枳殼中兩種黃酮的質(zhì)量檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種中藥枳殼中5,6,7,3′,4′-五甲氧基黃酮和5,7,8,3′,4′-五甲氧基黃酮的質(zhì)量檢測方法，屬于生物醫(yī)藥領域，所述質(zhì)量檢測方法為高效液相色譜法，色譜條件和檢測條件如下：流動相：甲醇-水，體積比為(45—60)：(40—55)；流速：0.5-1.5mL·min-1；柱溫：25.0℃；進樣量：10-30μL；檢測波長：200—400nm，本發(fā)明主要的貢獻是建立了枳殼藥材中甜橙素即5,6,7,3′,4′-五甲氧基黃酮(E)和5,7,8,3′,4′-五甲氧基黃酮(I)的HPLC含量測定方法，為完善枳殼藥材的質(zhì)量標準以及枳殼的開發(fā)利用提供了新的科學依據(jù)。
【專利說明】枳殼中兩種黃酮的質(zhì)量檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及枳殼中5, 6, 7, 3'，4'-五甲氧基黃酮和5, 7, 8, 3'，4'-五甲氧基 黃酮的質(zhì)量檢測方法，屬于生物醫(yī)藥領域。

【背景技術】
[0002] 積殼（Aurantii Fructus)為蕓香科柑橘屬植物酸橙（Citrus aurantium L.)及 其栽培變種的干燥未成熟果實。枳殼氣清香，味苦、微酸，用于治療食積不化，臟器下垂等癥 狀，具有理氣寬中、行滯消脹等功效，是一種用途廣泛的中藥材，已被多版中國藥典收載。
[0003] 枳殼中的化學成分主要由黃酮、生物堿、香豆素及揮發(fā)油等類化合物組成。
[0004] 盡管國內(nèi)外學者廣泛的研究了枳殼的化學成分及其藥理作用，但是仍存在尚不明 確的化學成分，枳殼藥材的質(zhì)量標準還有待完善，枳殼的醫(yī)藥用途還有待進一步開發(fā)利用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有的缺陷，在對枳殼化學成分進行深入研究的 基礎上提供一種能夠快速檢測枳殼中化學成分含量的RP-HPLC法。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了如下的技術方案：
[0007] 枳殼中兩種黃酮的質(zhì)量檢測方法，所述質(zhì)量檢測方法為高效液相色譜法，色譜條 件和檢測條件如下：
[0008] 流動相：甲醇-水，體積比為（45-60) : (40-55)
[0009] 流速：0· 5-1. 5mL · mirf1
[0010] 柱溫：25.0 °C
[0011] 進樣量：10-30 μ L
[0012] 檢測波長：200- 400nm ;
[0013] 供試品溶液的制備：精密稱取枳殼藥材粉末（50-100目篩）適量，以甲醇作為提取 溶劑，溶劑用量為藥材質(zhì)量的10倍（g/ml)，回流提取2-4次，提取時間均為0. 5-1. 5h，將提 取液合并，過濾，濃縮至干，用色譜甲醇溶解并定容至指定體積，過微孔濾膜，取續(xù)濾液作為 供試品溶液；
[0014] 對照品溶液的制備：精密稱取對照品5,6, 7, 3' ，4'-五甲氧基黃酮和 5,7,8,3'，4'-五甲氧基黃酮適量，置于容量瓶中，用色譜甲醇定容配制成濃度均為 0· 10-0. 30mg · ml/1的混合對照品溶液。
[0015] 進一步地，上述的質(zhì)量檢測方法，色譜條件和檢測條件如下：
[0016] 色譜儀：Agilentl200HPLC，二極管陣列檢測器
[0017] 色譜柱：Acchrom Unitary C18Column (4. 6 X 250mm，5 μ m)
[0018] 流動相：甲醇-7jC，體積比為52 :48
[0019] 流速：1. OmL · mirT1
[0020] 柱溫：25. 0°C
[0021] 進樣量：20 μ L
[0022] 檢測波長：310nm。
[0023] 更進一步地，上述的質(zhì)量檢測方法中，
[0024] 供試品溶液的制備：精密稱取枳殼藥材粉末（80目篩）適量，以甲醇作為提取溶 齊U，溶劑用量為藥材質(zhì)量的1〇倍（g/ml)，回流提取3次，提取時間分別為1. 5h、1. 0h、0. 5h， 將提取液合并，過濾，濃縮至干，用色譜甲醇溶解并定容至指定體積，過〇. 22 μ m微孔濾膜， 取續(xù)濾液作為供試品溶液。
[0025] 更進一步地，上述的質(zhì)量檢測方法中，
