一種快速檢測(cè)糧油中脫氧雪腐鐮刀烯醇膠體金試劑板的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本實(shí)用新型涉及一種快速檢測(cè)糧油中脫氧雪腐鐮刀烯醇的膠體金試劑板，可用于快速檢測(cè)糧油中的脫氧雪腐鐮刀烯醇。本實(shí)用新型試劑板由上下兩塊塑料卡殼和試紙條組成，試紙條由依次黏貼在背襯上的樣品墊、膠體金結(jié)合墊、反應(yīng)膜和吸水墊組成。塑料卡殼可固定試紙條，試紙條上的反應(yīng)膜上標(biāo)記有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，可將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見(jiàn)的顏色表現(xiàn)出來(lái)。該試劑板操作簡(jiǎn)單快速，整個(gè)操作過(guò)程僅需十幾分鐘，且不需要借助其它儀器設(shè)備，適用于野外現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。同時(shí)，該試劑板通過(guò)調(diào)整提取液及稀釋液的用量，可調(diào)整試劑板的檢測(cè)限，用于不同檢測(cè)要求的樣品檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種快速檢測(cè)糧油中脫氧雪腐鐮刀烯醇膠體金試劑板

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實(shí)用新型屬于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種膠體金檢測(cè)試紙板，具體涉及一種 快速檢測(cè)糧油中脫氧雪腐鐮刀烯醇的膠體金試紙板。

【背景技術(shù)】
[0002] 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是單端孢菌素烯烴中的一種，又稱(chēng)嘔吐毒素 (Deoxynivalenol，DON),由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生，常出現(xiàn)在玉米(穗腐病)、小麥和大麥(赤霉病） 上。它的毒性效應(yīng)包括：嘔吐、不想進(jìn)食、胃腸炎、腹瀉、免疫抑制和血液病。DON廣泛存在 于全球，主要污染小麥、大麥、玉米等谷類(lèi)作物，也污染糧食制品，人和動(dòng)物在誤食被該毒素 污染的糧谷類(lèi)后可以產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng)。另外，它還常與其它的霉菌毒素如黃曲霉毒素 共同污染農(nóng)作物，進(jìn)入人體后可以相互影響。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)DON可能與人類(lèi)食管癌、IgA腎病 有關(guān)，對(duì)人類(lèi)及動(dòng)物的健康構(gòu)成威脅。DON屬于劇毒或中等毒物，研究表明，DON在體內(nèi)可 能有一定的蓄積，但無(wú)特殊的靶器官，具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。人畜攝入了被DON污染的食物 /飼料后，會(huì)導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)損害 造血系統(tǒng)造成死亡，但不同的動(dòng)物對(duì)DON的敏感程度不一，豬是最敏感的動(dòng)物。研究表明， DON可能對(duì)免疫系統(tǒng)有影響，有明顯胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遺傳毒性，但無(wú)致癌、 致突變作用。由于DON的危害嚴(yán)重，引起了各國(guó)的普遍重視。谷物及飼料中DON的含量有 嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)GB 2761-2011 "食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量"中規(guī)定 玉米、小麥等谷物及其制品中DON的限量標(biāo)準(zhǔn)為IOOOii g/kg。
[0003]目前，脫氧雪腐鐮刀烯醇的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液 相色譜法以及液質(zhì)聯(lián)用法等。薄層色譜法靈敏度較低，操作過(guò)程中需要接觸有毒有害試劑； 液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用法雖然靈敏度高，準(zhǔn)確性好，但操作復(fù)雜，需要專(zhuān)業(yè)的操作人員，儀器 價(jià)格高，不適用于戶(hù)外操作和大范圍現(xiàn)場(chǎng)操作；酶聯(lián)免疫吸附法作為快速方法，雖然具有快 速、靈敏、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，但是仍然需要一定的操作要求和環(huán)境，不太適用于戶(hù)外和現(xiàn)場(chǎng) 操作。
