(jiǎn)便的診斷方法具有十分重要的意義。
現(xiàn)階段，在眾多副豬嗜血桿菌病的檢測(cè)方法中，ELISA檢測(cè)方法是應(yīng)用最廣、商品化最為成熟的一種檢測(cè)方法；然而，目前市場(chǎng)僅有美國(guó)的Synbiocits公司生產(chǎn)檢測(cè)本病的ELISA試劑盒，國(guó)內(nèi)尚未生產(chǎn)檢測(cè)本病的商品診斷試劑盒，該試劑盒采用HPS全菌作為包被抗原，存在潛在的散毒危險(xiǎn)，且高昂的檢測(cè)費(fèi)用，每個(gè)血清樣品檢測(cè)費(fèi)約60 RMB，使得眾多養(yǎng)殖企業(yè)望而卻步；另外，由于副豬嗜血桿菌血清型較多，各血清之間缺乏交叉保護(hù)，且各地流行菌株存在較大差異，若使用傳統(tǒng)ELISA診斷方法包被細(xì)菌全菌，則該方法只對(duì)相同血清型細(xì)菌有很強(qiáng)診斷性，準(zhǔn)確度很強(qiáng)，但對(duì)不同血清型菌株則診斷性明顯降低，甚至出現(xiàn)大量假陰性和假陽(yáng)性。因此，豬病檢測(cè)市場(chǎng)急需經(jīng)濟(jì)、實(shí)效，且適用于大批次樣品的商品化檢測(cè)試劑盒。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：現(xiàn)有副豬嗜血桿菌病的ELISA檢測(cè)方法采用HPS全菌作為包被抗原，存在潛在的散毒危險(xiǎn)，且高昂的檢測(cè)費(fèi)用；此外，副豬嗜血桿菌血清型較多，各血清之間缺乏交叉保護(hù)，且各地流行菌株存在較大差異，使用傳統(tǒng)ELISA診斷方法包被細(xì)菌全菌，只對(duì)相同血清型細(xì)菌有很強(qiáng)診斷性，對(duì)不同血清型菌株則診斷性明顯降低，容易出現(xiàn)大量假陰性和假陽(yáng)性。
針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一種重組Neu蛋白檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，其特征在于：采用副豬嗜血桿菌神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，Neu ）蛋白作為包被抗原。
對(duì)應(yīng)于上述重組Neu蛋白檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，其重組Neu蛋白檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于：采用副豬嗜血桿菌神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，Neu ）蛋白作為包被抗原。
作為進(jìn)一步說(shuō)明，所述Neu蛋白的表達(dá)方式如下：
S1：以HPS 5型毒株為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得Neu全基因，其Neu全基因編碼為：NeuFP: ACGAATTCATGAAAAGAAGATTATCTAA，NeuRP: GCGTCGACTTACCAAGTATAACTGATATCTAC，并將其克隆至pMD18-T載體；
S2：再以pMD18-Neu基因?yàn)槟０?，重新設(shè)計(jì)引物，其引物編碼為：NeuFp: GCGAATTCATGGGTATTGCAGCAACCA，NeuRP: GCGTCGACTTACCAAGTATAACTGATATCTAC，擴(kuò)增得到HPS Neu蛋白的部分編碼區(qū)，將其克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，構(gòu)建得到重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-Neu。
S3：誘導(dǎo)培養(yǎng)500ml pET-Neu的轉(zhuǎn)化菌Rosetta(DE3)，離心收菌、超聲波裂解，并對(duì)包涵體進(jìn)行提取。
S4：用SDS-PAGE對(duì)表達(dá)的Neu重組蛋白進(jìn)行純度檢測(cè)，重組Neu蛋白的含量以Bradford檢測(cè)法采用分光光度計(jì)測(cè)定。
作為進(jìn)一步說(shuō)明，所述間接ELISA操作程序如下：
S1：用0.05 mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液將制備的抗原稀釋至25ng/100μl至400ng/100μl，包被酶標(biāo)板， 每孔100uL，輕振酶標(biāo)板，使抗原在孔底均勻鋪開(kāi)，37℃作用2 h，轉(zhuǎn)入4℃過(guò)夜吸附；
S2：次日用PBST洗滌液洗滌3～5次，每次5 min，拍干；
S3：然后用0.15% BSA封閉，每孔200uL，37 ℃作用1h，再用洗滌液洗板3～5次；
S4：加入用PBS稀釋的待檢血清，每孔100uL，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照孔，37 ℃作用1h，洗板同上；
S5：加入稀釋的SPA-HRP，23 ℃作用1h，洗板同上；
S6：加入新鮮配制的OPD-H2O2 底物顯色液，37 ℃避光顯色20min；
S7：加入2mol/LH2SO4 終止液，每孔50uL終止反應(yīng)；
S8：在酶標(biāo)免疫測(cè)定儀上測(cè)定490nm波長(zhǎng)下的OD值。