[0026] 對照品溶液的制備：精密稱取對照品5, 6, 7, 3'，4'-五甲氧基黃酮2. 64mg和 5,7,8,3'，4'-五甲氧基黃酮2.54mg，置于同一個10mL的容量瓶中，用色譜甲醇定容配 制成濃度分別為〇. 26mg · ml/1和0. 25mg · ml/1的混合對照品溶液。
[0027] 本發(fā)明所用到的對照品5, 6, 7, 3'，4'-五甲氧基黃酮和5, 7, 8, 3'，4'-五 甲氧基黃酮均為自制，其中，5,6,7,3' ，4'-五甲氧基黃酮的純度為98.7%， 5,7,8,3'，4'-五甲氧基黃酮的純度為97.9%。5,6,7,3'，4'-五甲氧基黃酮和 5, 7, 8, 3'，4'-五甲氧基黃酮的制備方法如下：
[0028] (1)提取
[0029] 取干燥的枳殼藥材，粉碎，采用加熱回流的方式提取，提取溶劑為乙醇，提取2-4 次，然后合并提取液，過濾，減壓濃縮，得到粗提取物；
[0030] (2)分離
[0031] 將粗提取物，用流動相1作為洗脫液進行硅膠柱層析分離，TCL檢驗流份，收集合 并組分相同的流份，回收溶劑，得到2個部分，其中第二部分含較大量的5, 6, 7, 3'，4'-五 甲氧基黃酮和5, 7, 8, 3'，4'-五甲氧基黃酮；
[0032] (3)純化
[0033] 將步驟（2)所得2個部分分別反復純化，得到10個化合物，分別是A為檸檬苦 素、B為β-谷甾醇、C為川陳皮素即5,6,7,8,3'，4'-六甲氧基黃酮、D為諾米林、E為 甜橙素即5, 6, 7, 3'，4'-五甲氧基黃酮、F為柚皮素即5, 7, 4'-三羥基二氫黃酮、G為 5,7,8,4'-四甲氧基黃酮、Η為3,5,7,8,3'，4'-六甲氧基黃酮、I為5,7,8,3'，4'-五 甲氧基黃酮、J為胡蘿卜苷。
[0034] 步驟（1)中，作為提取溶劑的乙醇的體積分數(shù)為60% -90%，提取三次的提取溶劑 體積用量均為藥材質(zhì)量的20-30倍（g/ml)，提取時間均為0. 5-2h ;其中，優(yōu)選地，作為提取 溶劑的乙醇的體積分數(shù)為80%，提取三次的提取溶劑體積用量分別為藥材質(zhì)量的10倍、8 倍、8倍（g/ml)，提取時間分別為1. 5h、l. Oh、l. Oh。
[0035] 步驟（3)中的純化方法選自下列方法中的一種或幾種：用流動相1進行硅膠層析 分離、用流動相2作為洗脫液進行0DS柱層析分離、用流動相3進行0DS柱層析分離、用流 動相4進行0DS柱層析分離、用流動相5作為洗脫液進行0DS柱層析分離、用流動相6作為 洗脫液進行硅膠柱層析分離、用流動相8作為洗脫液通過制備色譜儀進行分離、用流動相9 為洗脫液通過制備型高效液相色譜儀進行分離或用甲醇重結晶。
[0036] 上述步驟⑵和⑶中，流動相1是體積比為1 :15的乙酸乙酯-石油醚、流動相 2是體積比為1 :3的水-甲醇、流動相3是體積比為1. 5 :1的水-丙酮、流動相4是體積比 為1. 5 :1的水-甲醇、流動相5是體積比為2 :1的水-丙酮、流動相6是體積比為1. 5 :1二 氯甲烷的-石油醚、流動相8是82%的甲醇-水、流動相9是62%的甲醇-水。
[0037] 本發(fā)明利用波譜學手段，結合理化性質(zhì)并查閱相關文獻，共分離鑒定了 10個單體 化合物，其中諾米林即（D)、3, 5, 7, 8, 3'，4'-六甲氧基黃酮（H)和5, 7, 8, 3'，4'-五 甲氧基黃酮（I)是首次從枳殼中分離得到；本發(fā)明主要的貢獻是建立了枳殼藥材中甜橙素 即5,6,7,3'，4'-五甲氧基黃酮（E)和5,7,8,3'，4'-五甲氧基黃酮⑴的HPLC含 量測定方法，為完善枳殼藥材的質(zhì)量標準以及枳殼的開發(fā)利用提供了新的科學依據(jù)。通過 本發(fā)明的檢測方法，測得枳殼中化合物5,6,7,3'，4'-五甲氧基黃酮（E)的平均含量為 0.161^1_ 1，化合物5,7,8,3'，4'-五甲氧基黃酮（1)的平均含量為0.02411^1_1。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0039] 圖1是枳殼藥材的HPLC圖（I )和對照品化合物E和I的HPLC圖（II );
[0040] 圖2是化合物5, 6, 7, 3'，4'-五甲氧基黃酮（E)的紫外譜圖；
[0041] 圖3是化合物5, 7, 8, 3'，4'-五甲氧基黃酮（I)的紫外譜圖；
[0042] 圖4是兩種化合物在不同溶劑中的峰值；
