本發(fā)明涉及藥物檢測領域，特別是一種伊血安顆粒HPLC指紋圖譜的建立方法。

背景技術：
伊血安顆粒是一種治療婦科血癥的中成藥，主要成份為益母草、益母草、延胡索、甘草等，具有活血止血、行氣止痛等功效。臨床上用于產(chǎn)后惡露不絕，人工流產(chǎn)后子宮出血不凈，中醫(yī)辯證屬血瘀證者。隨著近年來新技術、新方法的運用，中藥復方研究出現(xiàn)了許多新思路，用指紋圖譜研究中藥復方就為其中之一，指紋圖譜對中藥復方進行質(zhì)量控制研究、提供質(zhì)量控制標準具有重要意義。但目前對伊血安顆粒的指紋圖譜建立方法研究還比較少。授權公告號為CN104458993B的發(fā)明專利，公開了一種壯藥材滇桂艾納香HPLC指紋圖譜的建立方法，以滇桂艾納香中的主要成分原兒茶酸和原兒茶醛為參照物，采用高效液相色譜儀檢測獲得了壯藥滇桂艾納香藥材共有模式的指紋圖譜，指紋圖譜共有色譜峰13個，該方法能快速、準確地鑒別滇桂艾納香的真?zhèn)蝺?yōu)劣，為控制藥材質(zhì)量和鑒別藥材優(yōu)劣提供了有力的理論依據(jù)。但上述發(fā)明僅是針對伊血安顆粒的其中一種原料藥建立了指紋圖譜，伊血安顆粒包含多種原料藥，為提高伊血安顆粒中藥復方的質(zhì)量控制水平，極有必要建議一種伊血安顆粒的指紋圖譜。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種伊血安顆粒HPLC指紋圖譜的建立方法，顯示了伊血安顆粒中各成分的組分與比例，為伊血安顆粒的質(zhì)量控制提供了重要參考。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案為：一種伊血安顆粒HPLC指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟：(1)對照品溶液的準備：原兒茶酸標準品，加入甲醇定容，制得參照物溶液。(2)供試品溶液的準備：取伊血安顆粒，加水溶解，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH，攪勻，靜置，濾過，加水飽和正丁醇萃取3～6次，分取出正丁醇提取液，合并正丁醇提取液，靜置，分取獲得正丁醇液，回收正丁醇，殘渣加甲醇溶解，離心，取上清液，得供試品溶液。(3)高效液相色譜儀的色譜條件：流動相：甲醇-0.1％冰乙酸；梯度洗脫程序：時間梯度0min→11min→16min→29min→30min→35min→45min→55min→70min→95min；對應的梯度洗脫液按以下體積比由流動相A甲醇和流動相B0.1％冰乙酸組成，流動相A的體積百分數(shù)梯度5％→16％→17％→30％→34％→34％→35％→45％→45％→70％，流動相B的體積百分數(shù)梯度95％→84％→83％→70％→66％→66％→65％→55％→55％→30％；紫外檢測波長：256nm；流速：1.0mL·min-1；柱溫：25℃。(4)測定：吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀，按照步驟(3)的色譜條件測定，得到指紋圖譜。優(yōu)選的，所述步驟(2)的具體操作方法為：稱取伊血安顆粒3～8g，加水50mL溶解，加稀鹽酸0.2～0.4mL，攪勻，靜置15～30min，濾過，加水飽和正丁醇萃取5～6次，每次15～20mL，分取正丁醇提取液，合并，靜置1～1.5h，分取獲得正丁醇液，回收正丁醇，殘渣加甲醇4～6mL，離心，取上清液，得供試品溶液。更優(yōu)選的，稱取伊血安顆粒5g，加水50mL溶解，加稀鹽酸0.3mL，攪勻，靜置20min，濾過，加水飽和正丁醇萃取5次，每次15mL，分取正丁醇提取液，合并，靜置1h，分取獲得正丁醇液，回收正丁醇，殘渣加甲醇5mL，離心，取上清液，得供試品溶液。