大豆事件mon89788和檢測(cè)它的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了包含轉(zhuǎn)化事件MON89788的大豆植物和種子，以及這些事件獨(dú)特的DNA分子。本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中這些DNA分子的存在的方法。
PTA-6708
2005.05.11
【專利說(shuō)明】大豆事件M0N89788和檢測(cè)它的方法
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年5月25日、申請(qǐng)?zhí)枮?00680027513. 5、發(fā)明名稱為"大 豆事件M0N89788和檢測(cè)它的方法"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 本申請(qǐng)要求2005年5月27日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0. 60/685, 584的優(yōu)先權(quán)，通 過(guò)引用將其完整公開內(nèi)容合并在此。
[0004] 1.發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及新的和獨(dú)特的轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化事件，稱為M0N89788,由此衍生的大豆 品種，以及其植物部分、種子和產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)植物部分提取物或種子提取物 中特異于M0N89788的DNA分子存在的分析。
[0006] 2?相關(guān)領(lǐng)域的說(shuō)明
[0007] 大豆（Glycine max)是世界的許多區(qū)域中的重要作物。已經(jīng)將生物技術(shù)方法應(yīng)用 于大豆用于改善產(chǎn)品的農(nóng)業(yè)性狀和品質(zhì)。大豆生產(chǎn)中的一種這樣的重要農(nóng)學(xué)性狀是除草劑 耐受性，特別是對(duì)草甘膦除草劑的耐受性。除草劑耐受性大豆事件將是對(duì)于管理雜草有用 的性狀。
[0008] N-磷酰甲基甘氨酸，也稱為草甘膦，是一種在廣譜的植物品種上具有活性的公知 的除草劑。草甘膦是Roundup?(Monsanto Co.，St. Louis，M0)的活性成分，是在環(huán)境中 具有理想的短半衰期的安全的除草劑。當(dāng)施用到植物表面時(shí)，草甘膦在植物中全身性地移 動(dòng)。由于其對(duì)莽草酸途徑的抑制，草甘膦是植物毒性的，莽草酸途徑提供了用于合成芳香族 氨基酸的前體。草甘膦抑制在植物中發(fā)現(xiàn)的5-烯醇丙酮-3-磷酸莽草酸合酶（EPSPS)。
[0009] 草甘膦耐受性可以通過(guò)EPSPS變體的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述EPSPS變體具有對(duì)草 甘膦的更低親和性，并因而在存在草甘膦的情況下保持了它們的催化活性（美國(guó)專利 N0. 5, 633, 435 ;5, 094, 945 ;4, 535, 060和6, 040, 497)。在植物組織中降解草甘膦的酶（美 國(guó)專利No. 5, 463, 175)也能夠賦予對(duì)草甘膦的細(xì)胞耐受性。這些基因被用于耐受草甘膦 的轉(zhuǎn)基因作物的生產(chǎn)，因而容許以作物損害的最小牽涉將草甘膦用于有效的雜草控制。例 如，草甘膦耐受性已經(jīng)被遺傳工程化到玉米（美國(guó)專利No. 5, 554, 798)、小麥（美國(guó)專利 6, 689, 880)、棉花（美國(guó)專利6, 740, 488)、大豆（TO 9200377)和canola(美國(guó)專利申請(qǐng) 20040018518)中。關(guān)于草甘膦耐受性的轉(zhuǎn)基因以及關(guān)于對(duì)其他除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因， 例如 bar 基因（Toki et al.，1992;Thompson et al.，1987;phosphinothricin 轉(zhuǎn)乙醜酶 (DeBlock et al. ,1987)，關(guān)于對(duì)glufosinate除草劑的耐受性）作為可選擇標(biāo)記物或可計(jì) 分標(biāo)記物也是有用的，并且可以提供有用的表型，用于選擇與其他農(nóng)業(yè)上有用性狀聯(lián)系的 植物。
[0010] 已知在植物中外源基因表達(dá)受到它們的染色體位置的影響，也許是由于染色質(zhì)結(jié) 構(gòu)（例如，異染色質(zhì)）或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件（例如，增強(qiáng)子）靠近整合位點(diǎn)的鄰近（Weising et al.，1988)。為此，常常必須篩選大量的事件來(lái)鑒定以導(dǎo)入的目標(biāo)基因的最優(yōu)表達(dá)為特征的 事件。例如，已經(jīng)在植物和其他有機(jī)體中觀察到在事件之中可能存在著在導(dǎo)入的基因的表 達(dá)水平上的廣泛變動(dòng)。在表達(dá)的空間或時(shí)間模式上也可能存在差異，例如，在各種植物組織 中轉(zhuǎn)基因的相對(duì)表達(dá)的差異，其可能不相應(yīng)于根據(jù)導(dǎo)入的基因構(gòu)建體中存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元 件所預(yù)期的模式。為此，普遍的是生產(chǎn)數(shù)百到數(shù)千個(gè)不同的事件并從這些事件中篩選出具 有用于商業(yè)目的的期望的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和模式的單一事件。具有期望的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平 或模式的事件對(duì)于利用常規(guī)育種方法通過(guò)有性異型雜交將轉(zhuǎn)基因滲入到其他的遺傳背景 中是有用的。這種雜交的子代維持了原始轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)特征。這種策略被用于在許 多品種中確?？煽康幕虮磉_(dá)，這些品種很好的適應(yīng)了當(dāng)?shù)氐纳L(zhǎng)條件。
