本發(fā)明涉及一種借助于生物特有的結(jié)合方法來測定或分析材料的試劑盒及其測定方法，特別是涉及一種免疫檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
：磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)是一種細(xì)胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白(heparansuLfateproteoglycan，HSPG)，GPG3在肝癌組織中高表達(dá)，而在正常肝組織不表達(dá)。肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellarcarcinoma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，大多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期。HCC在我國發(fā)病率高，死亡率亦高，嚴(yán)重危害廣大人民身體健康，因此值得高度重視和深入研究。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)是一種新的肝細(xì)胞癌的癌胚抗原，GPc3基因位于人染色體x26。1，長900kb，5’端朝向端粒區(qū)，3’端朝向中心粒區(qū)，由8個(gè)外顯子組成，其5’端上游153kb和3’下游200kb以內(nèi)的區(qū)域均未發(fā)現(xiàn)其它基因，5’端上游2ld)為最小啟動(dòng)子序列，啟動(dòng)子區(qū)有許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括6個(gè)SP1結(jié)構(gòu)、7個(gè)AP2結(jié)構(gòu)和2個(gè)CAAT盒。但無TATA盒，產(chǎn)生單一2.3kb的轉(zhuǎn)錄子，包括197nt的5非翻譯區(qū)，1740bp的開放閱讀框，編碼580個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為66kD。GPC3基因編碼的蛋白屬于硫酸已酰肝素蛋白聚糖(heparansulfateproteoglycans，HSPGs)，通過糖基磷脂肽肌錨蛋白(glyeosyl-phosphatidyrlinositolanchor，CPI)錨定在細(xì)胞表面，可結(jié)合肝素結(jié)合型蛋白如生長因子，為細(xì)胞外基質(zhì)成分，調(diào)控著細(xì)胞生長、繁殖、分化、黏附和遷移等行為，還可能涉及到抑制或調(diào)節(jié)大部分中胚層組織和器官的生長。目前在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)glypican家族6個(gè)成員：glypicanl～6。其共同點(diǎn)有：①蛋白質(zhì)分子量相近；②富含半胱氨酸，都位于13個(gè)保守位點(diǎn)；③無跨膜區(qū)，但在C末端，N末端都有一個(gè)引導(dǎo)肽樣結(jié)構(gòu)，C末端還有一個(gè)糖基化結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在已證實(shí)glypieard基因是過度生長和畸變綜合征(simpsongolabibehmelsyndrome，SGBS)的致病基因。SGBS綜合征主要表現(xiàn)為產(chǎn)前，產(chǎn)后胎兒過度生長伴有多臟器和骨骼發(fā)育異常，男性發(fā)病者身高可達(dá)195cm，多有粗糙面容，上腭裂特征性表現(xiàn)，其他表現(xiàn)有先天性房(室)間隔缺損、腎腫大和異常、隱睪、尿道下裂、疝、脊柱和肋骨異常、并指(趾)及6指畸形等。1997年Hsu等應(yīng)用DDRT—PCR技術(shù)在肝癌組織中克隆了一全長GPC3的eDNA。Northernblot雜交發(fā)現(xiàn)191例HCC中，143例(74.8％)可檢測到GPC3mRNA表達(dá)，而在正常肝和肝炎組織中只有3.2％檢測到GPC3mRNA。大量的研究證實(shí)GPC3蛋自在肝癌組織中高表達(dá)，而在非癌組織中沒有表達(dá)或表達(dá)量極低，說明GPC3和肝癌有特定的關(guān)系，同時(shí)有研究表明GPC3在肺癌、乳腺癌、問皮瘤、腎癌和卵巢癌組織中表達(dá)缺失，GPC3具有抑制這些腫瘤的生長，更加說明GPC3在肝癌表達(dá)的特異性和在肝癌作用機(jī)制的特異性。鑒于GPC3在HCC、黑素瘤和卵巢透明細(xì)胞癌中高表達(dá)，GPC3已經(jīng)被確認(rèn)為新興的腫瘤免疫診斷的靶點(diǎn)。對于腫瘤診斷來說，雖然單單該靶點(diǎn)的測得并不足以完成腫瘤的診斷，但是對于以臨床癥狀為主要診斷指標(biāo)的診斷仍然有很大的輔助作用。從GPC3的檢測角度上來說，目前臨床上用于測定GPC3的方法比較有限。目前有在使用的酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測GPC3，但是此種方法是一種顯色的固相反應(yīng)法，它的方法學(xué)限制了檢測的靈敏度和特異性。