專利名稱：具有抗脂質(zhì)累積活性的枳殼組分制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥化學(xué)領(lǐng)域，具體地說涉及一種從枳殼中提取的有效組分及其制備方法，以及該組分在制備非酒精性脂肪肝治療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝損傷是由多種病因引起且有多種因素參與的復(fù)雜過程。肝損傷引發(fā)的肝臟疾病已成為常見病、多發(fā)病，更為嚴重的是其引發(fā)的肝功能衰竭和肝性腦病等，發(fā)病率和死亡率高，極大地威脅著人類健康。很多因素可引起肝損傷。非酒精性脂肪肝病(nonalcoholicfatty liver disease, NAFLD),又稱非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver, NAFL),是ー種無過量飲酒史，以肝實質(zhì)細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。非酒精性脂肪肝包含一系列的肝臟疾病，從單ー的脂肪變性到不同程度的脂肪變性聯(lián)合壞死和纖維化。而肝細胞內(nèi)脂質(zhì)異常累積則是脂肪肝疾病發(fā)生的最主要因素。油酸是人體內(nèi)最為 豐富的脂肪酸之一，它參與形成肝臟中的三酸甘油酯并能促進脂滴的形成，油酸誘導(dǎo)H印G2脂肪累積是ー種常用的脂質(zhì)累積細胞模型，可用于評價藥物的抗脂質(zhì)累積作用。目前，非酒精性脂肪肝治療方法有很多，且均有一定療效，但也存在著明顯的不足。首先，西藥具有較大的毒副作用，且療效并不確切。而另一方面，實驗和臨床研究證實，中藥在改善肝功能、抗氧化、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫功能以及抗肝纖維化等方面顯示出良好的療效，安全、可靠、有效，進ー步顯示出中醫(yī)辨證論治的合理性，突顯了中藥在治療稱非酒精性脂肪肝方面的良好前景。積殼是為蕓香科植物酸橙CYirw1S aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實，其性味苦、酸，性微寒，主治胸隔痞滿、脅肋脹痛、食積不化、脘腹脹滿等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，枳殼對胃腸平滑肌呈雙向作用，既可興奮胃腸道平滑肌，又可降低胃腸平滑肌張力；能預(yù)防大鼠幽門結(jié)扎潰瘍形成，具有顯著減少胃液分泌量及降低胃蛋白酶活性的作用；此外還具有增加冠脈流量和腎血流血，降低心肌氧耗量等作用。但枳殼組分是否具有抑制肝細胞脂質(zhì)累積的活性尚不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種枳殼有效組分，該有效組分主要含有A柚皮苷，B新橙皮苷兩種化合物，其中A的含量為20%-42%，B的含量為20%-48%。優(yōu)選A的含量為30 40%，B的含量為30 40%。本發(fā)明的另一目的是提供該枳殼有效組分的制備方法，通過以下步驟實現(xiàn)將枳殼藥材粉碎后加入20°/Γ90%的こ醇，加熱回流0. 8^1. 2小吋，提取f 3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與大孔樹脂進行拌樣，用大孔樹脂柱對其進行純化，收集70%こ醇洗脫液，濃縮后經(jīng)聚酰胺柱純化后收集20%こ醇洗脫液，經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明的再ー個目的是提供該枳殼有效組分在制備非酒精性脂肪肝治療藥物中的應(yīng)用。具體地
本發(fā)明第一方面提供了一種積殼提取物(在本發(fā)明中亦可稱為積殼有效組分)，其中含有柚皮苷和新橙皮苷，并且其中柚皮苷的含量為20%-42%，新橙皮苷的含量為20%-48%。在一個實施方案中，柚皮苷的含量為3(Γ40%，新橙皮苷的含量為3(Γ40%。在一個實施方案中，柚皮苷的含量為25 35%，新橙皮苷的含量為2(Γ30%。本發(fā)明第一方面還提供了一種枳殼提取物(在本發(fā)明中亦可稱為枳殼有效組分)，其中含有柚皮苷和新橙皮苷，并且其中含有20-42重量份的柚皮苷，和含量為20-48重量份的新橙皮苷。在一個實施方案中，該積殼提取物中含有30-40重量份的柚皮苷,和含量為30-40重量份的新橙皮苷。在一個實施方案中，該枳殼提取物中含有25-35重量份的柚皮苷，和含量為20-30重量份的新橙皮苷。 根據(jù)本發(fā)明第一方面的枳殼提取物，其是通過以下方法制備得到的將枳殼藥材粉碎后加入20°/Γ90% (例如60-80%，例如65-75%)的こ醇，加熱回流提取f 3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與大孔樹脂進行拌樣，用大孔樹脂柱對其進行純化，收集6(Γ80%こ醇洗脫液，濃縮，經(jīng)聚酰胺柱純化，收集20%こ醇洗脫液，經(jīng)濃縮干燥，即得。