[0011] 能夠檢測(cè)特定事件的存在以確定有性雜交的子代是否包含目標(biāo)轉(zhuǎn)基因?qū)⑹怯幸?的。此外，檢測(cè)特定事件的方法對(duì)于遵守需要上市前批準(zhǔn)和對(duì)來(lái)源于重組農(nóng)作物的食物的 標(biāo)記，比方說(shuō)，是很有幫助的。通過(guò)任何公知的多核酸檢測(cè)方法例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR) 或利用多核酸探針的DNA雜交，有可能檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的存在。這些檢測(cè)方法通常集中于經(jīng)常 使用的遺傳元件，例如啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因等等。結(jié)果，除非鄰近于插入的轉(zhuǎn)基因DNA 的染色體DNA( "側(cè)翼DNA"）的序列是已知的，這種方法對(duì)于辨別不同的事件，特別是那些 利用相同的DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的事件可能是沒(méi)有用的。已經(jīng)討論了事件特異性的PCR分析， 例如，Winde 1 s等（1999)，他們利用跨越了插入轉(zhuǎn)基因和側(cè)翼DNA之間的交界的引物集， 特別是一個(gè)包括來(lái)自插入物的序列的引物以及包括來(lái)自側(cè)翼DNA的序列的第二引物，通過(guò) PCR鑒別了草甘膦耐受的大豆事件40-3-2。轉(zhuǎn)基因植物事件特異性DNA檢測(cè)方法也已經(jīng)在 美國(guó)專利 N0. 6, 893, 826 ;6, 825, 400 ;6, 740, 488 ;6, 733, 974 和 6, 689, 880 ;6, 900, 014 和 6, 818, 807中描述，通過(guò)完全引用將它們合并在此。
[0012] 本發(fā)明涉及草甘膦耐受性大豆事件M0N89788(也稱為M0N19788或GM_A19788)，并 涉及這些大豆植物中含有的DNA分子，其在來(lái)自M0N89788的植物和其子代以及植物組織的 檢測(cè)方法中是有用的。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 本發(fā)明提供了稱為M0N89788(也稱為M0N19788)的大豆轉(zhuǎn)基因事件和其子代，具 有以登記號(hào)No.PTA-6708在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏所（ATCC)保藏的代表性的種子。本發(fā)明 的另一個(gè)方面是大豆事件M0N89788的植物和種子的植物細(xì)胞或可再生部分。本發(fā)明并且 包括大豆事件M0N89788的植物部分，其包括但不限于細(xì)胞、花粉、胚珠、花、芽、根、葉和來(lái) 自M0N89788的產(chǎn)物，例如大豆餅、粉和油。
[0015] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供了組合物和方法，用于檢測(cè)來(lái)自大豆事件M0N89788植物 或種子，或來(lái)自植物部分或種子的產(chǎn)物的DNA轉(zhuǎn)基因/基因組連接區(qū)的存在。提供了 DNA分 子，其包含選自由SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2、以及其互補(bǔ)物構(gòu)成的組的至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因 /基因組連接DNA分子，其中連接分子跨越插入位點(diǎn)和基因組DNA，所述插入位點(diǎn)包含插入 到大豆細(xì)胞基因組中的異源DNA，所述基因組DNA來(lái)自大豆細(xì)胞、側(cè)翼于插入位點(diǎn)大豆事件 M0N89788。在本發(fā)明的一個(gè)方面，這種連接序列可以定義為分別包含SEQ ID N0:9的核苷酸 1093-1113或5396-5416。在本發(fā)明的其他方面，接點(diǎn)可以定義為包括例如側(cè)翼基因組和轉(zhuǎn) 基因的其他部分，并可以定義為包含由SEQ ID N0:9的1073-1113、1043-1113、1093-1133、 1093-1163、1043-1163、5376-5416、5346-5416、5396-5436、5396-5416、5396-5466 或 5346-5466所給出的一個(gè)或多個(gè)序列。這些序列以及包含這些序列的植物和種子因而形成 了本發(fā)明的一個(gè)方面。
[0016] 提供了新的DNA分子，其是來(lái)自大豆事件M0N89788的DNA轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)域 SEQ ID NO :3或其互補(bǔ)物。在其基因組中包含SEQ ID NO :3的大豆植物和種子是本發(fā)明的 一個(gè)方面。SEQ ID N0:3進(jìn)一步包含完整的SEQ ID N0:1。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了 DNA分子，其是DNA轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)域SEQ ID N0:4或其互補(bǔ)物，其中這個(gè)DNA分子在大豆事件M0N89788中是新的。在其基因組中包含 SEQ ID N0:4的大豆植物和種子是本發(fā)明的一個(gè)方面。SEQ ID N0:4進(jìn)一步包含完整的SEQ ID N0 :2。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了兩個(gè)核酸分子用于DNA檢測(cè)方法中，其中第一 核酸分子包含SEQ ID N0 :3的DNA分子的轉(zhuǎn)基因區(qū)域的任何部分的至少11個(gè)或更多個(gè)連 續(xù)多核苷酸，第二核酸是SEQ ID N0 :3的5'側(cè)翼大豆基因組DNA區(qū)域的任何部分的類似 長(zhǎng)度的分子，其中這些核酸分子在一起使用時(shí)在產(chǎn)生擴(kuò)增子的DNA擴(kuò)增方法中作為引物是 有用的。在DNA擴(kuò)增方法中使用這些引物產(chǎn)生的擴(kuò)增子對(duì)于大豆事件M0N89788DNA是診斷 性的。通過(guò)所描述的引物產(chǎn)生的擴(kuò)增子是本發(fā)明的一個(gè)方面，所述引物同源于或互補(bǔ)于包 含 SEQ ID N0 :1 的 SEQ ID N0 :3 的一部分。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了兩個(gè)核酸分子用于DNA檢測(cè)方法中，其中第一 核酸分子包含SEQ ID N0 :4的DNA分子的轉(zhuǎn)基因區(qū)域的任何部分的至少11個(gè)或更多個(gè)連續(xù) 多核苷酸，第二核酸是SEQ ID N0 :4的3'側(cè)翼大豆基因組DNA的任何部分的類似長(zhǎng)度，其 中這些核酸分子在一起使用時(shí)在產(chǎn)生擴(kuò)增子的DNA擴(kuò)增方法中作為引物是有用的。在DNA 擴(kuò)增方法中使用這些引物產(chǎn)生的擴(kuò)增子對(duì)于大豆事件M0N89788DNA是診斷性的。通過(guò)所描 述的引物產(chǎn)生的擴(kuò)增子是本發(fā)明的一個(gè)方面，所述引物同源于或互補(bǔ)于包含SEQ ID N0 :2 的SEQ ID NO :4的一部分。
