本發(fā)明涉及體外診斷免疫檢測領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種化學(xué)發(fā)光免疫檢測抗蛋白酶3抗體IgG試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
蛋白酶3（Proteinase 3，PR3）是中性粒細(xì)胞胞漿嗜天青顆粒中的一種絲氨酸蛋白酶，分子量約為29KDa 的糖蛋白。PR3能降解多種細(xì)胞外基質(zhì)如彈性蛋白、血紅蛋白、IV型膠原等多種組織成分。蛋白酶3通過組織蛋白酶G促進(jìn)血小板活化，并使C1抑制劑失活?？怪行粤＜?xì)胞胞漿抗體（Antineut—rophiIcytoplasmic antibody，ANCA）是韋格納肉芽腫（Wegener’s granulomatosis，WG）患者的血清標(biāo)志物，尤其是抗蛋白酶3抗體。
WG是一種特殊類型的壞死性肉芽腫性血管炎。抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體是對WG最有診斷意義的自身抗體。過去WG的診斷主要是根據(jù)典型的臨床表現(xiàn)和病史，但有些患者，尤其是限局性的患者很難診斷，病檢是確診WG的重要手段。但一次或單部位病檢陰性并不能排除WG。目前的研究認(rèn)為大部分WG患者的ANCA特異性靶抗原是PR3，抗PR3抗體與WG的診斷和疾病活動密切相關(guān)。胞漿型ANCA和抗PR3抗體對WG診斷意義有高度的敏感性和特異性。國外報道在活檢證實為WG的患者中，抗PR3抗體特異性為90％以上。敏感性是與疾病的活動性有關(guān)。通?？筆R3抗體滴度與疾病活動一致，活動性WG患者在病變尚未影響到呼吸系統(tǒng)時抗PR3抗體敏感性是65%，當(dāng)患者出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)、腎臟損害時其靈敏度達(dá)90%以上。活動期滴度較高，部分緩解期滴度很低，完全緩解的患者多數(shù)測不到。緩解期抗PR3抗體滴度的升高可能預(yù)示著復(fù)發(fā)，并且有助于將感染和復(fù)發(fā)區(qū)分開。
臨床檢測抗蛋白酶3抗體IgG的主要方法為酶聯(lián)免疫吸附法，但該方法存在著下述的不足之處：
（1） 使用12×8 型、6×8 型、8×12 型或整板型96 孔專用微孔板作為抗原包被用具和反應(yīng)容器，在使用時只能分成12 批次、6 批次、8 批次或整板一次使用，無法進(jìn)行獨立的、單人份的檢測；
（2） 定量測定所用的試劑種類較多，每一種檢測試劑都要用試劑瓶來盛裝，并且每使用一種試劑時都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，加注試劑的操作也極為繁瑣；
（3） 缺少對檢測信息的相應(yīng)標(biāo)注，只能通過查看試劑盒外包裝盒的標(biāo)識才能了解或知悉檢測試劑的生產(chǎn)批號及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測過程中不受控，具有很大的隨意性；
（4） 檢測試劑在檢測過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；
（5） 檢測過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復(fù)雜，容易發(fā)生操作差錯，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度較差；
（6） 在檢測項目成套試劑的數(shù)量配置及使用上均為項目數(shù)×48/96 人份，如果需要檢測10 個項目，則試劑的配置及使用數(shù)須為10×48/96 人份，如果只有一份樣本需要檢測10 個不同的項目，也需要配置10×48/96 人份的試劑，存在著不夠經(jīng)濟(jì)合理的缺點。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
目前抗蛋白酶3抗體IgG檢測技術(shù)存在以下缺點：檢測成本高、檢測靈敏度低、檢測線性范圍窄、重現(xiàn)性低、不能定量、操作復(fù)雜等。
本發(fā)明正是為了克服以上所述缺點，公開了一種檢測成本低、靈敏度高、檢測線性范圍廣、重現(xiàn)性高、可以定量、操作簡單的抗蛋白酶3抗體IgG試劑盒及其制備方法。本發(fā)明首先制備化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，主要包括：蛋白酶3抗原包被的磁顆粒、鼠抗人IgG單克隆抗體包被的吖啶酯以及抗蛋白酶3抗體IgG定標(biāo)品；然后利用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對定標(biāo)品進(jìn)行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)置于電腦軟件，測試實際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計算樣本濃度；最后對抗蛋白酶3抗體IgG全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行性能（靈敏度、線性、精密度、干擾性）的評價。
本發(fā)明與目前技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點：
1、本發(fā)明選擇吖啶酯作為標(biāo)記材料，并應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，該發(fā)光體系為直接化學(xué)發(fā)光，與傳統(tǒng)的酶促化學(xué)發(fā)光相比，該反應(yīng)不需要酶的參與，更加節(jié)約成本；
2、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測靈敏度高，能夠達(dá)到1AU/mL，相比其它的抗蛋白酶3抗體IgG檢測方法靈敏度至少提高了10倍；
3、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)線性范圍寬，能達(dá)到3-400AU/mL，其它的抗蛋白酶3抗體IgG化學(xué)發(fā)檢測方法的檢線性范圍為20-135AU/mL；
4、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)重復(fù)性高，批內(nèi)及批間差均在5%以內(nèi)，這是其它化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)難以達(dá)到的；
5、本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實現(xiàn)樣本的定量，通過內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線到測試軟件，只需測試樣本就可直接得到樣本的濃度值；