根據(jù)本發(fā)明第一方面的枳殼提取物，其是通過以下方法制備得到的將1500g枳殼加4200ml 70%こ醇提取2h，再加3500ml 70%こ醇提取I. 5h，最后加2800ml 70%こ醇提取lh，合并三次提取液，抽濾后濃縮。濃縮液過大孔樹脂(DlOl)，先用水洗脫后，再用20%こ醇洗脫，最后以70%こ醇洗脫。收集70%こ醇洗脫液，濃縮至150ml左右，抽濾，過聚酰胺柱，用20%こ醇洗脫4個柱體積，收集洗脫液；再用40%こ醇洗脫5個柱體積，分10段收集洗脫液，每段500ml。將20%こ醇洗脫段旋蒸，冷凍干燥后稱重，即得。本發(fā)明第二方面提供了制備枳殼提取物的方法，其包括以下步驟將枳殼藥材粉碎后加入20% 90% (例如60-80%，例如65-75%)的こ醇，加熱回流提取I 3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與大孔樹脂進行拌樣，用大孔樹脂柱對其進行純化，收集6(Γ80%こ醇洗脫液，濃縮，經(jīng)聚酰胺柱純化，收集20%こ醇洗脫液，經(jīng)濃縮干燥，即得。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其包括以下步驟將1500g枳殼加4200ml 70%こ醇提取2h，再加3500ml 70%こ醇提取I. 5h，最后加2800ml 70%こ醇提取lh，合并三次提取液，抽濾后濃縮。濃縮液過大孔樹脂(DlOl)，先用水洗脫后，再用20%こ醇洗脫，最后以70%こ醇洗脫。收集70%こ醇洗脫液，濃縮至150ml左右，抽濾，過聚酰胺柱，用20%こ醇洗脫4個柱體積，收集洗脫液；再用40%こ醇洗脫5個柱體積，分10段收集洗脫液，每段500ml。將20%こ醇洗脫段旋蒸，冷凍干燥后稱重，即得。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其所得枳殼提取物中含有柚皮苷和新橙皮苷，并且其中柚皮苷的含量為20%-42%，新橙皮苷的含量為20%-48%。在一個實施方案中，柚皮苷的含量為3(Γ40%，新橙皮苷的含量為3(Γ40%。在一個實施方案中，柚皮苷的含量為25 35%，新橙皮苷的含量為20 30%。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其所得枳殼提取物中含有柚皮苷和新橙皮苷，并且其中含有20-42重量份的柚皮苷，和含量為20-48重量份的新橙皮苷。在一個實施方案中，該枳殼提取物中含有30-40重量份的柚皮苷，和含量為30-40重量份的新橙皮苷。在ー個實施方案中，該枳殼提取物中含有25-35重量份的柚皮苷，和含量為20-30重量份的新橙皮苷。本發(fā)明第三方面提供了本發(fā)明第一方面的枳殼提取物在制備非酒精性脂肪肝治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明第四方面提供了ー種藥物組合物，其中包括本發(fā)明第一方面的枳殼提取物以及藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的枳殼有效組分可以作為活性部位，加入藥劑學(xué)上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學(xué)上記載的方法制成制劑。所述藥物的制劑形式包括液體制劑、固體制劑、膠囊劑、膠丸劑。包括注射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、ロ服液、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、ロ含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、ロ崩片、微丸等。
在本發(fā)明中，術(shù)語“枳殼組分”可稱為“枳殼提取物”或者“枳殼有效組分”等，這些術(shù)語可以互換使用。本發(fā)明的有益效果為
I.本發(fā)明的提取分離エ藝簡單，能快速準確地得到有效組分。2.本發(fā)明提供的枳殼有效組分化學(xué)成分簡單明確，在藥理研究上更易于闡明其作用機制，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。3.本發(fā)明首次在油酸誘導(dǎo)H印G2脂肪累積模型上，評價了枳殼提取物對抗脂質(zhì)累積降脂作用，得到較好的藥理活性。


圖I為本發(fā)明枳殼提取物的HPLC分析圖。圖2顯示了不同濃度枳殼提取物對500uM油酸誘導(dǎo)的HepG2細胞脂質(zhì)累積的影響。圖3描繪了不同濃度柚皮苷和新橙皮苷對500uM油酸誘導(dǎo)的HepG2細胞脂質(zhì)累積的影響。
具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和下面實施例進ー步詳細說明本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容，該實施例僅用于說明本發(fā)明而并非對本發(fā)明的限制。實施例一枳殼有效組分的制備