[0020] 來(lái)自SEQ ID N0 :3或SEQ ID N0 :4,或SEQ ID N0 :9或其互補(bǔ)物的任何核酸引物對(duì) 是本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，所述引物對(duì)當(dāng)用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生對(duì)大豆事件M0N89788 衍生的組織為診斷性的擴(kuò)增子，例如分別包含SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2,或SEQ ID N0: 9的任何部分的擴(kuò)增子。在特定的實(shí)施方式中，所述引物對(duì)可以由引物A(SEQ ID NO :5)和 引物 D (SEQ ID NO :8)組成。
[0021] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是大豆植物、或種子、或來(lái)自包含事件M0N89788的植物或種 子的產(chǎn)物，其中當(dāng)從所述大豆植物、或種子、或產(chǎn)物分離時(shí)，所述基因組DNA在包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的DNA擴(kuò)增方法中產(chǎn)生擴(kuò)增子。
[0022] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是大豆植物、或種子、或來(lái)自包含事件M0N89788的植物或種 子的產(chǎn)物，其中當(dāng)從所述大豆植物、或種子、或產(chǎn)物分離時(shí)，所述基因組DNA在DNA擴(kuò)增方法 中擴(kuò)增子，其中DNA引物分子SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6被用于所述DNA擴(kuò)增方法中。
[0023] 本發(fā)明的又一個(gè)方面是包含M0N89788的大豆植物、種子、產(chǎn)物或來(lái)自所述植物或 種子的商品，其中當(dāng)基因組DNA從所述大豆植物、或種子、或產(chǎn)物分離時(shí)，在DNA擴(kuò)增方法中 產(chǎn)生擴(kuò)增子，其中DNA引物分子SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8用于所述DNA擴(kuò)增方法中。 所述產(chǎn)物或商品可以包含，無(wú)限制地，食物或飼料產(chǎn)品，其包含或來(lái)源于包含事件M0N89788 的大豆植物的一種或多種以下產(chǎn)物：卵磷脂、脂肪酸、甘油、固醇、食用油、脫脂大豆片、包括 脫脂的和烘烤的大豆粉的大豆粉、豆?jié){凝塊、豆腐、大豆粉、大豆蛋白濃縮物、分離的大豆蛋 白、水解植物蛋白、組織化大豆蛋白和大豆蛋白纖維。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了檢測(cè)樣品中特異地相應(yīng)于大豆事件 M0N89788DNA的DNA存在的方法。這種方法包括：(a)使包含DNA的樣品與DNA引物對(duì)接 觸；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生擴(kuò)增子；和（c)檢測(cè)所述擴(kuò)增子，其中所述擴(kuò)增子包含 SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2。包含DNA引物分子的試劑盒是本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，所述 DNA引物當(dāng)用于DNA擴(kuò)增方法時(shí)產(chǎn)生包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的擴(kuò)增子。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了檢測(cè)樣品中特異地相應(yīng)于大豆事件 M0N89788DNA的DNA存在的方法。這種方法包括：（a)使包含DNA的樣品與探針接觸，所述探 針在嚴(yán)格雜交條件下與來(lái)自大豆事件M0N89788的基因組DNA雜交并且在嚴(yán)格雜交條件下 不與對(duì)照大豆植物DNA雜交；(b)將所述樣品和探針置于嚴(yán)緊雜交條件下；和（c)檢測(cè)探針 對(duì)大豆事件M0N89788DNA的雜交，其中所述探針包含SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2。所述樣 品可以包括包含大豆事件M0N89788的子代種子、植物或植物部分，或來(lái)自包含M0N89788的 植物的任何以下的產(chǎn)物：卵磷脂、脂肪酸、甘油、固醇、食用油、脫脂大豆片、包括脫脂的和烘 烤的大豆粉的大豆粉、豆?jié){凝塊、豆腐、大豆粉、大豆蛋白濃縮物、分離的大豆蛋白、水解植 物蛋白、組織化大豆蛋白和大豆蛋白纖維。包含DNA探針的試劑盒是本發(fā)明的進(jìn)一步的方 面，所述探針包含同源于或互補(bǔ)于SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2的DNA分子。包含DNA分 子的試劑盒也是本發(fā)明的一方面，所述DNA分子包含SEQ ID N0 :18、SEQ ID N0 :19或SEQ ID NO :20,或它們的互補(bǔ)物。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了產(chǎn)生耐受草甘膦施用的大豆植物的方法，包括 步驟：使包含事件M0N89788的第一親本草甘膦耐受性大豆植物與缺乏草甘膦耐受性的第 二親本大豆植物有性雜交，從而產(chǎn)生多個(gè)子代植物；和（b)選擇耐受草甘膦施用的子代植 物。育種方法可以另外包括步驟：使包含大豆事件M0N89788的親本植株與對(duì)草甘膦也是耐 受性的第二親本大豆植物雜交，以及通過(guò)與每個(gè)親本中發(fā)現(xiàn)的草甘膦耐受性表型遺傳性聯(lián) 系的分子標(biāo)記DNA來(lái)選擇草甘膦耐受性子代。
[0027] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是在包含M0N89788的大豆植物的田地中控制雜草的方法， 其中所述方法包括使用包含事件M0N89788的大豆種子種植田地，所述代表性的種子作為 ATCC登記號(hào)NO. PTA-6708保藏，容許所述種子萌芽，以及使用有效劑量的草甘膦處理所述 植物來(lái)控制所述田地中的雜草生長(zhǎng)。
[0028] 本發(fā)明的上述及其他方面將根據(jù)以下的詳細(xì)說(shuō)明和附隨的附圖變得更為顯而易 見。
[0029] 附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0030] 附圖1.在包含事件M0N89788的大豆植物的基因組中轉(zhuǎn)基因插入物的結(jié)構(gòu)。
[0031] 附圖2A-2B?來(lái)自大豆的商品產(chǎn)物的加工。
[0032] 詳細(xì)說(shuō)明
[0033] 本發(fā)明涉及提供了草甘膦耐受性的稱為M0N89788的新的大豆轉(zhuǎn)化事件，以及所 述植物部分和種子和從植物、植物部分、種子產(chǎn)生的產(chǎn)物，以及包含所述事件的產(chǎn)物。本發(fā) 明提供了在包含M0N89788的大豆細(xì)胞的基因組中是新的的DNA分子，以及可以用于各種 DNA檢測(cè)方法以鑒定樣品中的M0N89788DNA的DNA分子。本發(fā)明提供了在含有M0N89788 的植物的田地中控制雜草的方法，通過(guò)使用草甘膦除草劑處理包含植物的所述田地中的雜 草，所述植物包含事件M0N89788。