而且ELISA方法線性范圍窄、也不易實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，GPC3作為一種特異性的腫瘤免疫診斷指標(biāo)，GPC3的檢測靈敏度、準(zhǔn)確性和特異性的提高，有助于更好的對腫瘤進(jìn)行判斷和治療，本發(fā)明采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測GPC3，進(jìn)一步的提高了GPC3診斷試劑盒的各項(xiàng)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明為了更加有效、靈敏、特異地檢測磷脂酰肌醇蛋白聚糖，而提供了一種磷脂酰肌醇蛋白聚糖定量測定試劑盒，所述試劑盒包括：磷脂酰肌醇蛋白聚糖磁分離試劑、酶反應(yīng)物、標(biāo)準(zhǔn)品和底物溶液。本發(fā)明涉及一種磷脂酰肌醇蛋白聚糖定量測定試劑盒，所述試劑盒包括：磷脂酰肌醇蛋白聚糖磁分離試劑、酶反應(yīng)物、標(biāo)準(zhǔn)品和底物溶液；其中，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖磁分離試劑為標(biāo)記有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖單克隆抗體的磁性微球；所述酶反應(yīng)物為含有堿性磷酸酶標(biāo)記的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖單克隆抗體；所述標(biāo)準(zhǔn)品為含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗原的BSA蛋白溶液；所述底物溶液為酶促化學(xué)發(fā)光底物溶液。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括清洗液，所述清洗液為含TWEEN-20和Proclin-300的緩沖液.優(yōu)選地，所述清洗液中TWEEN-20的工作濃度為0.25g/L，Proclin-300的工作濃度為0.05mL/1000mL，且清洗液的pH值為7.35－7.45。本發(fā)明還涉及一種定量檢測磷脂酰肌醇蛋白聚糖的方法，所述方法包括以下步驟：a.將待測樣品和所述標(biāo)準(zhǔn)品分別與所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖磁分離試劑混合并使其充分結(jié)合，得到第一混合物；b.將第一混合物與所述酶反應(yīng)物混合，溫育后得到第二混合物；c.將第二混合物置于磁場中，使所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖磁分離試劑在磁場中沉降，去除上清并用清洗液洗滌；d.向洗滌后的磷脂酰肌醇蛋白聚糖磁分離試劑中加入所述底物溶液；e.測定發(fā)光反應(yīng)后的吸光度(將待測樣品的吸光度與標(biāo)準(zhǔn)品比較，得到待測樣品的定量數(shù)據(jù))。優(yōu)選地，所述清洗液為含TWEEN-20和Proclin-300的緩沖液。優(yōu)選地，所述清洗液中TWEEN-20的工作濃度為0.25g/L，Proclin-300的工作濃度為0.05mL/1000mL，且清洗液的pH值為7.35－7.45。本發(fā)明采用的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)等方法包被上具有特異性親和力的抗體或抗原等各種免疫活性物質(zhì)，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好、操作簡單、不影響被分離細(xì)胞或其他生物材料的生物學(xué)性狀和功能等特點(diǎn)，在外加磁場作用下可定向運(yùn)動(dòng)，是的某些特殊成分得以分離、濃集或純化。由于磁性微粒的直接僅有1微米左右，相對比較面積大，球形的表面可以吸附或者偶聯(lián)更多的免疫活性物質(zhì)，一致在一定環(huán)境的緩沖液中反應(yīng)，能夠有更多的機(jī)會接觸更多的目標(biāo)物質(zhì)，最終能夠更快和更多的結(jié)合特異性物質(zhì)，使得最終的反應(yīng)時(shí)間縮短，試劑盒結(jié)合量大，試劑盒的檢測范圍擴(kuò)大。磁分離化學(xué)發(fā)光免疫分析法綜合采用了目前國際上的兩大主流免疫分析尖端技術(shù)—懸浮磁微粒載體技術(shù)、化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)，使系統(tǒng)能夠充分滿足臨床對檢測結(jié)果的要求本發(fā)明的磷脂酰肌醇蛋白聚糖定量測定試劑盒及其檢測方法與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于：1.采用本發(fā)明試劑盒對磷脂酰肌醇蛋白聚糖定量進(jìn)行檢測的方法，其檢測范圍寬：表面巨大的磁微粒免疫反應(yīng)載體、靈敏穩(wěn)定的堿性磷酸酶底物化學(xué)發(fā)光體系保證了線性范圍達(dá)到0.50-64ng/ml。