將1500g枳殼加4200ml 70%こ醇提取2h，再加3500ml 70%こ醇提取I. 5h，最后加2800ml 70%こ醇提取lh，合并三次提取液，抽濾后濃縮。濃縮液過大孔樹脂(DlOl)，先用水洗脫后，再用20%こ醇洗脫，最后以70%こ醇洗脫。收集70%こ醇洗脫液，濃縮至150ml左右,抽濾,過聚酰胺柱,用20%こ醇洗脫4個柱體積，收集洗脫液；再用40%こ醇洗脫5個柱體積，分10段收集洗脫液，每段500ml。將20%こ醇洗脫段旋蒸，冷凍干燥后稱重，得枳殼組分47. 5608g。其用于下文的生物學(xué)試驗。實施例ニ枳殼有效組分的分析
色譜條件 Agilent 1100型高效液相色譜儀，色譜柱為SB-C18色譜柱；以こ臆-水(20:80)(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3)為流動相；檢測波長為283nm ;液相色譜流速為lml/min，進樣量10 μ I。供試品溶液的制備稱取本品，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀釋至2mg/ml，搖勻，即得。測定方法精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，依色譜分析條件測定，即得。分析結(jié)果枳殼有效組分的高效液相色譜分析譜圖見圖1，兩圖中保留時間分別為16min和11. 5min的色譜峰分別是A、B兩個化合物。使用相同色譜條件，分析了柚皮苷和新橙皮苷標準品，發(fā)現(xiàn)化合物A與柚皮苷保留時間相同，發(fā)現(xiàn)化合物與新橙皮苷保留時間相同，所以鑒定化合物A和B分別是柚皮苷和新橙皮苷。含量測定結(jié)果表明，柚皮苷和新橙皮苷在提取物中含量分別為31. 2%和25. 8%。出人意料地發(fā)現(xiàn)，在實施例I中，如果用濃度低于60%的こ醇提取，或者用濃度高于80%的こ醇提取，或者改用其它型號的大孔樹脂進行洗脫，化合物A和B獲得量分別比實施例I的獲得量低33%和30%以上。用65-75%こ醇 并且用DlOl大孔樹脂制備時，化合物A和B獲得量是實施例I的獲得量的939^115%，并且提取物中化合物A的含量在25-35%之間，化合物B的含量在20-30%之間。實施例三枳殼有效組分制劑
取實施例I所得的枳殼有效組分O. 5g與10. 5g聚こニ醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至6 8°C液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。實施例四枳殼有效組分制劑
取實施例I所得的枳殼有效組分O. 5g，磨成細粉，與約1/3的淀粉混勻，加淀粉漿混勻制成軟材，16目篩制粒，70°C干燥，干粒過14目篩整粒，加剩余淀粉(預(yù)先在100 — 105 V干燥)與吸附有液狀石蠟的滑石粉(將輕質(zhì)液狀石蠟噴于滑石粉中混勻)，再通過14目篩，壓片，即得實施例五枳殼有效組分抗脂質(zhì)累積活性評價
溶待測組分于DMSO中，得50 mg -inL-l儲備液，與細胞孵育的終濃度為50 μ g -inL-l,在油酸誘導(dǎo)的HepG2肝細胞模型評價其抑制脂質(zhì)累積活性。將生長良好的HepG2細胞以每孔20萬細胞的密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔培養(yǎng)液1ml。待細胞貼壁后(約24小吋)，分對照組和給藥組處理，平行三次實驗，對照組中加入O. 5mM油酸，給藥組中加入O. 5mM油酸及75、100、150、200 ug/ml實施例I所得枳殼提取物，于37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)24h后，棄去每孔上清，酶法測定甘油三酷、總膽固醇含量。測定方法為24孔細胞培養(yǎng)板用預(yù)冷PBS500ul洗兩次，每孔加入200ul細胞裂解液裂解30min，取裂解總液于I. 5ml離心管中，離心IOmin (12000rpm，4°C )，分別取上清液80ul加IOOul甘油三酯酶劑測每孔甘油三酯(TG)含量，80ul加IOOul膽固醇酶劑測每孔膽固醇(TC)含量，IOul用BCA法測蛋白含量，計算每孔單位蛋白的TG和TC含量(ug/mg蛋白質(zhì))。結(jié)果表明，實施例I所得積殼提取物在50ug/ml, 100ug/ml, 200ug/ml濃度下有明顯的抑制油酸誘導(dǎo)HepG2細胞中甘油三酯累積的作用，并呈量效關(guān)系。具體見圖2，其描繪了不同濃度枳殼提取物對500uM油酸誘導(dǎo)的H印G2細胞脂質(zhì)累積的影響，其中縱坐標表示対照的％ “枳殼黃酮”即本發(fā)明的枳殼提取物。實施例六枳殼組分中主要成分的抗脂質(zhì)累積活性評價