[0034] 提供以下定義和方法來(lái)更好地定義本發(fā)明和指導(dǎo)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員實(shí)施本 發(fā)明。除非另作說(shuō)明，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)的用法來(lái)理解術(shù)語(yǔ)。分子生物學(xué) 中的常見術(shù)語(yǔ)的定義也可以在Rieger et al. (1991)和Lewin(1994)中找到。使用如 37CFR § 1. 822中闡述的DNA堿基命名法。
[0035] 如在此使用的，術(shù)語(yǔ)"大豆"是指Glycine max，并且包括可以與大豆培育的所有植 物品種。
[0036] 如在此使用的，術(shù)語(yǔ)"包含"是指"包括但不限于"。
[0037] "草甘膦"是指N-膦酰甲基甘氨酸和它的鹽，是Roundup?除草劑 (Monsanto Co.)的活性成分。用"草甘膦除草劑"處理是指使用Roundup?、 RoundupUltra?、RoundupPro?、除草劑或含有草甘膦的任何其他除草劑制 劑處理。草甘膦的商業(yè)制劑的實(shí)例包括，無(wú)限制地，由Monsanto Company作為 ROUNDUP?、ROUNDUP?ULTRA、ROUNDUP?ULTRAMAX、ROUNDUP? CT、ROUNDUP?EXTRA、ROUNDUP?BIACTIVE、ROUNDUP?BIOFORCE、 RODEO?、POLARIS?、SPARK?知ACCORD?除草劑出售的那些，所有這 些都含有草甘膦作為其異丙胺鹽；ROUNDUP?WEATHERMAX(草甘膦鉀鹽），由Monsanto Company作為ROUNDUP?DRY和RIVAL?除草劑出售的那些，其含有草甘膦作為其 銨鹽；由Monsanto Company作為ROUNDUP?GE0F0RCE出售的那些，其含有草甘膦作 為其鈉鹽；以及由Syngenta Crop Protection作為TOUCHDOWN?除草劑出售的，其 含有草甘膦作為其三甲基磺酸鹽。使用任何這些草甘膦除草劑制劑處理包含了包含事件 M0N89788的草甘膦耐受性大豆植物的田地將控制所述田地中的雜草生長(zhǎng)，并且不影響包含 M0N89788的大豆植物的生長(zhǎng)或產(chǎn)量。
[0038] 通過(guò)用異源DNA，S卩，包括目標(biāo)轉(zhuǎn)基因的核酸構(gòu)建體對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，由轉(zhuǎn)基 因插入到植物基因組中產(chǎn)生的植物群體的再生，和選擇以對(duì)特定基因組位置的插入為特征 的特定的植物，來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因"事件"。術(shù)語(yǔ)"事件"指包括異源DNA的原始轉(zhuǎn)化體和該轉(zhuǎn)化 體的子代。術(shù)語(yǔ)"事件"還指通過(guò)在轉(zhuǎn)化體和另一個(gè)包括異源轉(zhuǎn)基因DNA和側(cè)翼基因組DNA 的品種之間進(jìn)行有性的異型雜交生產(chǎn)的子代。術(shù)語(yǔ)"事件"還指來(lái)自原始轉(zhuǎn)化體的、包含插 入的DNA和緊密鄰近于插入的DNA的側(cè)翼基因組序列的DNA，期待著將其轉(zhuǎn)移到子代中，該 子代做為包括插入的DNA的一個(gè)親本系（例如，原始轉(zhuǎn)化體和自交的子代）與不含有插入 的DNA的親本系進(jìn)行有性雜交的結(jié)果，接受了包括目標(biāo)轉(zhuǎn)基因的插入的DNA。
[0039] 通過(guò)首先使第一親本大豆植物與第二親本大豆植物有性雜交，從而產(chǎn)生多個(gè)第一 子代植物；然后選擇對(duì)草甘膦除草劑的施用是耐受性的子代植物，可以培育草甘膦耐受性 大豆植物，所述第一親本大豆植物由從包含M0N89788的轉(zhuǎn)基因草甘膦耐受性大豆植物生 長(zhǎng)出的大豆植物、或作為表達(dá)草甘膦耐受性表型的這種植物的雜交的子代的大豆植物組 成，所述第二親本植物缺乏對(duì)草甘膦的耐受性。這些步驟可以進(jìn)一步包括使草甘膦耐受性 子代植物與第二親本大豆植物或第三親本大豆植物回交，然后通過(guò)草甘膦施用或通過(guò)與性 狀相關(guān)的分子標(biāo)記物的鑒定來(lái)選擇子代，從而產(chǎn)生耐受草甘膦除草劑施用的大豆植物。可 以使用分子標(biāo)記物，其包含事件M0N89788中轉(zhuǎn)基因的插入的5'和3'位點(diǎn)鑒定出的接點(diǎn) DNA分子。
[0040] 還應(yīng)理解的是，兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物也可以被配對(duì)來(lái)產(chǎn)生含有兩個(gè)獨(dú)立地隔離 的、外源轉(zhuǎn)基因的后代。如早先描述的對(duì)親本植物進(jìn)行回交和用非轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行異型雜 交也是預(yù)期的，無(wú)性繁殖也是同樣的。通常用于不同性狀和作物的其他育種方法的描述可 以在幾份參考文件之一中找到，例如，F(xiàn)ehr，（1987)。
[0041] "探針"是分離的核酸，在上面附有常規(guī)的可檢測(cè)的標(biāo)記或報(bào)告分子，例如，放射性 同位素、配體、化學(xué)發(fā)光劑或酶。這種探針與目標(biāo)核酸的鏈互補(bǔ)，就本發(fā)明來(lái)說(shuō)，與來(lái)自包含 事件M0N89788的大豆植物的基因組DNA鏈互補(bǔ)，不論該基因組DNA是來(lái)自大豆植物或種子 還是來(lái)自包括來(lái)自該事件的DNA的植物或種子的樣品或提取物。根據(jù)本發(fā)明的探針不僅 包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，還包括特異性地與目標(biāo)DNA序列結(jié)合并可用于檢測(cè)該目標(biāo) DNA序列的存在的聚酰胺及其他探針材料。
[0042]"引物"是分離的多核酸，其通過(guò)核酸雜交與互補(bǔ)的目標(biāo)多核酸鏈退火來(lái)形成在引 物和目標(biāo)多核酸鏈之間的雜交體，然后通過(guò)聚合酶，例如DNA聚合酶沿目標(biāo)多核酸鏈延伸。 本發(fā)明的引物對(duì)涉及它們用于目標(biāo)多核酸分子的擴(kuò)增的用途，例如，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)或其他常規(guī)的核酸擴(kuò)增方法。
[0043] 探針和引物的長(zhǎng)度一般是11個(gè)多核苷酸或更多，優(yōu)選的是18個(gè)多核苷酸或更多、 更優(yōu)選的24個(gè)多核苷酸或30個(gè)多核苷酸或更多。這種探針和引物在高度嚴(yán)格雜交條件下 與目標(biāo)分子特異性地雜交。優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明的探針和引物具有與目標(biāo)分子的完全的序 列同一性，然而不同于目標(biāo)序列并且保持了在高度嚴(yán)格條件下與目標(biāo)序列雜交的能力的探 針可以通過(guò)常規(guī)方法設(shè)計(jì)。