2.采用本發(fā)明試劑盒對磷脂酰肌醇蛋白聚糖定量進(jìn)行檢測的方法，其靈敏度高：懸浮磁微粒表面積大，可有效捕獲樣品中的痕量待測物，提高檢測的靈敏度達(dá)到0.05ng/ml。3.采用本發(fā)明試劑盒對磷脂酰肌醇蛋白聚糖定量進(jìn)行檢測的方法，其快速準(zhǔn)確：懸浮磁微粒作為反應(yīng)載體，可發(fā)揮液相免疫反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，保證免疫反應(yīng)和發(fā)光反應(yīng)迅速達(dá)到平衡，無需耗時(shí)等待。4.本發(fā)明試劑盒采用了磁性微粒分離的技術(shù)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)，讓整個(gè)反應(yīng)近似液相反應(yīng)，這種方法用于檢測GPC3，使得試劑盒檢測的準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性得到了極大的提高，另外相對傳統(tǒng)的ELISA方法檢測GPC3，縮短了近40分鐘，而且操作簡單。5.本發(fā)明公開了一種新的專用穩(wěn)定增強(qiáng)劑Na2SO3以及清洗液，使得反應(yīng)過程更加穩(wěn)定可靠，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)靈敏有效，在提高產(chǎn)品性能的同時(shí)，并且大大降低了產(chǎn)品成本6.本發(fā)明的試劑盒中的磁分離試劑，酶反應(yīng)物，穩(wěn)定增強(qiáng)劑，標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品，清洗液濃縮液、稀釋液以及底物溶液均是該反應(yīng)體系下的最優(yōu)配方，使該試劑盒的使用效期可達(dá)1年以上，為產(chǎn)品的使用效期及檢測性能提供了有力保障。具體實(shí)施方式通過以下實(shí)施例和驗(yàn)證試驗(yàn)對本發(fā)明的磷脂酰肌醇蛋白聚糖定量測定試劑盒及其檢測方法作進(jìn)一步的說明。本發(fā)明所述的檢測方法是對于一種腫瘤靶標(biāo)——磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC3)的定量檢測，其對于腫瘤的診斷可以有輔助作用，但是單單這一個(gè)指標(biāo)并不足以確診。腫瘤的診斷在臨床上仍然以臨床癥狀為主要指征，這些靶標(biāo)的存在僅僅是一種輔助的驗(yàn)證，因此，本發(fā)明所述的檢測方法不屬于疾病的診斷方法。本發(fā)明提供了一種磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC3)的定量測定試劑盒，其包含的試劑有GPC3磁分離試劑，酶反應(yīng)物，標(biāo)準(zhǔn)品，濃縮洗滌液以及底物溶液。磁分離試劑為含有標(biāo)記有抗GPC3單克隆抗體的磁性微球。酶反應(yīng)物為堿性磷酸酶標(biāo)記的抗GPC3單克隆抗體。標(biāo)準(zhǔn)品為含有一定量的GPC3抗原的BSA蛋白溶液。清洗液濃縮液為含有TWEEN-20和Proclin-300的緩沖液。所述的底物溶液為酶促化學(xué)發(fā)光底物溶液。本發(fā)明磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC3)的定量測定試劑盒的制備方法，包括下述步驟：第一步：磁分離試劑的制備過程一、磁珠緩沖液配制操作步驟，配制1L：1、稱取TRIS6.06g、NaCl9.0g、1.0gTWEEN-20于1L容器中；2、用移液器將Proclin-300量取0.5ml于上述1L容器中，然后在上述1L容器中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢瑁?、調(diào)節(jié)PH計(jì)測量其PH值，調(diào)PH，控制PH在8.0(正負(fù)0.5)；4、稱取BSA2g倒入上述1L容器中；5、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過濾；過濾完后貼好標(biāo)簽于2-8℃冷庫貯存。二、磁分離試劑的制備過程1、將2.0mg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于100ulDMSO中，取4mg抗GPC3單克隆抗體溶于PH9.5的0.15mol/LPB緩沖液中至總體積為2ml；2、確定辛二酸二琥珀酰亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫90min；3、將步驟2抗體溶液加入到Centricon-10濃縮管中然后放入到高速冷凍離心機(jī)中濃縮40min至體積為1ml；4、取1ml磁珠，加入10ml反應(yīng)杯中，放入專用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清；5、每次加入1.5mlPH9.50.15mol/LPB，混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次；將步驟4獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應(yīng)4小時(shí)；6、加入0.6ml1mol/L的TRIS溶液37℃20分鐘；7、每次加入1.5mlPH7.20.15mol/LPB清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次；8、用100ml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125ml玻璃瓶，即為0.05％的GPC3磁分離試劑；磁珠保存液配方為0.5％BSA，0.05％吐溫-20，0.02％NaN3，4℃保存。