[0004] 膠體金免疫層析法是利用抗原抗體的特異反應(yīng)，以膠體金為顯色媒介，將反應(yīng)所 需的原料大部分整合到試劑板上，在層析過(guò)程中完成檢測(cè)反應(yīng)，克服了酶聯(lián)免疫吸附法的 一些不足，具有快速、操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、不需要額外設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。目前被廣泛應(yīng)用于生物 技術(shù)諸多領(lǐng)域。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本實(shí)用新型針對(duì)糧油中脫氧雪腐鐮刀烯醇含量檢測(cè)展開(kāi)研究，提供一種具有快 速、操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度高、不需要額外設(shè)備等特點(diǎn)，可用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)糧油中脫 氧雪腐鐮刀烯醇含量的免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板。
[0006] 本試劑板由上下兩塊塑料卡殼和試紙條組成，試紙條由依次黏貼在背襯上的樣品 墊、膠體金結(jié)合墊、反應(yīng)膜和吸水墊組成。其中樣品墊、膠體金結(jié)合墊、反應(yīng)膜和吸水墊在相 鄰的地方有2mm的重疊，以保證層析作用從樣品墊到吸水墊的順利進(jìn)行，使樣品溶液中的 有效成分、反應(yīng)膜上的檢測(cè)區(qū)及質(zhì)控區(qū)與膠體金結(jié)合墊上的膠體金單抗偶聯(lián)物順利發(fā)生反 應(yīng)。
[0007] 所述膠體金結(jié)合墊上包被有抗DON鼠單抗與膠體金的偶聯(lián)物；反應(yīng)膜上從樣品墊 至吸水墊方向依次包被有DON-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)。
[0008] 本實(shí)用新型試劑板應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理，通過(guò)檢測(cè)區(qū)的抗原和金標(biāo)墊上的 金標(biāo)抗體反應(yīng)，以檢測(cè)區(qū)是否顯色來(lái)反應(yīng)糧油中的脫氧雪腐鐮刀烯醇含量是否超標(biāo)。加入 樣本提取液后，金標(biāo)抗體會(huì)隨樣品提取液朝吸水墊方向涌動(dòng)擴(kuò)散，如果樣品中含有脫氧雪 腐鐮刀烯醇則會(huì)先和金標(biāo)抗體反應(yīng)，當(dāng)樣品中的脫氧雪腐鐮刀烯醇含量超過(guò)或達(dá)到試劑板 檢出限，金標(biāo)抗體隨樣品液擴(kuò)散至檢測(cè)區(qū)時(shí)，由于有色的金標(biāo)抗體與抗原的結(jié)合位點(diǎn)被樣 品溶液中的脫氧雪腐鐮刀烯醇占據(jù)，而無(wú)法與檢測(cè)區(qū)上的脫氧雪腐鐮刀烯醇抗原結(jié)合，無(wú) 法固定在檢測(cè)區(qū)上，試劑板上的檢測(cè)區(qū)不顯色，則判定為陽(yáng)性；如果樣品中脫氧雪腐鐮刀烯 醇含量在檢測(cè)限以下或不含有，金標(biāo)抗體隨樣品液擴(kuò)散至檢測(cè)區(qū)時(shí)，會(huì)固定在檢測(cè)區(qū)上，試 劑板上的檢測(cè)區(qū)會(huì)呈現(xiàn)和膠體金顆粒一樣的顏色，則判定為陰性。
[0009] 本實(shí)用新型試劑板的各組成成分與功能如下：
[0010] 塑料卡殼：固定試紙條并標(biāo)示功能區(qū)，顯示加樣孔、檢測(cè)區(qū)、質(zhì)控區(qū)。
[0011] 試紙條：背襯為一面涂有不干膠的不吸水材料，常用PVC板，用于固定試紙其他組 分；樣品墊起吸收樣品溶液，緩沖樣品溶液PH值的作用，優(yōu)選玻璃纖維制成；膠體金結(jié)合墊 上有抗脫氧雪腐鐮刀烯醇單抗與膠體金的偶聯(lián)物，作用為樣品液中的抗原與金標(biāo)抗體反應(yīng) 的場(chǎng)所，優(yōu)選聚酯膜或玻璃纖維素膜制成；反應(yīng)膜用于標(biāo)記檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，將反應(yīng)結(jié)果以 肉眼可見(jiàn)的顏色表現(xiàn)出來(lái)，優(yōu)選硝酸纖維素膜；吸水墊由吸水紙制成，用于吸收多余的溶液 使其不影響最終結(jié)果。
[0012] 本實(shí)用新型試劑板具有如下有益效果：
[0013] (1)特異性好。本實(shí)用新型試劑板對(duì)DON交叉反應(yīng)率為100%，與其它種類(lèi)真菌毒 素包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮等均沒(méi)有交叉反應(yīng)。