[0044]例如，在 Sambrook et al. (1989) ;Ausubel et al. (1992);和 Innis et al. (1990)中描述了制備和使用探針和引物的方法。PCR引物對(duì)（引物集）可以來(lái)自已 知序列，例如，通過(guò)使用為此目的設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)程序，例如Primer (Version 0. 5, ? 1991， Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA) 〇
[0045] 基于在此公開的側(cè)翼基因組DNA和插入物序列的引物和探針（SEQ ID NO :l-4 和9)可以用于通過(guò)常規(guī)方法確認(rèn)，如有必要，用于糾正所公開的序列，例如，通過(guò)從包含 M0N89788的種子保藏物分尚相應(yīng)DNA分子，并確定該分子的核酸序列。其他的相關(guān)DNA分 子可以從包含M0N89788的細(xì)胞的基因組分離，所述DNA分子包含轉(zhuǎn)基因插入物和基因組側(cè) 翼區(qū)域，這些分子的片段可以用作引物或探針。
[0046] 本發(fā)明的核酸探針和引物在嚴(yán)格條件下與目標(biāo)DNA序列雜交?？墒褂萌魏纬Ｒ?guī)的 核酸雜交或擴(kuò)增方法可以用于鑒定樣品中來(lái)自M0N89788事件的DNA的存在。核酸分子或其 片段能夠在某些情況下與其他核酸分子特異性雜交。如此處使用的，如果兩個(gè)核酸分子能 形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)并且有足夠長(zhǎng)度以在高嚴(yán)格條件下維持這種結(jié)構(gòu)，則稱為兩個(gè) 核酸分子能相互特異性地雜交。如果核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱核酸分子是另一 個(gè)核酸分子的"互補(bǔ)物"。如此處使用的，當(dāng)一個(gè)分子的每一個(gè)核苷酸與另一個(gè)分子的核苷 酸互補(bǔ)時(shí)，稱為分子顯示出"完全的互補(bǔ)性"。如果分子的相互雜交具有足夠的穩(wěn)定性以允 許它們?cè)谥辽俪Ｒ?guī)的"低嚴(yán)格"條件下保持相互的退火，稱兩個(gè)分子是"最低度互補(bǔ)的"。類 似地，如果分子的相互雜交具有足夠的穩(wěn)定性以允許它們?cè)诔Ｒ?guī)的"高嚴(yán)格"條件下保持相 互的退火，稱所述分子是"互補(bǔ)的"。Sambrook et al.，1989，and by Haymes et al. (1985) 描述了常規(guī)的嚴(yán)格條件。因而從完全互補(bǔ)性的偏離是可允許的，只要這種偏離不完全地排 除了分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。為了使核酸分子作為引物或探針，僅需在序列中充分的互 補(bǔ)，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0047] 如此處使用的，基本上同源的序列是在高度嚴(yán)格條件下同與其相比較的核酸序列 的互補(bǔ)物特異性的雜交的核酸序列。促進(jìn)DNA雜交的適合的嚴(yán)格條件，例如，6. 0X氯化鈉 /檸檬酸鈉（SSC)約45°C，之后是在50°C用2.0XSSC洗滌，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是公知 的，或可在 Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y. (1989)， 6. 3. 1-6. 3. 6中找到。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴(yán)格的約2. 0XSSC、50°C到 高度嚴(yán)格的約〇. 2 X SSC、50°C。此外，洗滌步驟中的溫度可以從低度嚴(yán)格條件的室溫下約 22°C，升高到高度嚴(yán)格條件的約65°C。溫度和鹽度可以都變化，或者溫度或鹽濃度保持不 變而另一個(gè)變量發(fā)生改變。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸將在中度嚴(yán)格條件下，例如 在約2. 0XSSC和約65°C下特異性地雜交SEQ ID N0:l-4中所列核酸分子、和其9個(gè)互補(bǔ) 物或兩者的片段的一個(gè)或多個(gè)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸將在高度嚴(yán)格條 件下雜交SEQ ID N0 :1-4所列核酸分子、和其9個(gè)互補(bǔ)物或兩者的片段的一個(gè)或多個(gè)。在 本發(fā)明的一個(gè)方面中，本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)記物核酸分子包含如SEQ ID N0 :1或SEQ ID N0: 2所列的核酸序列，或其互補(bǔ)物或兩者的片段。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，本發(fā)明的優(yōu)選的 標(biāo)記物核酸分子與SEQ ID N0 :1或SEQ ID N0 :2中所列核酸序列或其互補(bǔ)物或兩者的片段 享有80%到100%或90%到100%的序列同一性。包含SEQ ID N0 :1或SEQ ID N0 :2,或 其互補(bǔ)物或兩者的片段的分子標(biāo)記物DNA分子可以用作植物育種方法中的標(biāo)記物來(lái)鑒定 遺傳雜交的子代，類似于在Cregan et al. (1997)中對(duì)于單一序列重復(fù)DNA標(biāo)記物分析所 描述的方法，通過(guò)完全引用將它的所有合并在此。探針對(duì)目標(biāo)DNA分子的雜交可以通過(guò)許 多本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行檢測(cè)，這些可包括但不局域于，熒光標(biāo)簽、放射性標(biāo)簽、 基于抗體的標(biāo)簽和化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽。
[0048] 關(guān)于使用特定的擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行目標(biāo)核酸序列的擴(kuò)增（例如，通過(guò)PCR)，"嚴(yán)格條 件"是允許引物對(duì)僅與目標(biāo)核酸序列雜交的條件，具有相應(yīng)的野生型序列（或其互補(bǔ)物）的 引物將與所述目標(biāo)核酸序列結(jié)合，優(yōu)選的在DNA熱擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生獨(dú)特的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增 子。
[0049]術(shù)語(yǔ)"特異于（目標(biāo)序列）"是指探針或引物在嚴(yán)格雜交條件下僅與包含目標(biāo)序列 的樣品中的目標(biāo)序列雜交。
