專利名稱：甲氰菊酯人工抗原的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甲氰菊酯人工抗原的制備方法，具體地說是利用碳二亞胺法，將甲氰菊酯[Fenpropathrin，(RS)-a-氰基-3-苯氧芐基2，2，3，3-四甲基環(huán)丙烷羧酸酯]生產(chǎn)過程中的一種非常重要的前體物質(zhì)甲氰菊酸(2，2，3，3-四甲基環(huán)丙烷羧酸)與載體分子(蛋白質(zhì))直接交聯(lián)制備甲氰菊酯人工抗原的方法，屬于免疫化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在免疫學(xué)領(lǐng)域中，為使無免疫原性的小分子物質(zhì)(常稱為半抗原，Hapten)能在動物體內(nèi)誘發(fā)產(chǎn)生抗體，常要將這種半抗原與某種大分子載體如蛋白質(zhì)或多肽等交聯(lián)結(jié)合而成為人工抗原，再注射進(jìn)動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體，提純抗體之后，即可用于免疫分析，它是當(dāng)前臨床醫(yī)學(xué)、食品檢測、農(nóng)藥殘留分析中最活躍的領(lǐng)域之一。
眾所周知，擬除蟲菊酯殺蟲劑性質(zhì)穩(wěn)定，殺蟲譜廣，殺蟲活性高，屬神經(jīng)性毒劑，在世界上應(yīng)用非常廣泛，在中國也是用量增長最快的農(nóng)藥之一。其中甲氰菊酯是應(yīng)用較多的一種。甲氰菊酯對高等動物的毒性中等，但對魚類等水生生物為高毒，1-2ug/L可致魚死亡，而且常溫下在底泥中的半衰期較長，可在水體環(huán)境及水生生物體內(nèi)蓄積和殘留，對水生生態(tài)環(huán)境存在一定的潛在風(fēng)險。因此水體環(huán)境或水生生物體內(nèi)甲氰菊酯的含量檢測顯得十分重要。
目前國際上慣用的甲氰菊酯殘留的標(biāo)準(zhǔn)分析方法是氣相色譜(GC)法和高效液相色譜(HPLC)法。但這些方法需要昂貴的儀器和試劑，冗長的樣品前處理過程，無法滿足大批樣品現(xiàn)場快速檢測的需要。近年來國際上十分重視酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測技術(shù)，這種方法快速、靈敏，具有很好的選擇性和專一性，并節(jié)省了復(fù)雜的樣品前處理步驟。
為了建立甲氰菊酯的免疫測定方法，首先必須得到抗甲氰菊酯的抗體。甲氰菊酯分子結(jié)構(gòu)簡單，分子量(349.4)小，屬于半抗原，不能直接免疫制取抗體。必須首先將其與載體蛋白偶聯(lián)制備出它的完全抗原，才能誘發(fā)動物產(chǎn)生抗體。在已有技術(shù)中，曾采用碳二亞胺法對甲氰菊酯與牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行了直接偶聯(lián)，但不成功，原因是甲氰菊酯本身無游離羧基，無法與BSA上的氨基脫水交聯(lián)。由于采用ELISA方法測定甲氰菊酯國內(nèi)至今無成功先例，國外的文獻(xiàn)也僅有Wengatz的報導(dǎo)，其在甲氰菊酯的芳香環(huán)端引入羧基與BSA偶聯(lián)，但反應(yīng)條件比較苛刻，生產(chǎn)效率低，且實驗過程比較復(fù)雜具備。因此甲氰菊酯人工抗原的合成十分重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，從而提供一種甲氰菊酯人工抗原的制備方法，其應(yīng)用碳二亞胺將甲氰菊酸和牛血清白蛋白偶聯(lián)，構(gòu)建出人工結(jié)合抗原；本方法操作簡便，一步完成反應(yīng)，克服了其它方法繁瑣、生產(chǎn)率低、特異性差等缺點，為建立甲氰菊酯的免疫學(xué)分析技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明的主要解決方案是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明甲氰菊酯人工抗原的制備方法采用以下工藝步驟1、取50～200mg甲氰菊酸，溶于1～5mL 25％的乙醇溶液中，經(jīng)溶解4～6h后離心，取上清液；2、取100～400mg牛血清白蛋白(BSA)和50～200mg碳二亞胺(EDC)，分別溶于5～10mL和1～6mL的無菌水中；3、向牛血清白蛋白(BSA)溶液中邊攪拌邊緩慢滴加1～5mL的甲氰菊酸上清液和1～3mL的碳二亞胺(EDC)溶液，于3.8～4.2℃冰浴下遮光反應(yīng)5～7h；4、再向上述混合液中滴加剩余的1～3mL碳二亞胺(EDC)溶液，于3.8～4.2℃冰浴下繼續(xù)遮光反應(yīng)23～25h；5、反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)離心后，取上清液于透析袋中，于0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液中，在3～5℃溫度下透析4～6d，每天更換2次透析液，透析完畢后分裝，留小部份進(jìn)行鑒定，其余于-18～-22℃凍存。
本發(fā)明所述的牛血清白蛋白(BSA)可采用卵清蛋白(OVA)。
本發(fā)明所述的離心速度為3800～4200r/min，離心時間為8～12min。
本發(fā)明所述的凍存時間六個月之內(nèi)。
本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點
