專利名稱：：乙肝病毒前s1抗原快速診斷試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種免疫診斷技術(shù)，具體地說(shuō)是一種乙肝病毒前S1抗原快速診斷試劑盒及其制備方法。用于快速檢測(cè)人血清或血漿中乙肝病毒前si抗原。
背景技術(shù)：
：我們知道，乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種世界性疾病，我國(guó)是乙型肝炎的高發(fā)國(guó)。40-60X的人群感染過(guò)HBV，9-10X的人群為HBV表面抗原(HBsAg)攜帶者，對(duì)這一億多的HBsAg陽(yáng)性者作為傳染源的意義作出評(píng)估，才能比較公平地對(duì)待他們對(duì)社會(huì)活動(dòng)的參與。通過(guò)對(duì)HBV病毒顆粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其外膜蛋白包括S、前S2和前Sl三種成分。前Sl蛋白主要存在于Dane顆粒和管型顆粒上，在病毒感染、裝配、復(fù)制、侵入肝細(xì)胞過(guò)程和剌激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)中起重要作用；臨床研究也發(fā)現(xiàn)，前S1蛋白在HBV感染的最早期出現(xiàn)并與血清HBV-DNA、HBeAg及肝內(nèi)HBcAg高度相關(guān)，其在病毒性乙型肝炎的臨床診斷，指導(dǎo)治療等方面有重要價(jià)值。首先，乙肝病毒前S1抗原的檢測(cè)是早期診斷乙型肝炎病毒感染的指標(biāo)。因?yàn)榍癝1抗原出現(xiàn)在急性乙型肝炎感染的最早期，在轉(zhuǎn)氨酶升高前即可查出，因而用于乙肝病毒感染的早期診斷，尤其是在體檢和獻(xiàn)血員中加查前Sl抗原，在疾病的早期診斷和盡早切斷傳染原方面有重要意義。其次，乙肝病毒前S1抗原是反映HBV感染和復(fù)制狀況的指標(biāo)。前S1抗原與HBV-DNA，HBeAg檢測(cè)率高度符合，提示前Sl抗原可作為HbeAg和HBV-DNA檢測(cè)的補(bǔ)充和對(duì)照；HBeAb(+)慢性乙型肝炎(約占患者的30%左右)和HBV慢性無(wú)癥狀攜帶者中，前S1抗原(+)可表示病毒的復(fù)制，提示臨床上只檢測(cè)"乙肝五項(xiàng)"是不夠的，補(bǔ)充前S1抗原的測(cè)定是十分重要的，可彌補(bǔ)因病毒變異和其它原因造成的HBeAg(-)的"誤導(dǎo)";病毒附著于肝細(xì)胞上，最重要的介導(dǎo)部位是前S1蛋白的氨基酸(AA)21-47片段，變異的病毒只要這一區(qū)段完好就有傳染性。再者，乙肝病毒前Sl抗原的檢測(cè)可用于預(yù)后及藥物療效的判斷。急性乙型肝炎患者前Sl抗原陰轉(zhuǎn)越早，預(yù)后越好，是病毒清除的最早跡象，反之，前Sl抗原持續(xù)陽(yáng)性，將發(fā)展至慢性肝炎；因病毒基因變異的HBeAb(+)慢性乙型肝炎病人，較易進(jìn)展為肝硬化，甚至肝癌，加強(qiáng)檢測(cè)前Sl抗原，是一種檢測(cè)疾病預(yù)后的良好手段；前Sl抗原可作為藥物抗病毒療效的指標(biāo)，是對(duì)HBV-DNA和HBeAg指標(biāo)的補(bǔ)充和加強(qiáng)。隨著對(duì)乙肝病毒前Sl抗原蛋白特有性質(zhì)的研究及其在乙肝發(fā)病機(jī)理、乙肝病毒感染和復(fù)制等方面研究的深入，發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多前Sl抗原在HBV分子生物學(xué)上的重要意義。在與肝細(xì)胞受體結(jié)合、調(diào)節(jié)HBVcccDNA(covalentlyclosedcircularDNA)，合成、轉(zhuǎn)化病毒與細(xì)胞基因表達(dá)活性、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答、導(dǎo)致肝炎以及在病毒裝配和傳染性等方面的重要作用越來(lái)越受到人們重視。