9、將步驟9獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1：1的比例混勻，即得本發(fā)明試劑盒中磁分離試劑。第二步：酶反應(yīng)物制備過程一、酶反應(yīng)物稀釋液配制操作步驟，配制1L：1、取Tris6.06g、NaCl9.0g、Zncl20.05g、Proclin-3000.5ml和MgCl20.05g于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢?，使試劑完全溶解?、調(diào)PH，控制PH在7.35-7.45范圍內(nèi)；3、稱取BSA2g倒入上述燒杯中；4、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過濾即得。二、堿性磷酸酶ALP與抗GPC3單克隆抗體的偶聯(lián)1、取10mgALP加入1ml生理鹽水中，充分溶解；2、向步驟1中加入0.1ml的0.2MNaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，然后裝入透析袋中，用1mMPH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜，收集保留液；3、向步驟3獲得保留液中加入0.2MPH9.5碳酸鹽緩沖液，使PH升高到9.0，然后立即加入2.5mg抗GPC3單克隆抗體，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)，再加入0.1ml的4mg/mlNaBH4溶液，混勻，置4℃下2小時(shí)；4、將上述液裝入透析袋中，對0.15MPH7.4PBS透析，4℃過夜，收集保留液；5、向步驟4獲得保留液中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時(shí)，然后3000rpm離心半小時(shí)，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0.15MPH7.4的PBS中；6、將步驟5獲得的溶液裝入透析袋中，用0.15MPH7.4的PB緩沖鹽水透析5個(gè)小時(shí)去除銨離子，收集保留液后10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，收集上清液，按照體積比為1：100的比例添加1MMgCl2溶液，即得堿性磷酸酶(ALP)與GPC3單克隆抗體的偶聯(lián)物，最后將收集到的堿性磷酸酶(ALP)與GPC3單克隆抗體的偶聯(lián)物用上述酶反應(yīng)物稀釋液以1：1000的體積比混合均勻，即得酶反應(yīng)物。第三步：校準(zhǔn)品的配制：使用校準(zhǔn)品稀釋液將GPC3的抗原按照一定濃度和方法稀釋成：0、0.5、2、8、32、64ng/mL。第四步：清洗濃縮液配制步驟，配制1L：1、稱取TRIS12.12g和NaCl180g于1L容器中；2、稱取5gTween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；3、用移液器將Proclin-300量取1ml于盛有10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；4、用量筒量取800ml純化水于上述1L容器中，充分?jǐn)嚢瑁敝镣耆芙猓?、調(diào)PH，控制其范圍在7.35－7.45之間；6、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um濾器過濾即得。第五步：底物溶液配制步驟，配制1L：1、稱取TRIS3.02g、NaCl4.5g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.5ml于1L燒杯中；2、用量筒量取600ml純化水于1L燒杯中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解，調(diào)PH，控制其范圍在7.95－8.05之間；3、加入250mlLumi-Phos480后，用0.2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至1000ml，混勻后即得。本發(fā)明工作原理：本發(fā)明為采用雙抗體夾心法用于檢測GPC3抗原，采用了磁性微粒分離技術(shù)實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物質(zhì)與其他物質(zhì)的分離，采用了化學(xué)發(fā)光的光信號用于最終的信號檢測。