[0043] 圖5是不同提取方法時兩種化合物的峰值；
[0044] 圖6是不同溶劑體積時兩種化合物的峰值；
[0045] 圖7是兩種對照品化合物的線性關系曲線。

【具體實施方式】
[0046] 以下結合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優(yōu)選實 施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0047] -、枳殼中化學成分的提取、分離和純化
[0048] 1、藥材與試劑
[0049] 藥材
[0050] 化學成分的提取、分離和純化用藥材購于河北安國。
[0051] 試劑
[0052] 乙酸乙酯、石油醚、乙醇、氯仿、二氯甲烷、甲醇、丙酮、無水乙醇，以上試劑均購于 北京化工廠，均為分析純；色譜甲醇購于Sigma-Aldrich公司。
[0053] 薄層層析展開劑
[0054] 正相薄層層析的展開劑一般為：氯仿-甲醇（15 :1)、石油醚-乙酸乙酯（5 :1);
[0055] 反相薄層層析的展開劑一般為：丙酮-水（3:1)、甲醇-水（5:1)。
[0056] 顯色劑
[0057] 5%硫酸-乙醇溶液（105°C加熱顯色）
[0058] 2、化學成分的提取和分離
[0059] (一）提取
[0060] 取20. 0kg干燥的枳殼藥材，粉碎，采用加熱回流的方式提取，提取溶劑為80%乙 醇，溶劑的用量分別為藥材質(zhì)量的10倍，8倍，8倍，提取三次，提取時間分別為1. 5h、l. Oh、 1. 〇h，合并提取液，過濾，減壓濃縮，得到粗提取物3. 0kg。
[0061](二）分離、純化
[0062] 將3. 0kg粗提取物，用流動相1作為洗脫液進行硅膠柱層析分離。TCL檢驗流份， 收集合并組分相同的流份，回收溶劑，得到第一部分和第二部分，其中第二部分通過TCL檢 測含有較大量的5, 6, 7, 3'，4'-五甲氧基黃酮和5, 7, 8, 3'，4'-五甲氧基黃酮。
[0063] (1)第一部分的分離
[0064] 將第一部分用流動相1作為洗脫液進行硅膠柱層析分離，將最先得到的含有大量 一個相同流份的部分收集，然后用流動相2作為洗脫液進行0DS柱層析分離，得到化合物 B(900mg)。將最后得到的同時含有大量兩個相同流份的部分收集，然后用流動相1進行硅 膠層析分離，得到兩個部分，然后再分別用流動相3,流動相4進行0DS柱層析分離，分別得 到化合物 A (298mg)，D (30mg)。
[0065] (2)第二部分的分離
[0066] 將第二部分用流動相1作為洗脫液進行硅膠柱層析分離，按照從色譜柱中流出的 先后順序，收集得到LfL77個的部分，這7個部分分別含有大量相同的流份。將U用流動 相3作為洗脫液進行0DS柱層析分離，得到化合物C(85mg)。將L 3用流動相5作為洗脫液 進行0DS柱層析分離，得到化合物E (370mg)。將L4用流動相6作為洗脫液進行硅膠柱層析 分離，然后再用流動相7作為洗脫液進行0DS柱層析分離得到化合物F(l. 0g)。將L5用流 動相8作為洗脫液，用制備色譜儀進行分離，得到G(151mg)和H(18mg)兩個化合物。將L 6 用流動相9作為洗脫液，用制備型高效液相色譜儀進行分離，得到化合物I (83mg)。將L7用 甲醇等試劑重結晶，得到化合物J(l. 〇g)。
[0067] 二、化學成分的結構鑒定
[0068] 化合物A的結構分析
[0069] 化合物A是白色粉末，易溶于氯仿等有機溶劑，熔點為：297. 5?298. 5°C。Molish 反應呈現(xiàn)陰性，表明該化合物分子中不含糖。
[0070] ESI-MS :m/z471. 2[M+H]+，提示該化合物的分子量是 470. 2。
[0071] 化合物A的13C NMR(CDC13,150MHz)譜共給出26個碳信號，結合DEPT譜可知， 分子中含有4個甲基信號（分別是δ C30. 15, 21. 37, 20. 68,17.61) ;5個亞甲基信號（分 別是 SC65.34,36.38,35.65,30.81，18.90) ;8 個次甲基信號（分別是 SC143.22，14L 11， 109·66,79·14,77·79,60·53,53·85,48·10);其余 9 個為季碳信號（分別是 SC206.09， 169. 08,166. 60,119. 98,80. 29,65. 69,51. 32,45. 93,37. 94) 〇