大量的臨床與實(shí)驗(yàn)室研究表明應(yīng)用前Sl抗原檢測(cè)試劑對(duì)乙肝病毒建立一種科學(xué)、靈敏、重復(fù)性好的血清學(xué)檢測(cè)對(duì)臨床診斷與指導(dǎo)治療具有越來(lái)越重要的意義。目前對(duì)乙肝病毒前S1抗原的檢測(cè)方法主要為酶聯(lián)免疫吸附法和化學(xué)發(fā)光法。二者對(duì)于乙肝病毒前S1抗原的檢測(cè)雖然是比較準(zhǔn)確和敏感的，但是也存在如下的缺點(diǎn)(l)檢測(cè)需要專門的儀器設(shè)備輔助如酶標(biāo)儀和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀，不利于實(shí)行現(xiàn)場(chǎng)直接檢測(cè)；(2)操作過(guò)程相對(duì)比較復(fù)雜，檢測(cè)所需要的時(shí)間比較長(zhǎng)，而且需要經(jīng)過(guò)專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)的技術(shù)人員操作。(3)—般不能實(shí)現(xiàn)單人份的檢測(cè)。為滿足臨床快速檢測(cè)的需要，近年來(lái)發(fā)展了多種簡(jiǎn)便、快速的免疫學(xué)檢測(cè)方法，膠體金法即為其中一種，膠體金技術(shù)是九十年代發(fā)展起來(lái)的快速診斷分析技術(shù)，近幾年新發(fā)展的膠體金快速測(cè)定試紙條主要適用于急診檢驗(yàn)、小型化驗(yàn)室或家中自測(cè)，已成為21世紀(jì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)一個(gè)重要的發(fā)展方向。膠體金免疫層析技術(shù)是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。層析過(guò)程中，金標(biāo)記物與事先固相化于層析材料如硝酸纖維素膜上的抗原或抗體發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)而被截留，進(jìn)一步富集，形成肉眼可見(jiàn)的紫紅色條帶，從而得到直觀的實(shí)驗(yàn)效果，達(dá)到快速檢測(cè)的目的。由于我國(guó)乙型肝炎患者較多，而且目前正處于經(jīng)濟(jì)發(fā)展階段，為了對(duì)乙型肝炎患者的病情作出正確而經(jīng)濟(jì)的分析，有必要加強(qiáng)對(duì)pre-Sl抗原的基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用研究。前Sl蛋白檢測(cè)是一種科學(xué)、靈敏、重復(fù)性好的血清學(xué)檢測(cè)。傳統(tǒng)的乙肝檢測(cè)手段逐漸在病毒感染的傳染性、預(yù)后及療效判斷等方面的準(zhǔn)確性與敏感性、可重復(fù)性表現(xiàn)出很多不足之處。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡(jiǎn)便、診斷快速、特異性強(qiáng)和靈敏度高的乙型肝炎病毒前si抗原快速診斷試劑盒及其制備方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案是一種乙肝病毒前Sl抗原快速診斷試劑盒，其特征是其卡盒中含有乙肝病毒前Sl抗原檢測(cè)試紙條，所述試紙條是由樣品墊、金標(biāo)墊、反應(yīng)膜和吸水層依次粘貼在襯卡上，其中所述金標(biāo)墊是由膠體金標(biāo)記的抗-HBs多克隆抗體載于玻璃纖維墊上制成，所述反應(yīng)膜是在硝酸纖維膜上包被抗-si單克隆抗體制成檢測(cè)線，同時(shí)包被重組乙肝表面抗原制成質(zhì)控線。