進一步的，所述指紋圖譜共有色譜峰21個，其平均保留時間分別為：1號峰3.234min、2號峰5.962min、3號峰11.023min、4號峰15.353min、5號峰16.521min、6號峰24.498min、7號峰27.158min、8號峰30.877min、9號峰32.29min、10號峰34.752min、11號峰36.182min、12號峰37.968min、13號峰38.708min、14號峰56.509min、15號峰58.989min、16號峰59.670min、17號峰66.895min、18號峰68.358min、19號峰69.319min、20號峰85.217min、21號峰91.016min。更進一步的，所述伊血安顆粒的組分包括滇桂艾納香、益母草、延胡索和甘草，其中1號峰～21號峰來源于滇桂艾納香，9號峰來源于益母草，10、11號峰來源于延胡索，6、14、15、16號峰來源于甘草。優(yōu)選的，所述步驟(3)中，色譜柱為PhenomenexGeminiC18柱(4.6mm×250mm，5μm)。優(yōu)選的，所述步驟(3)中，保護柱為PhenomenexC18(4×3.0mm)。優(yōu)選的，所述步驟(3)中，理論塔板數(shù)以原兒茶酸峰計，不低于5000。優(yōu)選的，所述對照品溶液是濃度為0.081mg·mL-1的原兒茶酸標準品溶液。本發(fā)明中稀鹽酸是質(zhì)量分數(shù)為9.5％～10.5％的鹽酸。以上所述的技術方案，以原兒茶酸為參照物，通過高效液相色譜儀，采用甲醇-0.1％冰乙酸為流動相進行梯度洗脫，獲得了指紋圖譜，指紋圖譜中共有色譜峰21個，其中21個共有峰來源于滇桂艾納香，1個共有峰來源于益母草，2個共有峰來源于延胡索，4個共有峰來源于甘草，能充分反應伊血安顆粒中四種原料藥的化學成分，可用于整體評價四種原料藥的質(zhì)量和鑒別四種原料藥的優(yōu)劣，為控制伊血安顆粒的質(zhì)量提供了有力的理論依據(jù)。本方法樣品前處理快捷簡便，色譜分析時間短，精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，對伊血安顆粒的質(zhì)量控制和臨床療效具有重要意義。附圖說明圖1是實施例1中采用WelchromC18柱(4.6mm×250mm，5μm)得到的色譜圖；圖2是實施例1中采用HypersilC18柱(4.6mm×250mm，5μm)得到的色譜圖；圖3是實施例1中采用PhenomenexGeminiC18柱(4.6mm×250mm，5μm)得到的色譜圖；圖4是實施例1中采用甲醇-水為流動相得到的色譜圖；圖5是實施例1中采用乙腈-水為流動相得到的色譜圖；圖6是實施例1中采用甲醇-0.1％磷酸為流動相得到的色譜圖；圖7是實施例1中采用甲醇-0.05％冰乙酸為流動相得到的色譜圖；圖8是實施例1中采用甲醇-0.1％冰乙酸為流動相得到的色譜圖；圖9是實施例1中采用乙腈-0.1％冰乙酸為流動相得到的色譜圖；圖10是實施例1中波長為230nm得到的色譜圖；圖11是實施例1中波長為256nm得到的色譜圖；圖12是實施例1中波長為280nm(0～20min)-279nm(20～30min)得到的色譜圖；圖13是實施例1中波長為320nm得到的色譜圖；圖14是實施例1中波長為360nm得到的色譜圖；圖15是實施例1中柱溫為20℃得到的色譜圖；圖16是實施例1中柱溫為25℃得到的色譜圖；圖17是實施例1中柱溫為30℃得到的色譜圖；圖18是實施例1中柱溫為35℃得到的色譜圖；圖19是實施例1中流速為0.8mL·min-1得到的色譜圖；圖20是實施例1中流速為1.0mL·min-1得到的色譜圖；圖21是實施例1中流速為1.2mL·min-1得到的色譜圖；圖22是實施例2中以水為提取溶劑提取后檢測得到的色譜圖；圖23是實施例2中