6、本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實現(xiàn)全自動化，試劑及樣本的添加全有儀器完成，操作更加簡便，減少了人為的誤差。
附圖說明
圖1為實施例3得到的抗蛋白酶3抗體IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施方式
實施例1：抗蛋白酶3抗體IgG化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒制備方法
（1）蛋白酶3抗原包被的納米磁珠制備：
取50mg羧基化的磁微粒（粒徑為0.05-1um）懸浮液，磁分離去上清，用0.02 M，pH為5.5 MES緩沖液重懸，加入0.5-2mL新配置的10 mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入3-5 mg 蛋白酶3抗原，室溫下混懸2-10 h，磁分離，去除上清，用含2% BSA 的0.1 M pH為8.0的Tris緩沖液重懸到1mg/mL，得到蛋白酶3抗原包被的磁顆粒，每瓶5mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
（2）鼠抗人IgG單克隆抗體標(biāo)記的吖啶酯的制備：
取50 uL 25mg/mL的鼠抗人IgG單克隆抗體，加入150 uL 0.1-0.2 M pH 9.0-9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入1-2 uL 5 mg/mL的吖啶酯混勻，室溫下避光反應(yīng)，1-2 h后取出，用2 mL的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進(jìn)行處理，最后加入得到的鼠抗人IgG單克隆抗體標(biāo)記的吖啶酯溶液，收集離心管中的液體至保存管得到鼠抗人IgG單克隆抗體標(biāo)記的吖啶酯，每瓶5 mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
（3）抗蛋白酶3抗體IgG定標(biāo)品的制備：
用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）將抗蛋白酶3抗體IgG配置成濃度為0 AU/mL、5 AU/mL、20 AU/mL、50AU/mL、90AU/mL、165 AU/mL，每瓶0.5 mL分裝凍干，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
(4)化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液的配制：
量取1.0升純化水，依次加入80uL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的雙氧水(H2O2)、1.0克疊氮化鈉、1.5克吐溫20，搖勻后避光存放。
(5)化學(xué)發(fā)光激發(fā)液的配制：
量取1.0升純化水，依次加入0.6克氫氧化鈉、0.5克PC300、0.5g疊氮化鈉、1.5克Triton 405，搖勻后避光存放。
實施例2：抗蛋白酶3抗體IgG化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法：
本發(fā)明以全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為檢測工具，本發(fā)明的方法學(xué)模式為間接法，即儀器依次加入5uL的樣品、95uL樣本稀釋液、50 uL的蛋白酶3抗原包被的磁顆粒反應(yīng)10 min后，進(jìn)行磁分離。加入100uL的鼠抗人IgG單克隆抗體包被的吖啶酯，反應(yīng)10 min后，進(jìn)行磁分離，儀器將反應(yīng)混合物送入暗室，依次加入100uL化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液、200uL化學(xué)發(fā)光激發(fā)液進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，最后記錄發(fā)光強度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出被測樣品的 抗蛋白酶3抗體IgG含量。
實施例3：抗蛋白酶3抗體IgG化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒性能評價
檢測曲線見附圖1。
靈敏度的檢測：
參照CLSI EP17-A 文件推薦實驗方案，計算抗蛋白酶3抗體IgG化學(xué)發(fā)光免疫層析試劑盒的靈敏度，求得的靈敏度為1AU/ mL。
線性的檢測：
對濃度為5 AU /mL、20 AU /mL、50 AU /mL、90 AU /mL、165 AU /mL標(biāo)準(zhǔn)品做線性分析，計算線性相關(guān)系數(shù)，r=0.9996，另外，該試劑盒對抗蛋白酶3抗體IgG樣品檢測的線性范圍為3-300AU /mL。
精密度測定：
取濃度為2 AU /mL及100 AU mL兩個抗蛋白酶3抗體IgG樣品，每個樣本每個濃度各做3個平行，用三批試劑盒進(jìn)行檢測，計算試劑盒批內(nèi)及批間差，結(jié)果表明該試劑盒批內(nèi)及批間差均小于5%。
干擾性實驗：
取混合血清分別添加干擾物包括： 結(jié)合膽紅素、游離膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、甘油酯，添加比例按照 1: 20 進(jìn)行，分別測定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測值，計算二者之間的偏差，以 ±10%為可接受范圍。結(jié)果表明，干擾性均達(dá)到 NCCLS 的文件標(biāo)準(zhǔn)，可用于臨床實驗室維生素 D 狀況的準(zhǔn)確評估。
實施例4:抗蛋白酶3抗體IgG化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的靈敏度對比實驗
分別用化學(xué)發(fā)光檢測方法和傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法對濃度為0 AU /mL的校準(zhǔn)品或樣本稀釋液為樣本進(jìn)行檢測，重復(fù)測定20次，得出20次測量結(jié)果的RLU值（相對發(fā)光值），計算其平均值（M）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），得出M-2SD，將該發(fā)光值代入校準(zhǔn)曲線計算得到相應(yīng)的濃度值。采用化學(xué)發(fā)光檢測方法得到的濃度值為1.0 AU /ml，相對于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法最低檢測限8.2 AU /ml，提高了約8倍。