本發(fā)明上述乙肝病毒前Sl抗原快速診斷試劑盒的制備方法，其選擇玻璃纖維做樣品墊、吸水紙做吸水層、有粘附作用的紙卡做襯卡，其特征在于還包括以下步驟(a)金標(biāo)墊的制備其是將膠體金標(biāo)記的抗-HBs多克隆抗體載于載體玻璃纖維墊上，在硅化處理后的玻璃容器中加入濃度為0.01%的氯金酸，加熱至沸騰，攪動(dòng)下按照體積比100:2加入濃度為1%的檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸25分鐘，冷去后用超純水恢復(fù)到原體積，制成直徑為25nm左右的膠體金顆粒，用0.1MK2C03溶液調(diào)節(jié)膠體金pH為7.0，將膠體金與抗-HBs多克隆抗體混合，調(diào)節(jié)比例使抗體的最終濃度為3-6iig/ml，室溫震蕩反應(yīng)30分鐘，然后加入5%PEG20000至終濃度為0.25%，混勻后室溫靜置5分鐘，15000rpm離心30分鐘后，棄去上清，加入與膠體金等體積的洗脫液充分溶解沉淀物，同樣轉(zhuǎn)速離心，棄去上清后，將沉淀用1/10初始膠體金體積的金標(biāo)抗體保存液溶解，4t:保存待用，用其包被玻璃纖維，每毫升膠體金標(biāo)記抗體鋪約10-15平方厘米的玻璃纖維墊，冷凍真空干燥后，分別切成0.4-0.6cm2金標(biāo)墊塊；(b)反應(yīng)膜的制備其是在硝酸纖維膜上包被抗-S1單克隆抗體制成檢測(cè)線，同時(shí)4包被重組乙肝表面抗原制成質(zhì)控線，選擇0.01MpH7.5磷酸鹽緩沖液作為包被液，檢測(cè)線包被的抗-SI單克隆抗體濃度為0.8-1.2mg/ml，質(zhì)控線包被的重組乙肝表面抗原的濃度為0.5-1.Omg/ml，先用包被液沖洗劃膜儀管道，設(shè)定劃膜儀移動(dòng)速度和包被濃度，然后加入檢測(cè)線抗體和對(duì)照線抗原，在硝酸纖維膜上劃線，檢測(cè)線位于膜中間位置，質(zhì)控線在檢測(cè)線上方，二者的寬度為0.7-lmm且質(zhì)控線和檢測(cè)線相距4-5mm，包被后膜置室溫晾40分鐘，封閉液中浸泡5分鐘，室溫晾40分鐘，保存待用；(c)試紙條的組裝將所述樣品墊切成長(zhǎng)度30cm和寬度28mm，金標(biāo)墊切成長(zhǎng)度30cm和寬度10-15mm，反應(yīng)膜切成長(zhǎng)度30cm和寬度25mrn，水層剪切成長(zhǎng)度30cm和寬度27mrn，然后依次將其貼在襯卡上，組成大板后，切割成長(zhǎng)度8cm和寬度3mm的單個(gè)人份試紙條，最后裝入卡盒內(nèi)。本發(fā)明應(yīng)用層析式雙抗體夾心法的原理，將膠體金標(biāo)記的抗-HBs多克隆抗體載于玻璃纖維墊上制成金標(biāo)墊；反應(yīng)膜是在硝酸纖維膜上包被抗-SI單克隆抗體制成檢測(cè)線，同時(shí)包被重組乙肝表面抗原制成質(zhì)控線。當(dāng)待檢樣本中含有前SI抗原，形成檢測(cè)線和質(zhì)控線兩條紫紅色線，判為陽(yáng)性，反之則只有一條紫紅色線，判為陰性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是具有較高的特異性和靈敏度，檢測(cè)迅速、方便、快捷，操作簡(jiǎn)便，無(wú)需專門的設(shè)施，很少出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性的問(wèn)題，對(duì)于乙肝的臨床診斷與指導(dǎo)治療具有重要作用；制備方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、重復(fù)性好。試劑盒采用膠體金診斷分析技術(shù)，用于檢測(cè)人血清或血漿中的乙型肝炎病毒前S1抗原，對(duì)指導(dǎo)和幫助乙肝的的早期診斷和臨床治療與預(yù)防有重要作用。膠體金法乙型肝炎病毒前SI抗原診斷試劑盒將以其快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)成為繼酶免法后又一檢測(cè)前SI的主要方法。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中1.樣品墊，2.金標(biāo)墊，3.反應(yīng)膜，4.吸水層，5.襯卡。具體實(shí)施例方式本發(fā)明試劑盒采用膠體金層析技術(shù)，檢測(cè)血清中是否存在乙型肝炎前Sl抗原。由圖1中可以看出，本發(fā)明一種乙肝病毒前S1抗原快速診斷試劑盒，其卡盒中含有乙肝病毒前Sl抗原檢測(cè)試紙條，所述試紙條是由樣品墊1、金標(biāo)墊2、反應(yīng)膜3和吸水層4依次粘貼在襯卡5上，所述的樣品墊1是由玻璃纖維制成，吸水層4是由吸水紙制成，襯卡5是由有粘附作用的紙卡制成，它們均為市售產(chǎn)品。