專利名稱：具有抗脂質(zhì)累積活性的川芎內(nèi)酯提取物制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥化學(xué)領(lǐng)域，具體地說涉及一種從川芎中提取的有效組分及其制備方法，以及該組分在制備非酒精性脂肪肝治療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝損傷是由多種病因引起且有多種因素參與的復(fù)雜過程。肝損傷引發(fā)的肝臟疾病已成為常見病、多發(fā)病，更為嚴重的是其引發(fā)的肝功能衰竭和肝性腦病等，發(fā)病率和死亡率高，極大地威脅著人類健康。很多因素可引起肝損傷。非酒精性脂肪肝病(nonalcoholicfatty liver disease, NAFLD),又稱非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver, NAFL),是一種無過量飲酒史，以肝實質(zhì)細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。非酒 精性脂肪肝包含一系列的肝臟疾病，從單一的脂肪變性到不同程度的脂肪變性聯(lián)合壞死和纖維化。而肝細胞內(nèi)脂質(zhì)異常累積則是脂肪肝類疾病發(fā)生的最主要因素。油酸是人體內(nèi)最為豐富的脂肪酸之一，它參與形成肝臟中的三酸甘油酯并能促進脂滴的形成，油酸誘導(dǎo)HepG2脂肪累積是一種常用的脂質(zhì)累積細胞模型，可用于評價藥物的抗脂質(zhì)累積作用。目前，非酒精性脂肪肝治療方法有很多，且均有一定療效，但也存在著明顯的不足。首先，西藥具有較大的毒副作用，且療效并不確切。而另一方面，實驗和臨床研究證實，中藥在改善肝功能、抗氧化、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫功能以及抗肝纖維化等方面顯示出良好的療效，安全、可靠、有效，進一步顯示出中醫(yī)辨證論治的合理性，突顯了中藥在治療稱非酒精性脂肪肝方面的良好前景。川彎為傘形科植物川彎chuanxiong Hort.的干燥根莖,其性味辛，溫。歸肝、膽、心包經(jīng)。活血祛瘀作用廣泛，適宜瘀血阻滯各種病癥；祛風(fēng)止痛，效用甚佳，可治頭風(fēng)頭痛、風(fēng)濕痹痛等癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，川芎提取物對離體豚鼠心臟有劑量依賴性抑制作用，對離休大鼠或豚鼠心臟均具有顯著的增加冠脈流量作用，其主要活性成分川芎嗪能擴張大鼠肺血管，抑制缺氧性肺血管收縮反應(yīng)和右心室肥大。此外，川芎還具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制作用，對動物大腦的活動具有抑制作用，而對延腦呼吸中樞、血管運動中樞及脊髓反射中樞具有興奮作用。但目前研究大都集中在川芎嗪和阿魏酸等成分，對于川芎內(nèi)酯類組分是否具有抑制肝細胞脂質(zhì)累積的活性尚不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種川芎有效組分，該有效組分主要含有藁本內(nèi)酯，含量為30 90%。本發(fā)明的另一目的是提供該川芎有效組分的制備方法，通過以下步驟實現(xiàn)將川芎藥材粉碎后加入20°/Γ90%的乙醇浸泡5 12小時，加熱回流提取0. 8^1. 2小時，提取f 3次，合并濾液得提取液，將提取液用石油醚萃取，將萃取液濃縮后用正相硅膠柱對其進行純化，以體積比為50:1的石油醚與乙酸乙酯為洗脫劑，收集洗脫液濃縮后得到有效組分。本發(fā)明的再一個目的是提供該川芎有效組分在制備非酒精性脂肪肝治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明第一方面提供了一種川芎提取物，其中含有3(Γ90%的藁本內(nèi)酯。根據(jù)本發(fā)明第一方面的川芎提取物，其中含有8(Γ97%(例如85%_95%)的藁本內(nèi)酯。根據(jù)本發(fā)明第一方面的川芎提取物，其是通過以下方法制備得到的將川芎藥材粉碎后，用70°/Γ99%乙醇(例如75°/Γ98%)浸泡并回流提取1_4次，合并提取液，濃縮，用石油醚萃取，將合并的萃取液回收溶劑至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，力口入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:0. 5 5 (例如50:0. 5^3)的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，濃縮，即得。根據(jù)本發(fā)明第一方面的川芎提取物，其是通過以下方法制備得到的將川芎藥材粉碎后加入20% 90%的乙醇浸泡5 12小時，加熱回流提取O. 8^1. 2小時，提取f 3次，合并 濾液得提取液，將提取液用石油醚萃取，將萃取液濃縮后用正相硅膠柱對其進行純化，以體積比為50:1的石油醚與乙酸乙酯為洗脫劑，收集洗脫液濃縮后得到提取物。