作為進(jìn)一步優(yōu)化，所述間接ELISA操作程序如下：
S1：用0.05 mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液將制備的包被抗原稀釋至25ng/100μl至400ng/100μl，包被酶標(biāo)板， 每孔100uL，輕振酶標(biāo)板，使抗原在孔底均勻鋪開(kāi)，37℃作用2 h，轉(zhuǎn)入4℃過(guò)夜吸附；
S2：次日用PBST洗滌液洗滌3～5次，每次5 min，拍干；
S3：然后用0.15% BSA封閉，每孔200uL，37 ℃作用1h，再用洗滌液洗板3～5次；
S4：封閉后加樣，每孔加入用PBS稀釋的待檢血清100uL，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照孔，37 ℃作用1h，洗板同上；
S5：加入稀釋的SPA-HRP，23 ℃作用1h，洗板同上；
S6：加入新鮮配制的OPD-H2O2 底物顯色液，37 ℃避光顯色20min；
S7：加入2mol/LH2SO4 終止液，每孔50uL終止反應(yīng)；
S8：在酶標(biāo)免疫測(cè)定儀上測(cè)定450nm波長(zhǎng)下的OD值。
作為進(jìn)一步說(shuō)明，所述血清的稀釋比例為：1: 10至1:160。
作為進(jìn)一步優(yōu)化，所述Neu蛋白包被濃度為：100ng/100μl。
作為進(jìn)一步優(yōu)化，所述血清的稀釋比例為1:160。
有益效果：通過(guò)上述重組Neu蛋白檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，采用重組Neu蛋白作為包被，由于其Neu蛋白是所有血清型菌株都含有的重要蛋白，因此可對(duì)各血清型菌株進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確度會(huì)有明顯提高，能較好的避免出現(xiàn)大量假陰性和假陽(yáng)性；同時(shí)，通過(guò)采用重組Neu蛋白作為包被，能有效避免副豬嗜血桿菌病的ELISA檢測(cè)存在散毒危險(xiǎn)，并較大程度的降低檢測(cè)成本。
此外，由于包被抗原的純度和濃度是影響間接ELISA檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵因素，本發(fā)明中將制備的抗原用0.05mol/L PH9.6碳酸鹽緩沖液包被，能防止液體培養(yǎng)基中豐富的蛋白成分與待檢血清產(chǎn)生非特異性結(jié)合，造成結(jié)果的不準(zhǔn)確；同時(shí)，并確定了抗原包被最佳濃度，提高了反應(yīng)的靈敏度。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明內(nèi)容，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述；顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
一種重組Neu蛋白檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，采用副豬嗜血桿菌神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，Neu ）蛋白作為包被抗原；
其Neu 蛋白的表達(dá)方式如下：
S1：以HPS 5型毒株為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得Neu全基因，其Neu全基因編碼為：NeuFP: ACGAATTCATGAAAAGAAGATTATCTAA，NeuRP: GCGTCGACTTACCAAGTATAACTGATATCTAC，并將其克隆至pMD18-T載體；
S2：再以pMD18-Neu基因?yàn)槟０?，重新設(shè)計(jì)引物，其引物編碼為：NeuFp: GCGAATTCATGGGTATTGCAGCAACCA，NeuRP: GCGTCGACTTACCAAGTATAACTGATATCTAC，擴(kuò)增得到HPS Neu蛋白的部分編碼區(qū)，將其克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，構(gòu)建得到重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-Neu。
S3：誘導(dǎo)培養(yǎng)500ml pET-Neu的轉(zhuǎn)化菌Rosetta(DE3)，離心收菌、超聲波裂解，并對(duì)包涵體進(jìn)行提取。
S4：用SDS-PAGE對(duì)表達(dá)的Neu重組蛋白進(jìn)行純度檢測(cè)，重組Neu蛋白的含量以Bradford檢測(cè)法采用分光光度計(jì)測(cè)定。
實(shí)施例一：
其重組Neu蛋白檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法的具體步驟如下：
S1：用0.05 mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液將制備的抗原稀釋至100ng/100μl，包被酶標(biāo)板， 每孔100uL，輕振酶標(biāo)板，使抗原在孔底均勻鋪開(kāi)，37℃作用2 h，轉(zhuǎn)入4℃過(guò)夜吸附；
S2：次日用PBST洗滌液洗滌3～5次，每次5 min，拍干；
S3：然后用0.15% BSA封閉，每孔200uL，37 ℃作用1h，再用洗滌液洗板3～5次；