本發(fā)明的特點(diǎn)是所述金標(biāo)墊2是由膠體金標(biāo)記的抗-HBs多克隆抗體載于玻璃纖維墊上制成，所述反應(yīng)膜3是在硝酸纖維膜上包被抗-Sl單克隆抗體制成檢測(cè)線，同時(shí)包被重組乙肝表面抗原制成質(zhì)控線。本發(fā)明上述乙肝病毒前Sl抗原快速診斷試劑盒的制備方法，其選擇玻璃纖維做樣品墊、吸水紙做吸水層、有粘附作用的紙卡做襯卡，其還包括以下步驟(a)金標(biāo)墊的制備其是將膠體金標(biāo)記的抗-HBs多克隆抗體載于載體玻璃纖維墊上，在硅化處理后的玻璃容器中加入濃度為0.01%的氯金酸，加熱至沸騰，攪動(dòng)下按照體積比100:2加入濃度為1%的檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸25分鐘，冷去后用超純水恢復(fù)到原體積，制成直徑為25nm左右的膠體金顆粒，用0.1MK2C03溶液調(diào)節(jié)膠體金pH為7.0，將膠體金與抗-HBs多克隆抗體混合，調(diào)節(jié)比例使抗體的最終濃度為3-6g/ml，室溫震蕩反應(yīng)30分鐘，然后加入5%PEG20000至終濃度為0.25%，混勻后室溫靜置5分鐘，15000rpm離心30分鐘后，棄去上清，加入與膠體金等體積的洗脫液充分溶解沉淀物，同樣轉(zhuǎn)速離心，棄去上清后，將沉淀用1/10初始膠體金體積的金標(biāo)抗體保存液溶解，4t:保存待用，用其包被玻璃纖維，每毫升膠體金標(biāo)記抗體鋪約10-15平方厘米的玻璃纖維墊，冷凍真空干燥后，分別切成0.4-0.6cm2金標(biāo)墊塊；(b)反應(yīng)膜的制備其是在硝酸纖維膜上包被抗-SI單克隆抗體制成檢測(cè)線，同時(shí)包被重組乙肝表面抗原制成質(zhì)控線，選擇0.01MpH7.5磷酸鹽緩沖液作為包被液，檢測(cè)線包被的抗-SI單克隆抗體濃度為0.8-1.2mg/ml，質(zhì)控線包被的重組乙肝表面抗原的濃度為0.5-1.Omg/ml，先用包被液沖洗劃膜儀管道，設(shè)定劃膜儀移動(dòng)速度和包被濃度，然后加入檢測(cè)線抗體和對(duì)照線抗原，在硝酸纖維膜上劃線，檢測(cè)線位于膜中間位置，質(zhì)控線在檢測(cè)線上方，二者的寬度為0.7-lmm且質(zhì)控線和檢測(cè)線相距4-5mm，包被后膜置室溫晾40分鐘，封閉液中浸泡5分鐘，室溫晾40分鐘，保存待用；(c)試紙條的組裝將所述樣品墊切成長(zhǎng)度30cm和寬度28mm，金標(biāo)墊切成長(zhǎng)度30cm和寬度10-15mm，反應(yīng)膜切成長(zhǎng)度30cm和寬度25mm，水層剪切成長(zhǎng)度30cm和寬度27mm，然3cm和寬度3mm的單個(gè)人份試紙條，最后后依次將其貼在襯卡上，組成大板后，切割成長(zhǎng)裝入卡盒內(nèi)。本發(fā)明具體制備中主要試劑的配方為本發(fā)明所述的洗脫液為Tris-HClpH9.30.05MBSAlOg/L本發(fā)明所述的保存液為Tris-HClpH9.30.05M蔗糖5g/LBSA5g/L甘氨酸lg/L吐溫200.lml/L硫柳汞鈉0.5g/L酪蛋白2g/L本發(fā)明所述的包被液Na2HP0412H202.68gNaH2P042H200.39g加超純水至1000ml本發(fā)明所述的封閉液BSA20gNaN30.5g0.01MpH7.5PB1000ml其它主要試劑的配置為A1%氯金酸氯金酸lg超純水100mlB1%檸檬酸三鈉氯金酸lg超純水100mlC10%NaClNaCl10g超純水100mlD0.1MK2C03K2C0313.8g超純水1000mlE5%PEG20000PEG200005g超純水100ml本發(fā)明選擇超純水燒制金子，制備的膠體金顏色純正，膠體均勻，無(wú)沉淀。本發(fā)明膠體金顆粒度的選擇用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，通過(guò)改變氯金酸和檸檬酸三鈉的比例可以得到不同大小的膠體金顆粒，將不同顆粒度的膠體金分別標(biāo)記抗體，比較試紙條的靈敏度和特異性。