根據(jù)本發(fā)明第一方面的川芎提取物，其是通過以下方法制備得到的將IOOOg川芎藥材粉碎后，加入4000ml 95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時，再加入4000ml用95%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，濃縮至密度I. 08 ;將濃縮液加至500ml水中分散成混懸液,加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶劑至干。取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，經(jīng)過濃縮后即得。本發(fā)明第二方面提供了制備川芎提取物的方法，其包括以下步驟將川芎藥材粉碎后，用70°/Γ99%乙醇(例如75°/Γ98%)浸泡并回流提取1_4次，合并提取液，濃縮，用石油醚萃取，將合并的萃取液回收溶劑至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:0. 5 5 (例如50:0. 5^3)的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，濃縮，即得。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其包括以下步驟將川芎藥材粉碎后加入20% 90%的乙醇浸泡5 12小時，加熱回流提取O. 8^1. 2小時，提取f 3次，合并濾液得提取液，將提取液用石油醚萃取，將萃取液濃縮后用正相硅膠柱對其進行純化，以體積比為50:1的石油醚與乙酸乙酯為洗脫劑，收集洗脫液濃縮后得到提取物。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其包括以下步驟將IOOOg川芎藥材粉碎后，加入4000ml 95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時，再加入4000ml用95%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，濃縮至密度I. 08 ;將濃縮液加至500ml水中分散成混懸液，加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶劑至干。取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，經(jīng)過濃縮后即得。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其所得川芎提取物中含有3(Γ90%的藁本內(nèi)酯。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其所得)11芎提取物中含有8(Γ97% (例如85%_95%)的藁本內(nèi)酯。本發(fā)明第三方面提供了本發(fā)明第一方面的川芎提取物在制備非酒精性脂肪肝治療藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明第四方面提供了一種藥物組合物，其中包括本發(fā)明第一方面的川芎提取物以及藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的川芎有效組分可以作為活性部位，加入藥劑學(xué)上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學(xué)上記載的方法制成制劑。所述藥物的制劑形式包括液體制劑、固體制劑、膠囊劑、膠丸劑。包括注射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、口服液、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩片、微丸等。在本發(fā)明中，術(shù)語“川芎有效組分”亦可稱為“川芎組分”、“川芎提取物”、“川芎內(nèi)酯”等，這些術(shù)語可以互換使用。本發(fā)明的有益效果為
I.本發(fā)明的提取分離工藝簡單，能快速準確地得到有效組分。 2.本發(fā)明提供的川芎有效組分化學(xué)成分簡單明確，在藥理研究上更易于闡明其作用機制，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。3.本發(fā)明首次在油酸誘導(dǎo)HepG2脂肪累積模型上，評價了川芎內(nèi)酯類提取物對抗脂質(zhì)累積降脂作用，得到較好的藥理活性。


圖I為本發(fā)明川芎提取物的GC-MS分析圖，模坐標表示分鐘。圖2.不同濃度川芎提取物對500uM油酸誘導(dǎo)的H印G2細胞脂質(zhì)累積的影響。
具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和下面實施例進一步詳細說明本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容，該實施例僅用于說明本發(fā)明而并非對本發(fā)明的限制。實施例一川芎有效組分的制備