[0050] 如在此使用的，"擴(kuò)增的DNA"或"擴(kuò)增子"是指作為核酸模板的部分的目標(biāo)核酸 序列的核酸擴(kuò)增的產(chǎn)物。例如，為了確定產(chǎn)自有性雜交的大豆植物是否含有轉(zhuǎn)基因事件 M0N89788,或采集自田地的大豆樣品是否包含M0N89788,或大豆提取物，例如粗粉、粉或油 是否包含M0N89788。從大豆植物組織樣品或提取物提取的DNA可以經(jīng)歷使用引物對(duì)的核 酸擴(kuò)增方法，所述引物對(duì)包括來(lái)源于鄰近插入的異源轉(zhuǎn)基因DNA的插入位點(diǎn)的基因組區(qū)域 的引物，和來(lái)源于插入的異源轉(zhuǎn)基因DNA的第二引物，來(lái)產(chǎn)生對(duì)于事件DNA的存在是診斷性 的擴(kuò)增子。擴(kuò)增子具有一定長(zhǎng)度并具有序列，所述序列對(duì)所述事件也是診斷性的。擴(kuò)增子 的長(zhǎng)度可根據(jù)引物對(duì)加上一個(gè)核苷酸堿基對(duì)、或加上約五十個(gè)核苷酸堿基對(duì)，或加上約兩 百五十個(gè)核苷酸堿基對(duì)，或加上約三百五十個(gè)核苷酸堿基對(duì)或更多的組合長(zhǎng)度而變化。
[0051] 做為選擇，引物對(duì)可以來(lái)源于插入的DNA的兩側(cè)的側(cè)翼基因組序列，以產(chǎn)生包括 整個(gè)插入核苷酸序列的擴(kuò)增子。來(lái)自植物基因組序列的引物對(duì)的成員可以被定位在距插入 的轉(zhuǎn)基因DNA分子一定距離上，該距離可以從一個(gè)核苷酸堿基對(duì)到約兩萬(wàn)核苷酸堿基對(duì)間 變化。術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增子"的使用要特別排除可在DNA熱擴(kuò)增反應(yīng)中形成的引物二聚物。
[0052] 可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法的任一種，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)來(lái)實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增。各種擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域已知的，特別地，在美國(guó)專利N0. 4, 683, 195 和4,683,202中，以及在1111118 6七&1.(1990)中描述了。？〇?擴(kuò)增方法已經(jīng)發(fā)展到可擴(kuò)增 多達(dá)22kb的基因組DNA和多達(dá)42kb的噬菌體DNA(Cheng等，et al.，1994)。這些方法以 及本領(lǐng)域的其他DNA擴(kuò)增方法可以用于本發(fā)明的實(shí)踐中。來(lái)自大豆事件M0N89788的異源 DNA插入物的序列或側(cè)翼序列可以通過(guò)利用來(lái)自此處提供的序列的引物從事件基因組中擴(kuò) 增這種分子，然后對(duì)PCR擴(kuò)增子或?qū)Ψ蛛x的克隆轉(zhuǎn)基因/基因組DNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的DNA測(cè)序， 來(lái)證實(shí)，如果有必要，來(lái)糾正。
[0053] 可以提供多種技術(shù)來(lái)檢測(cè)這些方法生產(chǎn)的擴(kuò)增子。一個(gè)這種方法是Genetic Bit Ananlysis (Nikiforov, et al.，1994)，其中設(shè)計(jì)一DNA寡核苷酸，其覆蓋鄰近的側(cè)翼基因 組DNA序列和插入的DNA轉(zhuǎn)基因序列。將寡聚核苷酸固定在微孔平板的孔中。在對(duì)目標(biāo)區(qū) 域進(jìn)行PCR之后（使用在插入的序列中的一個(gè)引物，和在鄰近側(cè)翼基因組序列中的一個(gè)引 物），單鏈PCR產(chǎn)物可與固定的寡聚核苷酸雜交并充當(dāng)模板，用于利用DNA聚合酶和特異于 期待的下一個(gè)堿基的標(biāo)記的ddNTP進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。讀出過(guò)程可以是基于熒光的或基 于ELISA的。信號(hào)指示了由于成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基延伸導(dǎo)致的插入物/側(cè)翼基因組 序列的存在。
[0054] 另一種方法是Winge (2000)描述的Pyrosequencing技術(shù)。在這個(gè)方法中設(shè)計(jì)一 寡核苷酸，其覆蓋鄰近的基因組DNA和插入物DNA接點(diǎn)。使寡核苷酸與來(lái)自目標(biāo)區(qū)域的單 鏈PCR產(chǎn)物（一個(gè)引物在插入的序列中，一個(gè)在側(cè)翼基因組序列中）雜交，在存在DNA聚合 酶、ATP、硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、腺苷酸5'磷酸和螢光素的情況下孵育。 分別地添加DNTPs，測(cè)量產(chǎn)生光信號(hào)的摻入。光信號(hào)指示了由于成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基 或多堿基延伸導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因插入物/側(cè)翼序列的存在。
[0055] Chen等（1999)描述的熒光偏振是可以用于檢測(cè)本發(fā)明的擴(kuò)增子的一種方法。使 用這種方法設(shè)計(jì)一寡核苷酸，其覆蓋基因組側(cè)翼的和插入的DNA接點(diǎn)。使寡核苷酸與來(lái)自 目標(biāo)區(qū)域的單鏈PCR產(chǎn)物（一個(gè)引物在插入的DNA序列中，一個(gè)在側(cè)翼基因組DNA序列中） 雜交，在存在DNA聚合酶和熒光標(biāo)記的ddNTP的情況下孵育。單堿基延伸導(dǎo)致ddNTP的摻 入。利用熒光計(jì)測(cè)量偏振的變化可以測(cè)量摻入。偏振的變化指示了由于成功的擴(kuò)增、雜交 和單堿基延伸導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因插入物/側(cè)翼基因組序列的存在。
[0056] Taqman?(PEApplied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)被描述為一種對(duì)DNA序 列的存在進(jìn)行檢測(cè)和定量的方法，可以根據(jù)廠家提供的說(shuō)明完全理解。簡(jiǎn)要地，設(shè)計(jì)一寡核 苷酸探針，其覆蓋基因組側(cè)翼的和插入的DNA接點(diǎn)。在存在熱穩(wěn)定聚合酶和dNTP的情況 下，F(xiàn)RET探針和PCR引物（一個(gè)引物在插入的DNA序列中以及一個(gè)在側(cè)翼基因組序列中） 進(jìn)行循環(huán)。FRET探針的雜交引起FRET探針上熒光部分從淬滅部分裂解和釋放。熒光信號(hào) 指示了由于成功的擴(kuò)增和雜交產(chǎn)生的側(cè)翼基因組/轉(zhuǎn)基因插入物序列的存在。