[0072] 1H NMR(CDC13,600MHz)譜中 δΗ1· 296 (3H，s)，l. 181 (3H，s)，l. 181 (3H，s)， 1. 077 (3H，s) 4組質(zhì)子信號的存在可進一步證實分子中含有4個甲基。亞甲基信號δ C65. 34 可能與氧相連。在次甲基信號中，SC79. 14, 77. 79, 53. 85可能分別是與氧或者羰基相連的 碳信號。在季碳信號中，SC206. 09是羰基碳信號，δ C169. 08,166. 60可能是酯基上的羰 基碳信號，3 080.29,65.69可能是與氧相連的碳信號，6 045.93可能是與羰基相連的碳信 號。
[0073] 低場端δ C143. 22,141. 11，119. 98,109. 66可能是雙鍵碳信號，結合DEPT譜可知， δ C119. 98是季碳信號，其余均為次甲基信號，由此提示分子中可能含有呋喃環(huán)。1H NMR譜 中δ Η7· 417 (1H，s)，7· 402 (1H，s)，6· 343 (1H，s) 3組質(zhì)子信號的出現(xiàn)，進一步證實分子中含 有呋喃環(huán)。
[0074] 根據(jù)以上13C NMR和1H NMR信號的分析，初步推斷化合物A為檸檬苦素類化合物， 經(jīng)與文獻對照，確認該化合物是朽1檬苦素（Limonin，C 26H3CI08)，結構式如下：
[0075]

【權利要求】
1. 枳殼中兩種黃酮的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述質(zhì)量檢測方法為高效液相色譜 法，色譜條件和檢測條件如下： 流動相：甲醇-水，體積比為（45-60) : (40-55) 流速：〇· 5-L 5mL · min-1 柱溫：25. 0°C 進樣量：10-30 μ L 檢測波長：200- 400nm ; 供試品溶液的制備：精密稱取50-100目枳殼藥材粉末適量，以甲醇作為提取溶劑，溶 劑用量為藥材質(zhì)量的10倍（g/ml)，回流提取2-4次，提取時間均為0. 5-1. 5h，將提取液合 并，過濾，濃縮至干，用色譜甲醇溶解并定容至指定體積，過微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品 溶液； 對照品溶液的制備：精密稱取對照品5, 6, 7, 3 '，4 '-五甲氧基黃酮和 5,7,8,3'，4'-五甲氧基黃酮適量，置于容量瓶中，用色譜甲醇定容配制成濃度均為 0· 10-0. 30mg · ml/1的混合對照品溶液。
2. 如權利要求1所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，色譜條件和檢測條件如下： 色譜儀：Agilentl200HPLC，二極管陣列檢測器 色譜柱：Acchrom Unitary C18Column (4.6 X 250mm，5 μ m) 流動相：甲醇-7jC，體積比為52 :48 流速：1. OmL · min-1 柱溫：25. 0°C 進樣量：20 μ L 檢測波長：310nm。
3. 如權利要求1或2所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于： 供試品溶液的制備：精密稱取80目枳殼藥材粉末適量，以甲醇作為提取溶劑，溶劑用 量為藥材質(zhì)量的10倍（g/ml)，回流提取3次，提取時間分別為1. 5h、l. 0h、0. 5h，將提取液 合并，過濾，濃縮至干，用色譜甲醇溶解并定容至指定體積，過0. 22 μ m微孔濾膜，取續(xù)濾液 作為供試品溶液。
4. 如權利要求1或2所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于： 對照品溶液的制備：精密稱取對照品5,6,7,3'，4'-五甲氧基黃酮2.64mg和 5, 7, 8, 3'，4'-五甲氧基黃酮2. 54mg，置于同一個10mL的容量瓶中，用色譜甲醇定容配 制成濃度分別為〇. 26mg · ml/1和0. 25mg · ml/1的混合對照品溶液。
【文檔編號】G01N30/88GK104280497SQ201410348362
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年7月22日 優(yōu)先權日:2014年7月22日
【發(fā)明者】金永日, 李緒文, 李敏, 楊潔, 李蘭杰, 臧慧明, 陳妍心 申請人:吉林大學