將IOOOg川芎藥材粉碎后，加入4000ml 95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時，再加入4000ml用95%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，濃縮至密度I. 08。將濃縮液加至500ml水中分散成混懸液，加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶劑至干。取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:1的石油醚(60-90)和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，經(jīng)過濃縮后得到淡黃色液體
11.3g，為本發(fā)明川芎提取物，其在本發(fā)明中亦可稱為川芎內(nèi)酯，并且用于下文生物學(xué)試驗例。實施例二川芎有效組分的分析
稱取如實施例I所示川芎提取物溶解，取適量轉(zhuǎn)移至棕色液相進樣瓶，用于液相色譜分析。分析條件如下Agilent 1100型液相色譜儀,進樣量10 μ I ;流速lml/min,柱溫30。。。色譜流動相梯度為:(T40min :水(O. 1%甲酸)70% 20%，乙腈30% 80% ;40_50min 水(O. 1%甲酸)20% 5%，乙腈80% 95% ;50 55min :水(O. 1%甲酸)5%，乙腈95% ;檢測波長271nm。分析譜圖如附圖I所示。液相色譜分析顯示川芎提取物在26. 5min有I個明顯色譜峰，經(jīng)與標準品比對后鑒定該峰代表的化合物為藁本內(nèi)酯。分析結(jié)果顯示，川芎內(nèi)酯提取物中主要成分為藁本內(nèi)酯，其含量約為90%。出人意料地發(fā)現(xiàn)，在實施例I中，如果用濃度低于70%的乙醇提取，或者用石油醚為洗脫劑，或者所用洗脫劑中乙酸乙酯份量大于5，即50份石油醚與5份以上的乙酸乙酯混合液為洗脫劑時，藁本內(nèi)酯獲得量比實施例I的獲得量低30%以上。用75%以上乙醇提取，或者用石油醚乙酸乙酯為50 :0. 5^3的比例的混合液作為洗脫液時，藁本內(nèi)酯獲得量是實施例I的獲得量的909^115%，并且提取物中藁本內(nèi)酯含量均在80 97%。實施例三川芎有效組分制劑
取實施例I所得的川芎有效組分O. 5g與10. 5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至6 8°C液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。實施例四川芎有效組分制劑
取實施例I所得的川芎有效組分O. 5g，磨成細粉，與約1/3的淀粉混勻，加淀粉漿混勻制成軟材，16目篩制粒，70°C干燥，干粒過14目篩整粒，加剩余淀粉(預(yù)先在100 - 105 V干燥)與吸附有液狀石蠟的滑石粉(將輕質(zhì)液狀石蠟噴于滑石粉中混勻)，再通過14目篩，壓片，即得。實施例五川芎有效組分(實施例I的川芎提取物)抗脂質(zhì)累積活性評價 溶待測組分于DMSO中，得50 mg -inL-l儲備液，與細胞孵育的終濃度為50 μ g -inL-l,
在油酸誘導(dǎo)的HepG2肝細胞模型評價其抑制脂質(zhì)累積活性。將生長良好的HepG2細胞以每孔20萬細胞的密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔培養(yǎng)液1ml。待細胞貼壁后(約24小時)，分對照組和給藥組處理，平行三次實驗，對照組中加入O. 5mM油酸，給藥組中加入O. 5mM油酸及實施例I所得川芎提取物(濃度為25、50、100,200 ug/ml)，于37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)24h后，棄去每孔上清，酶法測定甘油三酯、總膽固醇含量。測定方法為24孔細胞培養(yǎng)板用預(yù)冷PBS500ul洗兩次，每孔加入200ul細胞裂解液裂解30min，取裂解總液于I. 5ml離心管中，離心(12000rpm，4°C，lOmin)，分別取上清液80ul加IOOul甘油三酯酶劑測每孔甘油三酯(TG)含量，80ul加IOOul膽固醇酶劑測每孔膽固醇(TC)含量，IOul用BCA法測蛋白含量，計算每孔單位蛋白的TG和TC含量(ug/mg蛋白)。結(jié)果表明，實施例I所得川芎提取物在50ug/ml，100ug/ml, 200ug/ml濃度下有明顯的抑制油酸誘導(dǎo)HepG2細胞中甘油三酯累積的作用，并呈量效關(guān)系。結(jié)果見圖2，其中顯示了不同濃度川芎提取物對500uM油酸誘導(dǎo)的H印G2細胞脂質(zhì)累積的影響?？v坐標表示對照的％。
權(quán)利要求