[0057] 在如Tyangi et al. (1996)中描述的，Molecular Beacons已經(jīng)被描述用于序列檢 測(cè)中。簡(jiǎn)要地，設(shè)計(jì)一FRET寡核苷酸探針，其覆蓋側(cè)翼基因組和插入物DNA接點(diǎn)。該FRET 探針的獨(dú)特的結(jié)構(gòu)造成其含有二級(jí)結(jié)構(gòu)，該二級(jí)結(jié)構(gòu)使熒光和淬滅部分保持鄰近。在存在 熱穩(wěn)定聚合酶和dNTP的情況下，F(xiàn)RET探針和PCR引物（一個(gè)引物在插入的DNA序列中以 及一個(gè)在側(cè)翼基因組序列中）進(jìn)行循環(huán)。在成功的PCR擴(kuò)增之后，F(xiàn)RET探針對(duì)目標(biāo)序列的 雜交引起探針二級(jí)結(jié)構(gòu)的消除和熒光部分與淬滅部分的空間分隔。產(chǎn)生熒光信號(hào)。熒光信 號(hào)指示了由于成功的擴(kuò)增和雜交產(chǎn)生的側(cè)翼基因組/轉(zhuǎn)基因插入物序列的存在。
[0058] 其他描述的方法，例如microfluidics(美國(guó)專利公開2006068398,美國(guó)專利 N0.6, 544, 734)提供了分離和擴(kuò)增DNA樣品的方法和設(shè)備。光染料用于檢測(cè)和測(cè)定特定的 DNA分子（W0/05017181)。包含用于檢測(cè)DNA分子的電子傳感器或結(jié)合特定DNA分子的納 珠并因而可被檢測(cè)的納試管（nanotube)設(shè)備（W0/06024023)對(duì)于檢測(cè)本發(fā)明的DNA分子 是有用的。
[0059] 可以使用在此公開的組合物和DNA檢測(cè)領(lǐng)域描述的或已知的方法來(lái)開發(fā)DNA檢 測(cè)試劑盒。所述試劑盒對(duì)于樣品中大豆事件DNA的鑒定是有用的，可以用于培育含DNA的 大豆植物的方法。所述試劑盒可以含有DNA引物或探針，其同源于或互補(bǔ)于SEQ ID N0: 1-4和9,或含有同源于或互補(bǔ)于DNA的轉(zhuǎn)基因遺傳元件中所含DNA的DNA引物或探針，這 些DNA序列可以用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)，或作為DNA雜交方法中的探針。在大豆基因組中含有 的以及在附圖1中說(shuō)明的轉(zhuǎn)基因遺傳元件的DNA結(jié)構(gòu)包含：側(cè)翼于轉(zhuǎn)基因插入物的大豆 A3244基因組的5'基因組區(qū)域，包含來(lái)自Agrobacterium tumefaciens(根癌土壤桿菌） 的右側(cè)邊界區(qū)域（RB)的一部分的插入物，嵌合的啟動(dòng)子FMV/Tsfl和相關(guān)的連接元件（美 國(guó)專利6, 660, 911 ;也稱為FMV/ElFla)可操作連接到Arabidopsis EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編 碼序列（在此稱為CTP2或TS-AtEPSPS CTP2,美國(guó)專利5, 633, 435,可操作連接到草甘膦抗 性 EPSPS (在此稱為 CP4EPSPS 或 aroA :CP4,分離自 Agrobacterium tumefaciens 菌株 CP4， 以及被修改用于增強(qiáng)植物細(xì)胞中的表達(dá)的編碼序列，美國(guó)專利5, 633, 435)，可操作連接到 來(lái)自豌豆核酮糖1，5_二磷酸羧化酶（在此稱為E9 3'或T-Ps. RbcS:E9，Coruzzi et al.， (1984)，來(lái)自Agrobacterium tumefaciens的左側(cè)邊界（LB)區(qū)域的一部分，以及側(cè)翼于轉(zhuǎn) 基因插入物的大豆A3244基因組的3'基因組區(qū)域。在DNA擴(kuò)增方法中作為引物有用的DNA 分子可以來(lái)源于大豆事件M0N89788中含有的轉(zhuǎn)基因插入物的遺傳元件的序列。這些引物 分子可以用作引物集的部分，所述引物集也包括來(lái)源于側(cè)翼于轉(zhuǎn)基因插入物的大豆基因組 的DNA引物分子。通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的方法，例如美國(guó)專利6, 384, 301和7, 002, 058 (通過(guò) 完全引用合并在此）中描述的方法，通過(guò)轉(zhuǎn)化大豆系A(chǔ)3244(美國(guó)專利5, 659, 114)產(chǎn)生了 大豆事件M0N89788。
[0060] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在基因組中包含M0N89788T型基因組區(qū)域（T型是轉(zhuǎn)基因與 植物基因組的相關(guān)單體型區(qū)域的組合）的大豆株系，相對(duì)于包含早先的40-3-2T型基因組 區(qū)域的株系具有改善的產(chǎn)量。在包括從美國(guó)多個(gè)區(qū)域采集的產(chǎn)量數(shù)據(jù)的重復(fù)田間試驗(yàn)中展 現(xiàn)了這一點(diǎn)（美國(guó)專利申請(qǐng)60/685584)。
[0061] 以下實(shí)施例被包括進(jìn)來(lái)以說(shuō)明本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方式的實(shí)例。本領(lǐng)域的技術(shù) 人員應(yīng)當(dāng)理解，在根據(jù)當(dāng)前方法的實(shí)施例中公開的技術(shù)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的實(shí)踐中運(yùn) 作良好，因此可以認(rèn)為構(gòu)成了其實(shí)踐的優(yōu)選模式的實(shí)施例。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)當(dāng) 前公開的內(nèi)容應(yīng)當(dāng)理解，可以在公開的具體方案中進(jìn)行許多變化，在不背離本發(fā)明的精神 和范圍的情況下仍獲得相似的或類似的結(jié)果。 實(shí)施例
[0062]實(shí)施例1
[0063] 對(duì)于M0N89788基因組DNA為診斷性的擴(kuò)增子的產(chǎn)生
[0064] 來(lái)自轉(zhuǎn)基因大豆事件M0N89788的DNA從包含大豆種子、營(yíng)養(yǎng)組織或粗粉的組織 提取。使用Qiagen's DNeasy Plant Miniprep試劑盒根據(jù)廠家的說(shuō)明（Qiagen Corp. Valencia, CA)從組織分離 DNA。
[0065] 產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，其包含在包含M0N89788的植物基因組中側(cè)翼于TDNA (包含轉(zhuǎn)基因 的轉(zhuǎn)化DNA)插入物的5'末端的基因組DNA的一部分。這個(gè)DNA產(chǎn)物包含SEQ ID N0:3。 可以進(jìn)行PCR，使用被設(shè)計(jì)以與側(cè)翼于轉(zhuǎn)基因插入物的5'末端的基因組DNA序列雜交的一 個(gè)引物（DNA引物A，SEQ ID N0:5,參見附圖1)，和與之配對(duì)的位于轉(zhuǎn)基因啟動(dòng)子區(qū)域的第 二引物〇)嫩弓丨物8,5￡〇10勵(lì)：）（美國(guó)專利6,660,911，5￡〇10勵(lì)：28，通過(guò)引用合并在 此，在 SEQ ID N0 :9 中）。
