本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，具體是一種鹽酸克倫特羅檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

鹽酸克倫特羅（elenbuterol hydroehloride，簡(jiǎn)稱 CL）是一種β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，商品名為氨哮素、克喘素，是兒茶酚胺的一種衍生物，俗稱“瘦肉精”。將一定量的CL添加到飼料中，能明顯促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)率和飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)動(dòng)物脂肪分解，瘦肉率提高10%左右。隨著CL在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)CL能在動(dòng)物體內(nèi)蓄積殘留，導(dǎo)致食用中毒。CL中毒會(huì)對(duì)人的身體健康造成嚴(yán)重的危害，其癥狀包括：血壓升高、血管擴(kuò)張、心跳加快、呼吸加劇、體溫升高、肌肉顫抖、頭痛、胸悶、神經(jīng)過(guò)敏、肌肉疼痛、心悸、惡心、嘔吐等。由于CL作為飼料添加劑的危害嚴(yán)重，上世紀(jì)90年代，歐洲等國(guó)家紛紛頒布法規(guī)，嚴(yán)禁將CL用作促生長(zhǎng)劑。我國(guó)農(nóng)業(yè)部在1997年3月（農(nóng)牧發(fā)[1997]3號(hào)文）嚴(yán)令禁止腎上腺素在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用，但目前國(guó)內(nèi)非法濫用的情況依然嚴(yán)重。目前檢測(cè)CL的方法主要有HPLC-MS（高效液相色譜-質(zhì)譜）、GC-MS（氣相色譜-質(zhì)譜）和ELISA（酶聯(lián)免疫吸附法）法。HPLC-MS和GC-MS兩種方法所需的設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜，通常作為定量和確證方法；ELISA方法操作簡(jiǎn)單、快速，但其靈敏度低，適用于定性和半定量，通常用作大規(guī)模樣品篩選?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法（chemilumi-nescenceimmunoassay，CLIA）是將免疫反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)相結(jié)合以檢測(cè)抗原或抗體的免疫技術(shù)，它以化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或酶為標(biāo)記物，直接標(biāo)記在抗原或抗體上，免疫反應(yīng)結(jié)束后，加入發(fā)光底物。利用發(fā)光信號(hào)檢測(cè)儀測(cè)量發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物與發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系計(jì)算出被測(cè)物的含量(Shelver等，2002)。它同時(shí)具有化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的成本低、速度快、特異性強(qiáng)、樣品與處理簡(jiǎn)單和選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，非常適合快速檢測(cè)。目前化學(xué)發(fā)光酶免疫分析技術(shù)在環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全、制藥和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有較大發(fā)展。前人采用間接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法對(duì)豬尿樣中的CL進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度分別為0.08μg/L和0.01μg/L，但方法只限于豬尿樣中CL的測(cè)定；有些采用間接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶免疫法測(cè)定沙丁胺醇和CL，但操作繁瑣耗時(shí)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種鹽酸克倫特羅檢測(cè)方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種鹽酸克倫特羅檢測(cè)方法，包括如下步驟：a.樣品制備，稱取4.0±0.05g均質(zhì)化后的組織樣本至50-60ml離心管中；加入3-5ml3%的三氯乙酸，用振蕩器振蕩搖至均勻，顛倒混勻15-20min；3000r以上離心10-15分鐘；將上述離心后的上清液取5-10ml轉(zhuǎn)入20ml試管，加3-5ml異丙醇-乙酸乙酯混合液，體積比2：3，震蕩10min，靜置5min；然后，3000r以上離心10分鐘；取1.5ml上述離心后的上層有機(jī)相于小燒杯或玻璃試管中，60℃氮?dú)獯蹈?；?ml稀釋液充分溶解；取50μl上清液用于檢測(cè)，檢測(cè)稀釋倍數(shù)；b.加樣檢測(cè)，將在冷藏環(huán)境中貯藏的試劑室溫25℃平衡；將濃度分別為：0ng/ml、0.1ng/ml、0.3ng/ml、0.9ng/ml、2.7ng/ml、8.1ng/ml的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣品按濃度由低到高加入酶標(biāo)板的板孔中，每孔50μl；然后將100μl稀釋的酶結(jié)合物即辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的CL抗原，1:2000稀釋倍數(shù)，加入到板孔底部，用震蕩機(jī)震蕩30秒，蓋上封板膜，25℃溫育30分鐘；用洗滌液洗滌，方法是向板孔中每孔注滿洗滌液，停留10秒后吸盡拍干，重復(fù)5次；第一底物和第二底物以體積比1：1混合均勻，加入到板孔中，每孔加入50μl，震蕩20秒；震蕩后10分鐘測(cè)定結(jié)果，使用微孔板化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)軟件進(jìn)行分析；c.根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值，借助化學(xué)發(fā)光檢測(cè)軟件進(jìn)行四參數(shù)Logistic擬合，坐標(biāo)選擇X-Y，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可推算出鹽酸克倫特羅的濃度，然后乘上相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即獲得樣品稀釋前實(shí)際的克倫特羅含量。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述均質(zhì)化后的組織樣本為肌肉樣本。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：所述均質(zhì)化后的組織樣本為心肝樣本。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明能夠?qū)}酸克倫特羅進(jìn)行快速檢測(cè)，且結(jié)果準(zhǔn)確，誤差小，檢測(cè)靈敏度高，對(duì)檢 測(cè)設(shè)備要求低。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。