S4：加入用PBS稀釋的待檢血清，每孔100uL，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照孔，37 ℃作用1h，洗板同上；
S5：加入稀釋的SPA-HRP，23 ℃作用1h，洗板同上；
S6：加入新鮮配制的OPD-H2O2 底物顯色液，37 ℃避光顯色20min；
S7：加入2mol/LH2SO4 終止液，每孔50uL終止反應(yīng)；
S8：在酶標(biāo)免疫測(cè)定儀上測(cè)定490nm波長(zhǎng)下的OD值。
實(shí)施例二：
其重組Neu蛋白檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法的具體步驟如下：
S1：用0.05 mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液將制備的抗原稀釋至25ng/100μl，包被酶標(biāo)板， 每孔100uL，輕振酶標(biāo)板，使抗原在孔底均勻鋪開(kāi)，37℃作用2 h，轉(zhuǎn)入4℃過(guò)夜吸附；
S2：次日用PBST洗滌液洗滌3～5次，每次5 min，拍干；
S3：然后用0.15% BSA封閉，每孔200uL，37 ℃作用1h，再用洗滌液洗板3～5次；
S4：封閉后加樣，每孔加入用PBS稀釋的待檢血清100uL，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照孔，37 ℃作用1h，洗板同上；
S5：加入稀釋的SPA-HRP，23 ℃作用1h，洗板同上；
S6：加入新鮮配制的OPD-H2O2 底物顯色液，37 ℃避光顯色20min；
S7：加入2mol/LH2SO4 終止液，每孔50uL終止反應(yīng)；
S8：在酶標(biāo)免疫測(cè)定儀上測(cè)定450nm波長(zhǎng)下的OD值。
實(shí)施例三：
其重組Neu蛋白檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法的具體步驟如下：
S1：用0.05 mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液將制備的抗原稀釋至50ng/100μl，包被酶標(biāo)板， 每孔100uL，輕振酶標(biāo)板，使抗原在孔底均勻鋪開(kāi)，37℃作用2 h，轉(zhuǎn)入4℃過(guò)夜吸附；
S2：次日用PBST洗滌液洗滌3～5次，每次5 min，拍干；
S3：然后用0.15% BSA封閉，每孔200uL，37 ℃作用1h，再用洗滌液洗板3～5次；
S4：封閉后加樣，每孔加入用PBS稀釋的待檢血清100uL，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照孔，37 ℃作用1h，洗板同上；
S5：加入稀釋的SPA-HRP，23 ℃作用1h，洗板同上；
S6：加入新鮮配制的OPD-H2O2 底物顯色液，37 ℃避光顯色20min；
S7：加入2mol/LH2SO4 終止液，每孔50uL終止反應(yīng)；
S8：在酶標(biāo)免疫測(cè)定儀上測(cè)定450nm波長(zhǎng)下的OD值。
實(shí)施例四：
其重組Neu蛋白檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法的具體步驟如下：
S1：用0.05 mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液將制備的抗原稀釋至100ng/100μl，包被酶標(biāo)板， 每孔100uL，輕振酶標(biāo)板，使抗原在孔底均勻鋪開(kāi)，37℃作用2 h，轉(zhuǎn)入4℃過(guò)夜吸附；
S2：次日用PBST洗滌液洗滌3～5次，每次5 min，拍干；
S3：然后用0.15% BSA封閉，每孔200uL，37 ℃作用1h，再用洗滌液洗板3～5次；
S4：封閉后加樣，每孔加入用PBS稀釋的待檢血清100uL，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照孔，37 ℃作用1h，洗板同上；
S5：加入稀釋的SPA-HRP，23 ℃作用1h，洗板同上；
S6：加入新鮮配制的OPD-H2O2 底物顯色液，37 ℃避光顯色20min；
S7：加入2mol/LH2SO4 終止液，每孔50uL終止反應(yīng)；
S8：在酶標(biāo)免疫測(cè)定儀上測(cè)定450nm波長(zhǎng)下的OD值。
實(shí)施例五：
其重組Neu蛋白檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法的具體步驟如下：
S1：用0.05 mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液將制備的抗原稀釋至200ng/100μl，包被酶標(biāo)板， 每孔100uL，輕振酶標(biāo)板，使抗原在孔底均勻鋪開(kāi)，37℃作用2 h，轉(zhuǎn)入4℃過(guò)夜吸附；
S2：次日用PBST洗滌液洗滌3～5次，每次5 min，拍干；
S3：然后用0.15% BSA封閉，每孔200uL，37 ℃作用1h，再用洗滌液洗板3～5次；
S4：封閉后加樣，每孔加入用PBS稀釋的待檢血清100uL，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照孔，37 ℃作用1h，洗板同上；
S5：加入稀釋的SPA-HRP，23 ℃作用1h，洗板同上；