1.一種川芎提取物，其中含有3(Γ90%的藁本內(nèi)酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的川芎提取物，其中含有8(Γ97%的藁本內(nèi)酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的川芎提取物，其是通過以下方法制備得到的將川芎藥材粉碎后，用70°/Γ99%乙醇(例如75°/Γ98%)浸泡并回流提取1_4次，合并提取液，濃縮，用石油醚萃取，將合并的萃取液回收溶劑至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:0. 5 5 (例如50:0. 5^3)的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，濃縮，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2的川芎提取物，其是通過以下方法制備得到的將川芎藥材粉碎后加入20°/Γ90%的乙醇浸泡5 12小時，加熱回流提取O. 8^1. 2小時，提取f 3次，合并濾液得提取液，將提取液用石油醚萃取，將萃取液濃縮后用正相硅膠柱對其進行純化，以體積比為50:1的石油醚與乙酸乙酯為洗脫劑，收集洗脫液濃縮后得到提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2的川芎提取物，其是通過以下方法制備得到的將IOOOg川芎藥材粉碎后，加入4000ml 95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時，再加入4000ml用95%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，濃縮至密度I. 08 ;將濃縮液加至500ml水中分散成混懸液,加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶劑至干；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，經(jīng)過濃縮后即得。
6.制備川芎提取物的方法，其包括以下步驟將川芎藥材粉碎后，用709Γ99%乙醇(例如759Γ98%)浸泡并回流提取1-4次，合并提取液，濃縮，用石油醚萃取，將合并的萃取液回收溶劑至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:0. 5 5 (例如50:0. 5^3)的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，濃縮，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其包括以下步驟將川芎藥材粉碎后加入20% 90%的乙醇浸泡5 12小時，加熱回流提取O. 8^1. 2小時，提取f 3次，合并濾液得提取液，將提取液用石油醚萃取，將萃取液濃縮后用正相硅膠柱對其進行純化，以體積比為50:1的石油醚與乙酸乙酯為洗脫劑，收集洗脫液濃縮后得到提取物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其包括以下步驟將IOOOg川芎藥材粉碎后，加入4000ml95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時，再加入4000ml用95%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，濃縮至密度I. 08 ;將濃縮液加至500ml水中分散成混懸液，加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶劑至干；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，經(jīng)過濃縮后即得。
9.權(quán)利要求1-6的川芎提取物在制備非酒精性脂肪肝治療藥物中的應(yīng)用。
10.一種藥物組合物，其中包括權(quán)利要求1-6的川芎提取物以及藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有抗脂質(zhì)累積活性的川芎內(nèi)酯提取物制備方法及用途。具體地，本發(fā)明涉及一種川芎提取物，其中含有30～90%的藁本內(nèi)酯。該提取物是通過以下方法制備得到的將川芎藥材粉碎后，用70%～99%乙醇(例如75%～98%)浸泡并回流提取1-4次，合并提取液，濃縮，用石油醚萃取，將合并的萃取液回收溶劑至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50∶0.5～5(例如50∶0.5～3)的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，濃縮，即得。
文檔編號A61K36/236GK102824382SQ20121030221
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月23日
發(fā)明者程翼宇, 張萌, 王怡, 王毅, 劉二偉 申請人:天津中醫(yī)藥大學(xué)