靈敏度用靈敏度質(zhì)控血清考核，各取3iU金標(biāo)記抗體分別和50iU靈敏度質(zhì)控血清稀釋度混合，然后和包被好的檢測(cè)線抗體反應(yīng)，15分鐘觀察結(jié)果；特異性用15份特異性質(zhì)控血清考核，各取3iU金標(biāo)記抗體分別和50iU15份特異性質(zhì)控血清混合，然后和包被好的檢測(cè)線抗體反應(yīng)，15分鐘觀察結(jié)果。結(jié)果如下表所示0.01%氯金酸1%檸檬酸三鈉靈敏度質(zhì)控血清15份特異性質(zhì)控血清1:21:41:81:16基質(zhì)液100ml4ml++--—全部陰性100ml2ml++++++--全部陰性畫(huà)ml1.2ml+++++++-3份假陽(yáng)性100ml0.8ml+++++++一4份假陽(yáng)性綜合分析觀察結(jié)果，選用0.01%的氯金酸和1%檸檬酸三鈉為100:2為最適比例，直徑為25nm左右。本發(fā)明最適標(biāo)記蛋白量的確定將待標(biāo)記的抗體逐級(jí)稀釋，各取100iU分別加入一系列裝有l(wèi)ml膠體金的試管，混勻5分鐘后于上述管中分別加入0.lml10%NaCl，混勻，靜止30分鐘，觀察結(jié)果，未加入抗體和加入量不足以穩(wěn)定膠體金的試管，呈現(xiàn)由紅到藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而加入蛋白質(zhì)達(dá)到最低穩(wěn)定量的試管則保持紅色不變。膠體金由紅變藍(lán)，證明抗體量不夠，膠體穩(wěn)定性差。最終確定膠體金最適蛋白質(zhì)標(biāo)記量為3-6iig/ml。本發(fā)明最適標(biāo)記pH的確定分別將膠體金pH值調(diào)成p朋.0，pH7.0，pH7.5進(jìn)行標(biāo)記，其他條件一致，考察標(biāo)記物的穩(wěn)定性和活性。穩(wěn)定性指膠體穩(wěn)定性，用標(biāo)記時(shí)溶液是否有沉淀來(lái)考核；靈敏度用靈敏度質(zhì)控血清考核。結(jié)果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由此可見(jiàn)，pH為7.0條件下標(biāo)記效果較好。本發(fā)明金標(biāo)記抗體干燥條件的選擇制得的金標(biāo)記抗體，用封閉液溶解，鋪在玻璃纖維上，在下述三種條件下干燥，組裝成條，用靈敏度質(zhì)控血清考核其靈敏度，特異性用15份特異性質(zhì)控血清考核。結(jié)果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從上表可知冷凍真空干燥效果較好，所以生產(chǎn)以冷凍真空干燥作為干燥條件。本發(fā)明金標(biāo)記抗體量的確定金標(biāo)記抗體離心沉淀后，用約1/3制金體積的封閉液吹散金標(biāo)抗體，恢復(fù)膠體狀態(tài)。用玻璃纖維均勻吸附，每毫升金鋪約8平方厘米的玻璃墊。冷凍真空干燥后，分別切成0.2cm2、0.4cm2、0.6cm2、0.8cm2金標(biāo)墊塊，與上述包被配比，用靈敏度質(zhì)控血清考核其靈敏度，特異性用15份特異性質(zhì)控血清考核。結(jié)果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由此可見(jiàn)，O.4-0.6ci^模式最佳。本發(fā)明層析膜的選擇金標(biāo)檢測(cè)試紙所用硝酸纖維膜是該試劑成敗的關(guān)鍵，膜的孔徑和蛋白吸附性是一對(duì)矛盾，孔徑越大，爬升速度越快，但吸附蛋白能力差，影響靈敏度；孔徑越小，吸附蛋白能力強(qiáng)，但爬升速度慢。為此，我們進(jìn)行了廣泛的篩選，主要測(cè)定爬升速度和蛋白的吸附能力。爬升速度測(cè)定將硝酸纖維膜剪成0.4cmX2.5cm的膜，平貼于不干膠板上，從一端加血清20iU，記錄血清爬完膜全長(zhǎng)所需時(shí)間。