[0014] (2)靈敏度高，檢測(cè)限可根據(jù)需要調(diào)節(jié)。本實(shí)用新型試劑板的最低檢測(cè)限為 500u g/kg，滿(mǎn)足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)食品中脫氧雪腐鐮刀烯醇的限量要求。同時(shí)可以根據(jù)實(shí)際需 要，調(diào)節(jié)樣品前處理方法，調(diào)整提取液及稀釋液的用量，調(diào)整試劑板的檢測(cè)限，適用于不同 檢測(cè)要求的樣品檢測(cè)。
[0015] (3)操作簡(jiǎn)單快速。本實(shí)用新型試劑板將實(shí)驗(yàn)所需的大部分原料都已整合到試紙 條上，不存在試劑配制、洗滌分離等操作，滴加樣品提取液后3-5分鐘即可肉眼讀取結(jié)果。
[0016] (4)不依賴(lài)實(shí)驗(yàn)設(shè)備。本實(shí)用新型試劑板除樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果肉眼可 直接判讀，不需要借助其它儀器設(shè)備，適用于野外現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
[0017] (5)成本低，效益好。本實(shí)用新型試劑板生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本低，且檢測(cè)時(shí)，不需要 單獨(dú)做質(zhì)控，質(zhì)控和檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，降低了檢測(cè)費(fèi)用。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為脫氧雪腐鐮刀烯醇膠體金快速檢測(cè)試劑板結(jié)構(gòu)示意圖。其中1為樣品墊，2 為膠體金結(jié)合墊，3為反應(yīng)膜,4為檢測(cè)區(qū),5為質(zhì)控區(qū),6為背襯,7為吸水墊。
[0019] 圖2為脫氧雪腐鐮刀烯醇膠體金快速檢測(cè)試劑板結(jié)果判定示意圖。
[0020] 實(shí)施方式
[0021] 本實(shí)用新型試劑板的制備包括脫氧雪腐鐮刀烯醇免疫原的制備、抗脫氧雪腐鐮刀 烯醇單克隆抗體制備、膠體金溶液制備、膠體金標(biāo)記抗脫氧雪腐鐮刀烯醇單抗的制備，脫氧 雪腐鐮刀烯醇膠體金快速檢測(cè)試劑板的組裝。
[0022] 1、脫氧雪腐鐮刀烯醇免疫原（DON-BSA)制備
[0023] 1. 1稱(chēng)取Img DON和IOmg正丁基硼酸溶于200 ill無(wú)水吡啶中，混勻溶解，室溫下 反應(yīng)24小時(shí)。
[0024] 1. 2加入IOmg 丁二酸酐，沸水浴中反應(yīng)3小時(shí)。用氮?dú)獯蹈?，加?00iil7jC，再 加入乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層，氮?dú)獯蹈珊?，溶?00 ill DMF中，加入10 mg DCC和6 mg NHS，4 °C下反應(yīng)過(guò)夜。
[0025] 1. 3將上述溶液滴加入BSA溶液中，室溫反應(yīng)10小時(shí)。
[0026] 1. 4將上述反應(yīng)溶液裝入透析袋中，用20mM pH7. 4 PBS溶液透析，4°C透析三天， 期間每8小時(shí)換一次透析液。
[0027] 1. 5取出透析后的溶液，離心，取上清，_20°C保存。
[0028] 2、抗脫氧雪腐鐮刀烯醇單克隆抗體制備
[0029] 2.1小鼠免疫
[0030] 將制備好的脫氧雪腐鐮刀烯醇免疫原，按體積比1:1加入佐劑混勻乳化，按蛋白 濃度100 U g/只腹部皮下多點(diǎn)免疫BALB/c小鼠，首免免疫原與弗氏完全佐劑等體積混勻， 二免及以后以免疫元和弗氏不完全佐劑等體積混勻，首免3周后，以同樣方法進(jìn)行二次免 疫，二免后每?jī)?周免疫一次,三免后檢測(cè)小鼠血清效價(jià),血清效價(jià)合格后進(jìn)行融合,融合 前3天再追加免疫一次。
[0031] 2.2細(xì)胞融合
[0032] 按照常規(guī)方法，準(zhǔn)備好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0)和提取免疫小 鼠的脾細(xì)胞，將小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞混合，然后在1分鐘左右時(shí)間內(nèi)（最佳時(shí)間為45 秒）緩慢加入預(yù)熱的融合劑（PEG4000)進(jìn)行融合，用HAT培養(yǎng)基懸浮均勻，再加入適量的飼 養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)十96孔培養(yǎng)板，于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后用HT培養(yǎng)基半換液，9天 的時(shí)候進(jìn)行全換液。
[0033] 2. 3雜交瘤細(xì)胞的篩選