在試劑盒檢測時(shí)：在標(biāo)本、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品中加入定量的酶標(biāo)GPC3單抗、在含有結(jié)合著GPC3單克隆抗體的磁性微粒中，加入檢測標(biāo)本(血清標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品或者質(zhì)控品)，然后再加入標(biāo)記有ALP的酶標(biāo)GPC3抗體，37℃孵育后，磁性微粒上結(jié)合的GPC3單克隆抗體與酶標(biāo)單克隆抗體分別與GPC3抗原的不同表位結(jié)合，形成“三明治”結(jié)構(gòu)的雙抗體夾心法的復(fù)合物。然后采用外加磁場，讓復(fù)合物沉淀吸附在試管壁，倒掉上清液，并采用洗滌液洗滌，然后加入化學(xué)發(fā)光底物液。底物在酶作用下被催化裂解，形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)激發(fā)態(tài)中間體回到基態(tài)時(shí)便發(fā)出光子，形成發(fā)光反應(yīng)，即可使用發(fā)光儀檢測反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可算出樣品中的GPC3含量。在檢測范圍內(nèi)，發(fā)光強(qiáng)度與樣本中的GPC3濃度成正比。實(shí)施例1本實(shí)施例的含有標(biāo)記有抗GPC3單克隆抗體的磁性微球按以下步驟制備：一、磁珠緩沖液的配置：配方見表1，以配制1L為例：1、稱取TRIS6.06g、NaCl9.0g、1.0gTWEEN-20于1L容器中；2、用移液器將Proclin-300量取0.5ml于上述1L容器中，然后在上述1L容器中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢瑁?、調(diào)節(jié)PH計(jì)測量其PH值，調(diào)PH，控制PH在8.0+0.05；4、稱取BSA2g倒入上述1L容器中；5、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過濾；過濾完后貼好標(biāo)簽于2-8℃冷庫貯存。磁珠緩沖液有效期為12個(gè)月；表1磁珠緩沖液的原料及配比二、磁分離試劑的制備過程1、將2.0mg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于100ulDMSO中，取4mg抗GPC3(來源于科博信(北京)生物技術(shù)有限公司，濃度為3.24mg/ml)單克隆抗體溶于PH9.5的0.15mol/LPB緩沖液中至總體積為2ml；2、確定辛二酸二琥珀酰亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫90min；3、將步驟2抗體溶液加入到Centricon-10濃縮管中然后放入到thermo高速冷凍離心機(jī)中濃縮40min至體積為1ml；4、取1ml磁珠(MERCK)，濃度為1mg/ml，直徑1微米左右，加入10ml反應(yīng)杯中，放入專用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清；5、每次加入1.5mlPH9.50.15mol/LPB，混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次；將步驟4獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應(yīng)4小時(shí)；6、加入0.6ml1mol/L的TRIS溶液37℃20分鐘；7、每次加入1.5mlPH7.20.15mol/LPB清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次；8、用100ml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125ml玻璃瓶，即為0.05％的GPC3磁分離試劑；磁珠保存液配方為0.5％BSA，0.05％吐溫-20，0.02％NaN3，4℃保存。9、將步驟8獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1：1的比例混勻，即得本發(fā)明試劑盒中磁分離試劑。10、貼好標(biāo)簽于2-8℃冷庫貯存,磁分離試劑有效期為12個(gè)月。實(shí)施例2本實(shí)施例的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗GPC3單克隆抗體按以下步驟制備：一、酶反應(yīng)物(堿性磷酸酶標(biāo)記的抗GPC3單克隆抗體)稀釋液配制：配方見表2，以配制1L為例：1、取Tris6.06g、NaCl9.0g、Zncl20.05g、Proclin-3000.5ml和MgCl20.05g于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢?，使試劑完全溶解?、調(diào)PH，控制PH在7.35-7.45范圍內(nèi)；3、稱取BSA2g倒入上述燒杯中；4、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過濾即得，貼好標(biāo)簽于2-8℃冷庫貯存，有效期為12個(gè)月。表2酶反應(yīng)物稀釋液的原料及配比二、堿性磷酸酶(ALP)與抗GPC3單克隆抗體的偶聯(lián)1、取10mgALP加入1ml生理鹽水中，充分溶解；2、向步驟1中加入0.1ml的0.2MNaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，然后裝入透析袋中，用1mMPH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜，收集保留液；3、向步驟3獲得保留液中加入0.2MPH9.5碳酸鹽緩沖液，使PH升高到9.0，然后立即加入2.5mg抗GPC3單克隆抗體(購自科博信(北京)生物技術(shù)有限公司，濃度3.85mg/ml)，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)，再加入0.1ml的4mg/mlNaBH4溶液，混勻，置4℃下2小時(shí)；4、將上述液裝入透析袋中，對0.15MPH7.4PBS透析，4℃過夜，收集保留液；5、向步驟4獲得保留液中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時(shí)，然后3000rpm離心半小時(shí)，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0.15MPH7.4的PBS中；6、將步驟5獲得的溶液裝入透析袋中，用0.15MPH7.4的PB緩沖鹽水透析5個(gè)小時(shí)去除銨離子，收集保留液后10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，收集上清液，按照體積比為1：100的比例添加1MMgCl2溶液，即得堿性磷酸酶(ALP)與GPC3單克隆抗體的偶聯(lián)物，最后將收集到的堿性磷酸酶(ALP)與GPC3單克隆抗體的偶聯(lián)物用上述酶反應(yīng)物稀釋液以1：1000的體積比混合均勻，即得酶反應(yīng)物(堿性磷酸酶標(biāo)記的抗GPC3單克隆抗體)。實(shí)施例3本實(shí)施例的校準(zhǔn)品按以下步驟制備：一、校準(zhǔn)品稀釋液的配制：以配制1L為例：1、稱取NaCl9.0g和BSA40g于1L的容器中；2、用移液器將Proclin-300量取0.5ml加10ml純化水溶解，倒入上述1L的容器中；3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um濾器過濾，貼好標(biāo)簽于2-8℃冷庫貯存，有效期為12個(gè)月。表3稀釋液的原料及配比二、校準(zhǔn)品最高點(diǎn)：最高濃度點(diǎn)為X，目標(biāo)點(diǎn)濃度為A,B,C,D,E,F，配制V體積的溶液時(shí)，需加入原料的體積如表4所示。表4加入原料的體積濃度加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液體積加入X體積AV-A*V/XA*V/XBV-B*V/XB*V/XCV-C*V/XC*V/XDV-D*V/XD*V/XEV-E*V/XE*V/XFV-F*V/XF*V/X三、磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC3)定量測定試劑盒GPC3校準(zhǔn)品原料(Fitzegrald公司，濃度為1.0mg/ml)用校準(zhǔn)品稀釋液按照上述方法配制成濃度點(diǎn)為0、0.5、2、8、32、64ng/mL。配置好充分混勻后，分裝，貼好標(biāo)簽于2-8℃冷庫貯存，有效期為12個(gè)月。實(shí)施例4本實(shí)施例的清洗液濃縮液(含有TWEEN-20和Proclin-300的緩沖液)按以下步驟制備：配方見(表5)以配制1L為例：(注：濃縮洗滌液使用時(shí)需要20倍稀釋后使用。)1、稱取TRIS12.12g和NaCl360g于1L容器中；2、稱取5gTween-20后，倒入上述1L容器中；3、用移液器將Proclin-300量取1ml，倒入上述1L容器中；4、用量筒量取800ml純化水于上述1L容器中，充分?jǐn)嚢瑁敝镣耆芙猓?、用HCL或NaOH調(diào)pH值，控制其范圍在7.35－7.45之間；6、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um濾器過濾，分裝后貼標(biāo)簽于2-8℃貯存，有效期為12個(gè)月。表5清洗濃縮液的原料及配比實(shí)施例5本實(shí)施例的底物溶液按以下步驟配制：配方見(表6)，以配制1L為例：1、稱取TRIS3.02g、NaCl4.5g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.5ml于1L燒杯中；2、用量筒量取600ml純化水于1L燒杯中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解，用HCl或NaOH調(diào)PH，控制其范圍在7.95－8.05之間；3、加入250mlLumi-Phos480后，用0.2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至1000ml，混勻后分裝。