本發(fā)明實(shí)施例中，一種鹽酸克倫特羅檢測(cè)方法，包括如下步驟：a.樣品制備，稱取4.0±0.05g均質(zhì)化后的組織樣本至50-60ml離心管中；加入3-5ml3%的三氯乙酸，用振蕩器振蕩搖至均勻，顛倒混勻15-20min；3000r以上離心10-15分鐘；將上述離心后的上清液取5-10ml轉(zhuǎn)入20ml試管，加3-5ml異丙醇-乙酸乙酯混合液，體積比2：3，震蕩10min，靜置5min；然后，3000r以上離心10分鐘；取1.5ml上述離心后的上層有機(jī)相于小燒杯或玻璃試管中，60℃氮?dú)獯蹈桑挥?ml稀釋液充分溶解；取50μl上清液用于檢測(cè)，檢測(cè)稀釋倍數(shù)；b.加樣檢測(cè)，將在冷藏環(huán)境中貯藏的試劑室溫25℃平衡；將濃度分別為：0ng/ml、0.1ng/ml、0.3ng/ml、0.9ng/ml、2.7ng/ml、8.1ng/ml的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣品按濃度由低到高加入酶標(biāo)板的板孔中，每孔50μl；然后將100μl稀釋的酶結(jié)合物即辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的CL抗原，1:2000稀釋倍數(shù)，加入到板孔底部，用震蕩機(jī)震蕩30秒，蓋上封板膜，25℃溫育30分鐘；用洗滌液洗滌，方法是向板孔中每孔注滿洗滌液，停留10秒后吸盡拍干，重復(fù)5次；第一底物和第二底物以體積比1：1混合均勻，加入到板孔中，每孔加入50μl，震蕩20秒；震蕩后10分鐘測(cè)定結(jié)果，使用微孔板化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)軟件進(jìn)行分析；c.根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值，借助化學(xué)發(fā)光檢測(cè)軟件進(jìn)行四參數(shù)Logistic擬合，坐標(biāo)選擇X-Y，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可推算出鹽酸克倫特羅的濃度，然后乘上相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即獲得樣品稀釋前實(shí)際的克倫特羅含量。所述均質(zhì)化后的組織樣本為肌肉樣本。所述均質(zhì)化后的組織樣本為心肝樣本。

實(shí)施例1

本發(fā)明鹽酸克倫特羅檢測(cè)方法，包括如下步驟：a.樣品制備，稱取4.0g均質(zhì)化后的組織樣本至50ml離心管中；加入3ml3%的三氯乙酸，用振蕩器振蕩搖至均勻，顛倒混勻15min；3000r以上離心10分鐘；將上述離心后的上清液取5ml轉(zhuǎn)入20ml試管，加3ml異丙醇-乙酸乙酯混合液，體積比2：3，震蕩10min，靜置5min；然后，3000r以上離心10分鐘；取1.5ml上述離心后的上層有機(jī)相于小燒杯或玻璃試管中，60℃氮?dú)獯蹈?；?ml稀釋液充分溶解；取50μl上清液用于檢測(cè)，檢測(cè)稀釋倍數(shù)；b.加樣檢測(cè)，將在冷藏環(huán)境中貯藏的試劑室溫25℃平衡；將濃度分別為：0ng/ml、0.1ng/ml、0.3ng/ml、0.9ng/ml、2.7ng/ml、8.1ng/ml的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣品按濃度由低到高加入酶標(biāo)板的板孔中，每孔50μl；然后將100μl稀釋的酶結(jié)合物即辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的CL抗原，1:2000稀釋倍數(shù)，加入到板孔底部，用震蕩機(jī)震蕩30秒，蓋上封板膜，25℃溫育30分鐘；用洗滌液洗滌，方法是向板孔中每孔注滿洗滌液，停留10秒后吸盡拍干，重復(fù)5次；第一底物和第二底物以體積比1：1混合均勻，加入到板孔中，每孔加入50μl，震蕩20秒；震蕩后10分鐘測(cè)定結(jié)果，使用微孔板化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)軟件進(jìn)行分析；c.根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值，借助化學(xué)發(fā)光檢測(cè)軟件進(jìn)行四參數(shù)Logistic擬合，坐標(biāo)選擇X-Y，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可推算出鹽酸克倫特羅的濃度，然后乘上相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即獲得樣品稀釋前實(shí)際的克倫特羅含量。所述均質(zhì)化后的組織樣本為肌肉樣本。所述均質(zhì)化后的組織樣本為心肝樣本。