S6：加入新鮮配制的OPD-H2O2 底物顯色液，37 ℃避光顯色20min；
S7：加入2mol/LH2SO4 終止液，每孔50uL終止反應(yīng)；
S8：在酶標(biāo)免疫測(cè)定儀上測(cè)定450nm波長(zhǎng)下的OD值。
實(shí)施例六：
其重組Neu蛋白檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法的具體步驟如下：
S1：用0.05 mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液將制備的抗原稀釋至400ng/100μl，包被酶標(biāo)板， 每孔100uL，輕振酶標(biāo)板，使抗原在孔底均勻鋪開(kāi)，37℃作用2 h，轉(zhuǎn)入4℃過(guò)夜吸附；
S2：次日用PBST洗滌液洗滌3～5次，每次5 min，拍干；
S3：然后用0.15% BSA封閉，每孔200uL，37 ℃作用1h，再用洗滌液洗板3～5次；
S4：封閉后加樣，每孔加入用PBS稀釋的待檢血清100uL，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照孔，37 ℃作用1h，洗板同上；
S5：加入稀釋的SPA-HRP，23 ℃作用1h，洗板同上；
S6：加入新鮮配制的OPD-H2O2 底物顯色液，37 ℃避光顯色20min；
S7：加入2mol/LH2SO4 終止液，每孔50uL終止反應(yīng)；
S8：在酶標(biāo)免疫測(cè)定儀上測(cè)定450nm波長(zhǎng)下的OD值。
通過(guò)上述實(shí)施例一至實(shí)施例六所建立的間接ELISA方法進(jìn)行試驗(yàn)，其試驗(yàn)結(jié)果如下：
1、通過(guò)測(cè)定490nm波長(zhǎng)下的OD值或測(cè)定450nm波長(zhǎng)下的OD值，結(jié)果表明：在450nm波長(zhǎng)下具有較佳的觀察效果。
2、隨機(jī)取用20份豬HP陰性血清樣品，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原則，20份陰性樣品平均OD450值(X)加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差(S)即初步作為陰陽(yáng)性的臨界值，當(dāng)樣本的OD450nm大于等于這個(gè)數(shù)值時(shí)，可判為陽(yáng)性，反之判為陰性；結(jié)果表明：X平均值= 0.2572，標(biāo)準(zhǔn)差S=0.0412，即當(dāng)OD450nm≥0.3808時(shí)判為陽(yáng)性，反之則為陰性。
3、通過(guò)上述實(shí)施例二至實(shí)施例六中不同的抗原包被稀釋濃度的測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：最佳抗原包被濃度為100ng/100μl。
4、取HP抗體陽(yáng)性血清和抗體陰性血清，將HP陽(yáng)性血清作1: 10，1: 20，1: 40，1:80，1:160稀釋后，分別加入到酶標(biāo)板的1，3，5，7，9列，HP陰性血清作同樣處理加到酶標(biāo)板的2，4，6， 8，10列，進(jìn)行方陣滴定；兔抗豬酶標(biāo)二抗以工作濃度進(jìn)行稀釋；檢測(cè)結(jié)果表明：待檢血清的最佳稀釋度為1:160。
根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)其間接ELISA方法進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化，其優(yōu)化的重組Neu蛋白檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法的具體步驟如下：
S1：將用包被液稀釋的抗原加入酶標(biāo)板內(nèi)，100ng/100μl每孔, 37℃作用1小時(shí)后，置4℃冰箱24h。
S2：棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗3次，每次3分鐘，最后用吸水紙拍干。
S3：各孔加入封閉液（50g/L脫脂奶粉溶液）200μl,37℃作用2小時(shí)。
S4：棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗2次，每次3分鐘，最后用吸水紙拍干。
S5：加入待檢血清，將待檢血清用E.coli裂解上清稀釋，室溫感作30分鐘，再以保溫液作適當(dāng)稀釋，血清濃度為1:160，每孔100μl，37℃作用1小時(shí)。
S6：棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗2次，每次3分鐘，最后用吸水紙拍干。
S7：加入酶標(biāo)二抗，用保溫液將酶標(biāo)二抗按工作濃度稀釋（1:15000），每孔100ul，37℃作用1h。
S8：棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗2次，每次3分鐘，最后用吸水紙拍干。
S9：加底物，每孔100u1，37℃閉光作用10分鐘。
S10：每孔加入50ul終止液終止反應(yīng)并用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值。
S11：判定結(jié)果，當(dāng)OD450nm≥0.3808時(shí)判為陽(yáng)性，反之則為陰性。