貼好標(biāo)簽于2-8℃冷庫貯存，有效期為12個(gè)月。表6化學(xué)發(fā)光底物的原料及配比實(shí)施例6本實(shí)施例的磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC3)的定量測定方法，其采用實(shí)施例1-5中制得的試劑進(jìn)行檢測，并按以下步驟進(jìn)行：1、取與反應(yīng)測試數(shù)相等的潔凈試管，放于特質(zhì)試管架上；2、在對應(yīng)試管的底部加入20μlGPC3的待測標(biāo)本或者標(biāo)準(zhǔn)品；3、在每個(gè)試管內(nèi)加入50μl酶反應(yīng)物；4、在每個(gè)試管中加入30μl磁分離試劑；5、采用多管混勻器振蕩混勻試管架20-30s，然后置于37℃水浴鍋中水浴放置30分鐘；6、從水浴鍋中取出試管架，放于磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2-3分鐘。緩慢的倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；7、將濃縮洗滌液用純化水稀釋20倍后，加入400μl稀釋后的清洗液至每一試管中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻20-30s。然后重復(fù)6、7的操作兩遍；8、在清洗完，并在濾紙上充分倒出了清洗液的試管內(nèi)加入200μl底物溶液中，手工試管架約3-5秒后，迅速使用準(zhǔn)備好的發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測；9、通過發(fā)光檢測儀，獲取各測試的光子技術(shù)，根據(jù)校準(zhǔn)品檢測的化學(xué)發(fā)光值和已知的濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測樣品的發(fā)光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，求得其對應(yīng)的濃度值，即得檢查樣本中GPC3的含量。驗(yàn)證試驗(yàn)：臨床應(yīng)用測試：1、檢測數(shù)據(jù)我們通過不同地域的多家醫(yī)院，并盡量收集到不同地區(qū)、不同個(gè)體的血清標(biāo)本共計(jì)1050例，其中體檢正常人的標(biāo)600例，腫瘤患者標(biāo)本420例(其中肝癌患者標(biāo)本342例，其他癌癥患者標(biāo)本78例)，溶血、脂血、膽固醇高者等干擾性標(biāo)本30例。我們采用本發(fā)明的試劑盒對以上1050份血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，同時(shí)我們也采用某國外公司生產(chǎn)的磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC3)ELISA檢測試劑盒同時(shí)進(jìn)行對比，我公司在檢測600例正常人標(biāo)本時(shí)，陰性率達(dá)到了99.7％，而對比試劑盒陰性率97.7％；我們在檢測420例癌癥標(biāo)本時(shí)，陽性率達(dá)到了82.4％，對比試劑盒陽性率是73.3％，我們對干擾性標(biāo)本進(jìn)行檢測時(shí)，出現(xiàn)了2份陽性，而對比試劑盒出現(xiàn)了8份陽性。通過臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，我們采用本發(fā)明的磁微粒化學(xué)發(fā)光技術(shù)對磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC3)的檢測，能提夠大大提高試劑盒對GPC3檢出的靈敏度和特異性。本發(fā)明采用的方法和試劑盒在臨床的應(yīng)用檢測中可以為腫瘤疾病的診斷和治療發(fā)揮更大的作用。2、本發(fā)明試劑盒性能指標(biāo)分析靈敏度：0.05ng/ml精密性：批內(nèi)變異CV％≦10.0％；批間變異CV％≦15.0％線性系數(shù)：r≥0.9900線性范圍：0.50-64ng/ml特異性：測定1000μg/L的AFP，干擾度＜0.5％。雖然以上描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些僅是舉例說明，本發(fā)明的保護(hù)范圍是由所附權(quán)利要求書限定的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的原理和實(shí)質(zhì)的前提下，可以對這些實(shí)施方式作出多種變更或修改，但這些變更和修改均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3