實(shí)施例2

本發(fā)明鹽酸克倫特羅檢測(cè)方法，包括如下步驟：a.樣品制備，稱取4.05g均質(zhì)化后的組織樣本至55ml離心管中；加入4ml3%的三氯乙酸，用振蕩器振蕩搖至均勻，顛倒混勻18min；3000r以上離心12分鐘；將上述離心后的上清液取8ml轉(zhuǎn)入20ml試管，加4ml異丙醇-乙酸乙酯混合液，體積比2：3，震蕩10min，靜置5min；然后，3000r以上離心10分鐘；取1.5ml上述離心后的上層有機(jī)相于小燒杯或玻璃試管中，60℃氮?dú)獯蹈?；?ml稀釋液充分溶解；取50μl上清液用于檢測(cè)，檢測(cè)稀釋倍數(shù)；b.加樣檢測(cè)，將在冷藏環(huán)境中貯藏的試劑室溫25℃平衡；將濃度分別為：0ng/ml、0.1ng/ml、0.3ng/ml、0.9ng/ml、2.7ng/ml、8.1ng/ml的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣品按濃度由低到高加入酶標(biāo)板的板孔中，每孔50μl；然后將100μl稀釋的酶結(jié)合物即辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的CL抗原，1:2000稀釋倍數(shù)，加入到板孔底部，用震蕩機(jī)震蕩30秒，蓋上封板膜，25℃溫育30分鐘；用洗滌液洗滌，方法是向板孔中每孔注滿洗滌液，停留10秒后吸盡拍干，重復(fù)5次；第一底物和第二底物以體積比1：1混合均勻，加入到板孔中，每孔加入50μl，震蕩20秒；震蕩后10分鐘測(cè)定結(jié)果，使用微孔板化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)軟件進(jìn)行分析；c.根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值，借助化學(xué)發(fā)光檢測(cè)軟件進(jìn)行四參數(shù)Logistic擬合，坐標(biāo)選擇X-Y，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可推算出鹽酸克倫特羅的濃度，然后乘上相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即獲得樣品稀釋前實(shí)際的克倫特羅含量。所述均質(zhì)化后的組織樣本為肌肉樣本。所述均質(zhì)化后的組織樣本為心肝樣本。

實(shí)施例3

本發(fā)明鹽酸克倫特羅檢測(cè)方法，包括如下步驟：a.樣品制備，稱取3.95g均質(zhì)化后的組織樣本至50ml離心管中；加入4ml3%的三氯乙酸，用振蕩器振蕩搖至均勻，顛倒混勻20min；3000r以上離心15分鐘；將上述離心后的上清液取10ml轉(zhuǎn)入20ml試管，加5ml異丙醇-乙酸乙酯混合液，體積比2：3，震蕩10min，靜置5min；然后，3000r以上離心10分鐘；取1.5ml上述離心后的上層有機(jī)相于小燒杯或玻璃試管中，60℃氮?dú)獯蹈桑挥?ml稀釋液充分溶解；取50μl上清液用于檢測(cè)，檢測(cè)稀釋倍數(shù)；b.加樣檢測(cè)，將在冷藏環(huán)境中貯藏的試劑室溫25℃平衡；將濃度分別為：0ng/ml、0.1ng/ml、0.3ng/ml、0.9ng/ml、2.7ng/ml、8.1ng/ml的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣品按濃度由低到高加入酶標(biāo)板的板孔中，每孔50μl；然后將100μl稀釋的酶結(jié)合物即辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的CL抗原，1:2000稀釋倍數(shù)，加入到板孔底部，用震蕩機(jī)震蕩30秒，蓋上封板膜，25℃溫育30分鐘；用洗滌液洗滌，方法是向板孔中每孔注滿洗滌液，停留10秒后吸盡拍干，重復(fù)5次；第一底物和第二底物以體積比1：1混合均勻，加入到板孔中，每孔加入50μl，震蕩20秒；震蕩后10分鐘測(cè)定結(jié)果，使用微孔板化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)軟件進(jìn)行分析；c.根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值，借助化學(xué)發(fā)光檢測(cè)軟件進(jìn)行四參數(shù)Logistic擬合，坐標(biāo)選擇X-Y，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可推算出鹽酸克倫特羅的濃度，然后乘上相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即獲得樣品稀釋前實(shí)際的克倫特羅含量。所述均質(zhì)化后的組織樣本為肌肉樣本。所述均質(zhì)化后的組織樣本為心肝樣本。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無(wú)論從哪一點(diǎn)來(lái)看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說(shuō)明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說(shuō)明書(shū)按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說(shuō)明書(shū)的這種敘述方式僅僅是為清楚起見(jiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說(shuō)明書(shū)作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。