以甲醇為提取溶劑提取后檢測得到的色譜圖；圖24是實施例2中以乙醇為提取溶劑提取后檢測得到的色譜圖；圖25是實施例2中以水飽和正丁醇為萃取溶劑提取后檢測得到的色譜圖；圖26是實施例2中以氯仿為萃取溶劑提取后檢測得到的色譜圖；圖27是實施例2中以乙醚為萃取溶劑提取后檢測得到的色譜圖；圖28是實施例2中以乙酸乙酯為萃取溶劑提取后檢測得到的色譜圖；圖29是實施例3中伊血安顆粒的指紋圖譜；圖30是實施例3中參照物的色譜圖；圖31是實施例3中滇桂艾納香藥材色譜圖；圖32是實施例3中益母草藥材色譜圖；圖33是實施例3中延胡索藥材色譜圖；圖34是實施例3中甘草藥材色譜圖；圖35是實施例5中10個批號的伊血安顆粒的匹配圖。具體實施方式以下結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍不限于以下實施例：以下實施例的實驗材料、儀器和試劑準備如下：實驗材料：原兒茶酸標準品(中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號：110809-200503)。儀器：安捷倫Agilent1260高效液相色譜儀，含在線真空脫氣機器(G-1311C)、四元梯度泵(G-1311C)、標準自動進樣器(G-1329B)、智能化柱溫箱(G-1316A)、可變波長檢測器(G-1314B)、Agilent1260Infinity色譜工作站(美國安捷倫科技有限公司)；SB3200T超聲波清洗儀(上海必能信超聲有限公司)；MilliporeSimplicity-185超純水儀(美國密里博公司)；LG16-W高速微量離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；BT224S電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。試劑：甲醇、乙腈(色譜純，美國FisherScientific公司)；冰乙酸(HPLC，天津市科密歐化學試劑有限公司)；水為超純水；其它試劑均為分析純。實施例1色譜條件的優(yōu)化供試品溶液的準備方法：稱取伊血安顆粒5g，加水50mL溶解，加稀鹽酸0.3mL，攪勻，靜置20min，濾過，加水飽和正丁醇萃取5次，每次15mL，分取正丁醇提取液，合并，靜置1h，分取獲得正丁醇液，回收正丁醇，殘渣加甲醇5mL，離心，取上清液，得供試品溶液。1-1色譜柱的選擇高效液相色譜儀的其他測定條件相同，考察了WelchromC18柱(4.6mm×250mm，5μm)、HypersilC18柱(4.6mm×250mm，5μm)和PhenomenexGeminiC18柱(4.6mm×250mm，5μm)三種色譜柱，所得到的色譜圖分為如圖1、圖2、圖3所示，由圖3可以看出，PhenomenexGeminiC18柱(4.6mm×250mm，5μm)分離度最好，峰形對稱和尖銳，基線較平穩(wěn)。1-2流動相的選擇高效液相色譜儀的其他測定條件相同，考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1％磷酸、甲醇-0.05％冰乙酸、甲醇-0.1％冰乙酸、乙腈-0.1％冰乙酸為流動相進行梯度洗脫，所得到的色譜圖分別如圖4、圖5、圖6、圖7、圖8、圖9所示，經(jīng)比較可以看出，以甲醇-0.1％冰乙酸系統(tǒng)為流動相的色譜圖吸收峰分離較好，基線較平穩(wěn)。1-3檢測波長的選擇高效液相色譜儀的其他測定條件相同，考察了230nm、256nm、280nm、320nm、360nm吸收波長下的色譜圖，色譜圖分別如圖10、圖11、圖12、圖13和圖14所示，經(jīng)比較可以看出，在256nm處色譜圖顯示有較多的峰信息，且信號較好，所得色譜圖中各峰形較好、基線平穩(wěn)。1-4柱溫的選擇高...