蛋白的吸附能力將lmg/ml的PreSl單抗點(diǎn)在膜上，每點(diǎn)1Pl，用封閉液封閉5分鐘，與乙肝前S1的陽(yáng)性血清室溫反應(yīng)10分鐘，洗滌，再與金標(biāo)記抗體反應(yīng)，洗滌，觀察金標(biāo)斑點(diǎn)的深淺作為膜蛋白吸附性的相對(duì)指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>綜合分析觀察結(jié)果，最終選擇SARTORIUS5uNC膜來(lái)做層析膜。本發(fā)明包被濃度的選擇將抗-Sl單抗用0.01mol/LpH7.5的磷酸鹽緩沖液分別稀釋為1.5mg/ml、l.2mg/ml、0.8mg/ml、0.5mg/ml，用劃膜儀均勻劃于硝酸纖維膜，組裝試紙條，在其他條件不變的情況下，比較結(jié)果，靈敏度用靈敏度質(zhì)控血清考核，特異性用特異性質(zhì)控血清考核。結(jié)果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>可見(jiàn)，包被濃度在0.8-1.2mg/ml時(shí)，其靈敏度和特異性均較好，所以抗體包被濃度可確定為O.8-1.2mg/ml。本發(fā)明采用的是檸檬酸三鈉還原法制備金標(biāo)墊。先將制備膠體金用的玻璃容器進(jìn)行硅化處理，再加入1ml1%的氯金酸和99ml超純水混勻，加熱至沸騰，攪動(dòng)下迅速加入2ml1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸25分鐘，冷去后用超純水恢復(fù)到原體積，即制成直徑為25nm左右的膠體金顆粒，該顆粒度的膠體金用于標(biāo)記抗體，制成的試紙條靈敏度高和特異性好。用0.1MK2C03溶液調(diào)節(jié)金溶膠pH7.0，將膠體金與抗_HBs多克隆抗體混合，調(diào)節(jié)比例使抗體的最終濃度為3-6iig/ml，室溫震蕩反應(yīng)30分鐘，然后加入5%PEG20000至終濃度為0.25%，混勻后室溫靜置5分鐘，15000rpm離心30分鐘后，棄去上清，加入與膠體金等體積的洗脫液充分溶解沉淀物，同樣轉(zhuǎn)速離心，棄去上清后加入1/10膠體金體積的保存液，吹散膠體金標(biāo)記的抗-HBs多克隆抗體，恢復(fù)至膠體狀態(tài)，fC保存?zhèn)溆?。將乙肝前Sl抗原包被在硝酸纖維膜上，滴加陽(yáng)性血清2L陰性血清1孔分別2iU，反應(yīng)5分鐘后洗膜，然后加金標(biāo)記的抗體2iU，反應(yīng)5分鐘，洗膜后觀察陽(yáng)性孔有紅斑，而陰性孔無(wú)紅斑，證明抗體標(biāo)記成功。用膠體金標(biāo)記的多克隆抗體包被玻璃纖維，每毫升金鋪約10-15平方厘米的玻璃纖維墊。冷凍真空干燥后，分別切成0.4-0.6cm2金標(biāo)墊塊。本發(fā)明反應(yīng)膜的制備其是在硝酸纖維膜上包被抗-SI單克隆抗體制成檢測(cè)線，同時(shí)包被重組乙肝表面抗原制成質(zhì)控線。檢測(cè)線包被的是抗-Sl單抗；質(zhì)控線包被的是重組乙肝表面抗原。選擇0.01MpH7.5磷酸鹽緩沖液作為包被液，該包被液靈敏度高且特異性好，包被時(shí)重組乙肝表面抗原濃度為0.5-1.0mg/ml，抗-SI單克隆抗體濃度為0.8_1.2mg/ml。包被前仔細(xì)檢查設(shè)備是否正常，先用包被液沖洗劃膜儀管道，設(shè)定劃膜儀移動(dòng)速度和包被濃度，然后加入檢測(cè)線抗體和對(duì)照線抗原，調(diào)試后在硝酸纖維膜上劃線，檢測(cè)線位于膜中間位置，質(zhì)控線在檢測(cè)線上方，二者的寬度為0.7-lmm且質(zhì)控線和檢測(cè)線相距4-5mm，包被后膜置室溫晾40分鐘，封閉液中浸泡5分鐘，室溫晾40分鐘，保存待用。本發(fā)明試紙條的組裝將所述樣品墊切成長(zhǎng)度30cm和寬度28mm，金標(biāo)墊切成長(zhǎng)度30cm和寬度10-15mm，反應(yīng)膜切成長(zhǎng)度30cm和寬度25mm，水層剪切成長(zhǎng)度30cm和寬度27mm，然后如圖1所示依次將其貼在襯卡上，組成大板后，切割成長(zhǎng)度8cm和寬度3mm單個(gè)人份試紙條，最后裝入卡盒內(nèi)。檢測(cè)時(shí)取出試紙條平放，在加樣孔內(nèi)加待測(cè)樣本約45iU，15-20分鐘觀察結(jié)果。