[0066] 從轉(zhuǎn)基因插入物的3'末端產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，其包含側(cè)翼于包含M0N89788的植物基 因組中T-DNA插入物的3'末端的基因組DNA的一部分。這個(gè)DNA產(chǎn)物包含SEQ ID N0 :4。 可以進(jìn)行PCR，使用被設(shè)計(jì)以與側(cè)翼于每個(gè)事件的插入物的3'末端的基因組DNA序列雜交 的引物0>NA引物D，SEQ ID N0 :8)，和與之配對(duì)的位于插入物的3'末端的T-Ps. RbcS :E9 3'轉(zhuǎn)錄終止序列中的第二引物（DNA引物C，SEQ ID NO :7)。
[0067] PCR模板包括?50ng基因組DNA。利用來(lái)自非轉(zhuǎn)基因大豆品種的? 50ng基因組DNA作為陰性對(duì)照。每個(gè)PCR反應(yīng)含有用于REDAccuTaq? LA DNA Polymerase Mix(Sigma-Aldrich，St Louis，M0)的 5iil 10X 緩沖液，200iiM 每種 dNTP(Sigma-Aldrich)，0? M 每種引物，和 2. 5 單位 JumpStart? REDTaq? DNA 聚合酶 (Sigma-Aldrich)，50 ii 1總體積反應(yīng)。在以下循環(huán)條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)：94°C 3分鐘（min) 1 個(gè)循環(huán)；94°C 30 秒（s)、58°C 30s、72°C 30s 或 lmin 32 或 35 個(gè)循環(huán)；72°C 10min 1 個(gè)循環(huán)。
[0068] DNA事件引物對(duì)被用于產(chǎn)生對(duì)M0N89788基因組DNA為診斷性的擴(kuò)增子。這些事 件引物對(duì)包括但不限于，引物A和B(SEQ ID N0:5和6)，和事件引物對(duì)C和D(SEQ ID N0: 7和8)，用于所描述的DNA擴(kuò)增方法中。除了這些引物對(duì)之外，可以使用來(lái)自SEQ ID NO :3 或SEQ ID NO :4、或其互補(bǔ)物的任何引物對(duì)，當(dāng)用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)分別產(chǎn)生包含對(duì)于大豆 M0N89788事件衍生的組織為診斷性的SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2的擴(kuò)增子。表1和表 2中說(shuō)明的DNA擴(kuò)增條件可以用于使用合適的事件引物對(duì)產(chǎn)生M0N89788的診斷性擴(kuò)增子。 用于產(chǎn)生對(duì)M0N89788為診斷性的擴(kuò)增子的這些方法的任何修改處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能 力之內(nèi)。當(dāng)在DNA擴(kuò)增方法中測(cè)試時(shí)產(chǎn)生對(duì)大豆事件M0N89788為診斷性的擴(kuò)增子的、推定 含有包含M0N89788的大豆植物或種子DNA的提取物，或來(lái)自包含M0N89788的植物的產(chǎn)物， 可以被用作擴(kuò)增的模板，來(lái)確定是否存在M0N89788。
[0069] 通過(guò)使用來(lái)自SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的至少一個(gè)引物來(lái)產(chǎn)生擴(kuò)增子，所 述引物當(dāng)用于PCR方法中時(shí)產(chǎn)生事件M0N89788的診斷性擴(kuò)增子。例如，使用表2中示出 的 Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin-Elmer 9700 或 Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環(huán)儀，或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和設(shè)備，來(lái)進(jìn)行M0N89788擴(kuò)增子的 產(chǎn)生。
[0070] 表1.用于大豆M0N897885'轉(zhuǎn)基因插入物/基因組連接區(qū)的鑒定的PCR步驟和反 應(yīng)混合物條件。
[0071]
【權(quán)利要求】
1. 包含事件M0N89788的大豆植物的細(xì)胞。
2. 植物的種子細(xì)胞，其中，所述的植物種子包含事件M0N89788。
3. 權(quán)利要求1的大豆植物的細(xì)胞，其為包含事件M0N89788的大豆植物的任何世代的子 代植物的細(xì)胞。
4. 權(quán)利要求1的大豆植物的細(xì)胞，其中所述植物的細(xì)胞的基因組包含選自由SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :21 和 SEQ ID NO :22 構(gòu)成的 組的至少一種DNA分子。
5. 權(quán)利要求1的大豆植物的細(xì)胞，其中當(dāng)在DNA擴(kuò)增方法中測(cè)試時(shí)，所述植物的細(xì)胞的 基因組產(chǎn)生用于檢測(cè)事件M0N89788的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子包含SEQ ID N0:1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :4。
6. 權(quán)利要求2的種子細(xì)胞，其中當(dāng)在DNA擴(kuò)增方法中測(cè)試時(shí)，所述種子的DNA產(chǎn)生用 于檢測(cè)事件M0N89788的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子包含SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO :4。
7. -種大豆植物的細(xì)胞，其包含草甘膦耐受性性狀，所述性狀與包含SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4的核酸分子是遺傳連鎖的。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK104328085SQ201410414454
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2006年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2005年5月27日
【發(fā)明者】M·馬爾文, J·賴恩哈特, N·泰勒, E·迪金森 申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司