[0034] 細(xì)胞融合后，待細(xì)胞長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。 采用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法初選，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液，檢測(cè)為陽(yáng)性的孔，立即用有限稀釋 法進(jìn)行業(yè)克隆化。
[0035] 2. 4雜交瘤細(xì)胞的凍存
[0036] 將進(jìn)行了 2-3次亞克隆后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后用含25%血清、10% DMSO的基 礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)液凍存，濃度為IO6-IO7左右/ml。
[0037] 2. 5單克隆抗體腹水制備
[0038]復(fù)蘇凍存的雜交瘤細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)。取8-10周齡BALB/c小鼠腹腔注射液體石蠟 0.5ml/只，7-10日后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1-2 XlO6 /只，7-10日后抽取小鼠腹水，離心取 上清，測(cè)定效價(jià)，凍存?zhèn)溆谩?br> [0039] 3、膠體金溶液制備
[0040] 取IOOml去離子水加入2. 5ml 1%氯金酸溶液，煮沸后，迅速加入I. 5ml 2%檸檬酸 三鈉溶液，繼續(xù)煮沸5分鐘，冷卻后，4°C避光保存。經(jīng)測(cè)定，該膠體金顆粒直徑為35nm左右。
[0041] 4、膠體金標(biāo)記DON單抗的制備
[0042] 移取制備的膠體金溶液100ml，用0. IM碳酸氫鈉溶液調(diào)整pH值到8. 0,加入Iml抗 DON單抗，攪拌15分鐘，緩慢加入Iml 25M的聚乙二醇20000溶液，攪拌15分鐘后，IOOOOr/ min離心15分鐘。棄去上清液，加入2ml含2%BSA的pH7. 4的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶后，4°C避 光保存。
[0043] 5、膠體金快速檢測(cè)試劑板的組裝
[0044] 用點(diǎn)膜機(jī)把適當(dāng)濃度的DON-BSA偶聯(lián)物以及羊抗鼠IgG分別噴涂在反應(yīng)膜上，作 為檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，37°C干燥箱內(nèi)干燥5小時(shí)。將適當(dāng)濃度的金標(biāo)抗體噴涂在經(jīng)過(guò)處理的 膠體金結(jié)合墊上，37°C干燥箱內(nèi)干燥5小時(shí)。在PVC背襯板上依次粘貼樣品墊，膠體金結(jié)合 墊，反應(yīng)膜和吸水墊。組裝完畢后，用切割機(jī)切割為3. 5mm寬的試紙條，裝入塑料模板中，制 成快速檢測(cè)試劑板。成品同干燥劑一起密封入鋁箔袋中保存。
[0045] 6、脫氧雪腐鐮刀烯醇快速檢測(cè)試劑板的檢測(cè)操作辦法
[0046] 6. 1樣品前處理
[0047] 取Ig粉碎的樣品置于IOml離心管中，加入5ml樣品提取液，劇烈震蕩3分鐘，靜 置2分鐘后，根據(jù)下表中檢測(cè)區(qū)取對(duì)應(yīng)量的上清液，再吸取對(duì)應(yīng)量的樣品稀釋液稀釋?zhuān)旌?均勻后待用

【權(quán)利要求】
1. 一種快速檢測(cè)糧油中脫氧雪腐鐮刀烯醇的膠體金試劑板，本試劑板由上下兩塊塑料 卡殼和試紙條組成，試紙條由依次黏貼在背襯上的樣品墊、膠體金結(jié)合墊、反應(yīng)膜和吸水墊 組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑板，其特征在于試紙條背襯上黏貼的樣品墊、膠體金結(jié) 合墊、反應(yīng)膜和吸水墊在相鄰的地方有2mm的重疊。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑板，其特征在于試紙條上的背襯為一面涂有不干膠的不 吸水材料，常用PVC板；樣品墊用玻璃纖維制成；膠體金結(jié)合墊用聚酯膜或玻璃纖維素膜制 成；反應(yīng)膜用硝酸纖維素膜；吸水墊用吸水紙制成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑板，其特征在于膠體金結(jié)合墊上噴有脫氧雪腐鐮刀烯醇 單克隆抗體和膠體金的結(jié)合物，反應(yīng)膜上從樣品墊到吸水墊方向依次噴有DON-BSA偶聯(lián)物 和羊抗鼠 IgG，分別作為檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑板，其特征在于膠體金顆粒的粒徑大小約為35nm。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK204044161SQ201420432653
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】張波, 雷達(dá), 劉向陽(yáng) 申請(qǐng)人:北京康源泰博生物科技有限公司