當(dāng)試紙條僅在質(zhì)控線位置上出現(xiàn)一條紫紅色條帶，結(jié)果為陰性；當(dāng)試紙條在檢測(cè)線和質(zhì)控線位置上各出現(xiàn)一條紫紅色條帶，結(jié)果為陽(yáng)性；當(dāng)試紙條在檢測(cè)線和質(zhì)控線位置上均未出現(xiàn)紫紅色條帶，則結(jié)果無(wú)效。本發(fā)明快速檢測(cè)乙型肝炎病毒前Sl抗原試劑盒各項(xiàng)性能指標(biāo)的考核表12-8t:保存試劑盒檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由表1中檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)A.特異性考核檢測(cè)陰性參考品符合率，15份特異性質(zhì)控血清應(yīng)均為陰性；同時(shí)檢測(cè)陽(yáng)性參考品符合率，15份陽(yáng)性質(zhì)控血清至多一份出現(xiàn)假陰性。B.靈敏度考核用靈敏度質(zhì)控血清檢測(cè)，要求1:8以上稀釋(包括1:8)能夠檢出。C.精密度考核試紙條顯色時(shí)間及顯色強(qiáng)度應(yīng)均勻一致。表237t:放置6天試劑盒檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表2中檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)D.穩(wěn)定性考核37t:放置6天試劑盒仍可通過(guò)公司內(nèi)部質(zhì)控品檢測(cè)，各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)和成品檢定項(xiàng)目測(cè)定值均在質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。此外，在三家醫(yī)療機(jī)構(gòu)的臨床考核中，采用國(guó)家批準(zhǔn)上市的主流產(chǎn)品，如上海阿爾法生物技術(shù)有限公司的乙型肝炎病毒前S1抗原診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果都顯示，按照此制造檢定規(guī)程生產(chǎn)的快速檢測(cè)乙型肝炎病毒前Sl抗原試劑盒，其靈敏度、特異性、精密性、穩(wěn)定性等各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)。權(quán)利要求一種乙肝病毒前S1抗原快速診斷試劑盒，其特征是其卡盒中含有乙肝病毒前S1抗原檢測(cè)試紙條，所述試紙條是由樣品墊、金標(biāo)墊、反應(yīng)膜和吸水層依次粘貼在襯卡上，其中所述金標(biāo)墊是由膠體金標(biāo)記的抗-HBs多克隆抗體載于玻璃纖維墊上制成，所述反應(yīng)膜是在硝酸纖維膜上包被抗-S1單克隆抗體制成檢測(cè)線，同時(shí)包被重組乙肝表面抗原制成質(zhì)控線。2.—種如權(quán)利要求l所述的乙肝病毒前Sl抗原快速診斷試劑盒的制備方法，其選擇玻璃纖維做樣品墊、吸水紙做吸水層、有粘附作用的紙卡做襯卡，其特征在于還包括以下步驟(a)金標(biāo)墊的制備其是將膠體金標(biāo)記的抗-HBs多克隆抗體載于載體玻璃纖維墊上，在硅化處理后的玻璃容器中加入濃度為0.01%的氯金酸，加熱至沸騰，攪動(dòng)下按照體積比100:2加入濃度為1%的檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸25分鐘，冷去后用超純水恢復(fù)到原體積，制成直徑為25nm左右的膠體金顆粒，用0.1MK2C03溶液調(diào)節(jié)膠體金pH為7.0，將膠體金與抗-HBs多克隆抗體混合，調(diào)節(jié)比例使抗體的最終濃度為3-6g/ml，室溫震蕩反應(yīng)30分鐘，然后加入5%PEG20000至終濃度為0.25%，混勻后室溫靜置5分鐘，15000rpm離心30分鐘后，棄去上清，加入與膠體金等體積的洗脫液充分溶解沉淀物，同樣轉(zhuǎn)速離心，棄去上清后，將沉淀用1/10初始膠體金體積的金標(biāo)抗體保存液溶解，4t:保存待用，用其包被玻璃纖維，每毫升膠體金標(biāo)記抗體鋪約10-15