將枳殼組分中主要成分柚皮苷和新橙皮苷配制成10、25、50、100、150、200μπιο1 じ1溶液，在油酸誘導(dǎo)的HepG2肝細胞模型評價其抑制脂質(zhì)累積活性。結(jié)果表明，新橙皮苷在濃度IOOuymol じ1以上時有明顯的抑制油酸誘導(dǎo)H印G2細胞TG和TC累積的作用，并呈一定的濃度依賴性；柚皮苷在濃度為200 μ mo I じ1時有明顯的抑制油酸誘導(dǎo)H印G2細胞TG和TC累積的作用。具體見圖3，其描繪了不同濃度柚皮苷和新橙皮苷對500uM油酸誘導(dǎo)的H印G2細胞脂質(zhì)累積的影響，其中縱坐標表示対照的％。 ·
權(quán)利要求
1.ー種枳殼提取物，其中含有柚皮苷和新橙皮苷，并且其中柚皮苷的含量為20%-42%，新橙皮苷的含量為20%-48%。
2.ー種枳殼提取物，其中含有柚皮苷和新橙皮苷，并且其中含有20-42重量份的柚皮苷，和含量為20-48重量份的新橙皮苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的枳殼提取物，其是通過以下方法制備得到的將枳殼藥材粉碎后加入209Γ90%的こ醇，加熱回流提取Γ3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與大孔樹脂進行拌樣，用大孔樹脂柱對其進行純化，收集6(Γ80%こ醇洗脫液，濃縮，經(jīng)聚酰胺柱純化，收集20%こ醇洗脫液，經(jīng)濃縮干燥，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2的枳殼提取物，其是通過以下方法制備得到的將1500g枳殼 加4200ml 70%こ醇提取2h，再加3500ml 70%こ醇提取I. 5h，最后加2800ml 70%こ醇提取lh，合并三次提取液，抽濾后濃縮；濃縮液過大孔樹脂(DlOl)，先用水洗脫后，再用20%こ醇洗脫，最后以70%こ醇洗脫；收集70%こ醇洗脫液，濃縮至150ml左右，抽濾，過聚酰胺柱，用 20%こ醇洗脫4個柱體積，收集洗脫液；再用40%こ醇洗脫5個柱體積，分10段收集洗脫液，每段500ml ;將20%こ醇洗脫段旋蒸，冷凍干燥后稱重，即得。
5.制備枳殼提取物的方法，其包括以下步驟將枳殼藥材粉碎后加入20% 90%的こ醇，加熱回流提取Γ3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與大孔樹脂進行拌樣，用大孔樹脂柱對其進行純化，收集6(Γ80%こ醇洗脫液，濃縮，經(jīng)聚酰胺柱純化，收集20%こ醇洗脫液，經(jīng)濃縮干燥，即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其包括以下步驟將1500g枳殼加4200ml70%こ醇提取2h，再加3500ml 70%こ醇提取I. 5h，最后加2800ml 70%こ醇提取lh，合并三次提取液，抽濾后濃縮；濃縮液過大孔樹脂，先用水洗脫后，再用20%こ醇洗脫，最后以70%こ醇洗脫；收集70%こ醇洗脫液，濃縮至150ml左右，抽濾，過聚酰胺柱，用20%こ醇洗脫4個柱體積，收集洗脫液；再用40%こ醇洗脫5個柱體積，分10段收集洗脫液，每段500ml ;將20%こ醇洗脫段旋蒸，冷凍干燥后稱重，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其所得枳殼提取物中含有柚皮苷和新橙皮苷，并且其中柚皮苷的含量為20%-42%，新橙皮苷的含量為20%-48%。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其所得枳殼提取物中含有柚皮苷和新橙皮苷，并且其中含有20-42重量份的柚皮苷，和含量為20-48重量份的新橙皮苷。
9.權(quán)利要求1-8任一項的枳殼提取物在制備非酒精性脂肪肝治療藥物中的應(yīng)用。
10.ー種藥物組合物，其中包括本發(fā)明第一方面的枳殼提取物以及藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有抗脂質(zhì)累積活性的枳殼組分制備方法及用途。具體地，本發(fā)明涉及一種枳殼提取物，其中含有柚皮苷和新橙皮苷，并且其中柚皮苷的含量為20%-42%，新橙皮苷的含量為20%-48%。本發(fā)明的枳殼提取物，其是通過以下方法制備得到的將枳殼藥材粉碎后加入20%~90%的乙醇，加熱回流提取1~3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與大孔樹脂進行拌樣，用大孔樹脂柱對其進行純化，收集60~80%乙醇洗脫液，濃縮，經(jīng)聚酰胺柱純化，收集20%乙醇洗脫液，經(jīng)濃縮干燥，即得。該枳殼提取物可用于制備非酒精性脂肪肝治療藥物。
文檔編號A61K31/7048GK102824441SQ201210302290
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月23日
發(fā)明者程翼宇, 王怡, 王毅, 劉二偉 申請人:天津中醫(yī)藥大學(xué)