平方厘米的玻璃纖維墊，冷凍真空干燥后，分別切成0.4-0.6cm2金標(biāo)墊土央；(b)反應(yīng)膜的制備其是在硝酸纖維膜上包被抗-Sl單克隆抗體制成檢測(cè)線，同時(shí)包被重組乙肝表面抗原制成質(zhì)控線，選擇0.01MpH7.5磷酸鹽緩沖液作為包被液，檢測(cè)線包被的抗-SI單克隆抗體濃度為0.8-1.2mg/ml，質(zhì)控線包被的重組乙肝表面抗原的濃度為0.5-1.Omg/ml，先用包被液沖洗劃膜儀管道，設(shè)定劃膜儀移動(dòng)速度和包被濃度，然后加入檢測(cè)線抗體和對(duì)照線抗原，在硝酸纖維膜上劃線，檢測(cè)線位于膜中間位置，質(zhì)控線在檢測(cè)線上方，二者的寬度為0.7-lmm且質(zhì)控線和檢測(cè)線相距4-5mm，包被后膜置室溫晾40分鐘，封閉液中浸泡5分鐘，室溫晾40分鐘，保存待用；(c)試紙條的組裝將所述樣品墊切成長(zhǎng)度30cm和寬度28mm，金標(biāo)墊切成長(zhǎng)度30cm和寬度10-15mm，反應(yīng)膜切成長(zhǎng)度30cm和寬度25mm，水層剪切成長(zhǎng)度30cm和寬度27mm，然后依次將其貼在襯卡上，組成大板后，切割成長(zhǎng)度8cm和寬度3mm的單個(gè)人份試紙條，最后裝入卡盒內(nèi)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述乙肝病毒前SI抗原快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于所說(shuō)洗脫液的組成配方為Tris-HCl(pH9.3)0.05M、BSA10g/L。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述乙肝病毒前SI抗原快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于保存液的組成配方為Tris-HCl(pH9.3)0.05M、蔗糖5g/L、BSA5g/L、甘氨酸lg/L、吐溫200.lml/L、硫柳汞鈉0.5g/L、酪蛋白2g/L。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述乙肝病毒前Sl抗原快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于所述包被液的組成配方為:Na2HP0412H202.68g、NaH2P042H200.39g、超純水lOOOml。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述乙肝病毒前SI抗原快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于所述封閉液的組成配方為:BSA20g、NaN30.5g、0.01MpH7.5PB1000ml。全文摘要本發(fā)明涉及一種乙肝病毒前S1抗原快速診斷試劑盒及其制備方法，其主要包括乙型肝炎前S1抗原檢測(cè)試紙條，試紙條由樣品墊、金標(biāo)墊、反應(yīng)膜和吸水層依次粘貼在襯卡上，然后裝入卡盒中。其金標(biāo)墊的制備是將膠體金標(biāo)記的抗-HBs多克隆抗體載于玻璃纖維墊上；反應(yīng)膜的制備是在玻璃纖維墊相連的檢測(cè)載體硝酸纖維膜上包被抗-S1單克隆抗體制成檢測(cè)線，同時(shí)包被重組乙肝表面抗原制成質(zhì)控線。本發(fā)明當(dāng)待檢樣本中含有前S1抗原，形成檢測(cè)線和質(zhì)控線兩條紫紅色線，判為陽(yáng)性；反之則只有一條紫紅色線，判為陰性。本發(fā)明用于檢測(cè)人血清或血漿中的乙型肝炎病毒前S1抗原，具有操作簡(jiǎn)便、診斷快速、特異性強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N33/577GK101738476SQ20081016002公開(kāi)日2010年6月16日申請(qǐng)日期2008年11月13日優(yōu)先權(quán)日2008年11月13日發(fā)明者叢日獻(xiàn),姚繼承,王曉偉,賈向陽(yáng),郭蘭英申請(qǐng)人:威海威高生物科技有限公司