本發(fā)明選用合成甲氰菊酯的前體物質(zhì)甲氰菊酸，在碳二亞胺的作用下與牛血清白蛋白直接偶聯(lián)，經(jīng)透析和冷凍后得到甲氰菊酯的人工抗原，產(chǎn)物上所連接的小分子具有半抗原的結(jié)構(gòu)，絲毫不改變其原有的構(gòu)型；通過紫外光譜掃描、SDS凝膠電泳和免疫動物的方法，證實人工抗原合成成功；本方法操作簡便，一步完成反應(yīng)，克服了其它方法繁瑣、生產(chǎn)率低、特異性差等缺點，為以后篩選出它的特異性抗體和建立免疫分析方法提供基礎(chǔ)。
具體實施例方式
下面本發(fā)明甲氰菊酯人工抗原的制備方法將結(jié)合實施例作進(jìn)一步描述實施例一本發(fā)明甲氰菊酯人工抗原的制備方法采用以下工藝步驟稱取50mg甲氰菊酸[Fenpropathrin，(RS)-a-氰基-3-苯氧芐基2，2，3，3-四甲基環(huán)丙烷羧酸酯]，溶于2mL 25％(重量百分?jǐn)?shù))的乙醇溶液中，溶解4h后進(jìn)行離心，(上海精科實業(yè)公司生產(chǎn)的800型離心沉淀器)，離心速度4000r/min，離心時間10min，取上清液待用。再取100mg牛血清白蛋白(BSA)和50mg碳二亞胺(EDC)，分別溶于5mL和3mL的無菌水中，向牛血清白蛋白BSA溶液中邊攪拌邊緩慢滴加2mL的甲氰菊酸上清液和2mL的碳二亞胺(EDC)溶液，于4℃冰浴下遮光反應(yīng)6h，再向上述混合液中滴加剩余的1mL碳二亞胺(EDC)溶液，于4℃冰浴下繼續(xù)遮光反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，以4000r/min離心10min，取上清液于透析袋中(存余的料液去除)，于0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液中4℃透析5d，每天更換2次透析液，透析完畢后分裝，留小部份進(jìn)行鑒定，其余于-20℃凍存，凍存時間六個月之內(nèi)。經(jīng)冷凍可獲得人工抗原。
人工抗原的鑒定人工免疫抗原的鑒定采用紫外光譜法、SDS聚丙烯酰胺電泳法和免疫動物法。根據(jù)免疫復(fù)合物合成比例，取一定量2mg/mL甲氰菊酸溶液，4mg/mL牛血清白蛋白(BSA)溶液，相當(dāng)于4mg/mL蛋白的甲氰菊酸復(fù)合物稀釋液，以含25％(重量百分?jǐn)?shù))乙醇的PBS為參比，對牛血清白蛋白(BSA)、甲氰菊酸和甲氰菊酸-BSA偶合物進(jìn)行200nm-800nm的紫外光譜掃描，牛血清白蛋白(BSA)在280nm處有最大吸收，最大吸收值為2.8；甲氰菊酸在230nm處有最大吸收，最大吸收值為1.9；甲氰菊酸-BSA偶合物在254nm處有最大吸收，最大吸收值為2.2。三者的紫外掃描圖譜出現(xiàn)明顯交叉，蛋白質(zhì)大分子和化學(xué)小分子含有各自不同的紫外可見吸收峰，但在偶聯(lián)物紫外可見掃描光譜中表現(xiàn)各自光譜圖迭加的性質(zhì)，說明甲氰菊酯和牛血清白蛋白(BSA)連接成功。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法可從樣品的泳動率了解樣品分子量的大小。樣品分子量越小，泳動率越大。甲氰菊酸與牛血清白蛋白(BSA)如果連接成功，分子量就要大一些，電泳時的譜帶上就會有所差異。電泳結(jié)果可見牛血清白蛋白(BSA)和甲氰菊酯-BSA有較為接近的電泳條帶，但牛血清白蛋白(BSA)的泳動率稍快于偶聯(lián)物，因為偶聯(lián)物的分子量略大于牛血清白蛋白(BSA)。
免疫動物證明產(chǎn)生了抗甲氰菊酯的抗體(1)選擇健康新西蘭白兔，將免疫抗原用生理鹽水稀釋到1.0mg/mL，吸入1mL到注射器中，加入等量的弗氏完全佐劑(第1次免疫)或弗氏不完全佐劑(第2到第5次免疫)，通過醫(yī)用3通閥將抗原和佐劑充分混合乳化。第1-5次背部皮下多點免疫；第6次直接用免疫抗原0.3mL耳靜脈注射免疫。每次免疫間隔時間為7d，總計免疫42d。免疫結(jié)束后從兔子的耳靜脈取血(約0.5mL)，放置在4℃冰箱中過夜。第2天取出，4000r/min離心，可得約0.2mL左右的抗血清。也可在冰箱中放置2小時后離心?？寡鍦y定方法采用ELISA酶標(biāo)儀法。(2)間接競爭EL工SA試驗在每條12孔的酶標(biāo)板的每孔中加入100μL用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋的包被抗原，內(nèi)含2.5μg的甲氰菊酸-OVA，37℃孵育1h后，移入4℃冰箱放置過夜。取出后用含0.5％Tween-20的PBS緩沖液(pH7.5，0.01mol/L)洗滌三次后甩干。在每條的前1～2孔加入50μL含0.1％明膠的pH7.5，0.01mol/L的PBS稀釋液，3～4孔加入用稀釋液配制的標(biāo)準(zhǔn)甲氰菊酯溶液50μL，內(nèi)含5μg甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，5～6孔同3～4孔，內(nèi)含10μg甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，7～8孔內(nèi)含20μg甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，9～10孔內(nèi)含100μg甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，11～12孔加入50μL稀釋液，然后在前10孔中加入用稀釋液配制的1∶400的抗血清50μL，11～12孔還是加入50μL的稀釋液，加完后放入37℃恒溫水浴中孵育1h，取出，同上用Tween-PBS緩沖液洗滌三次，然后每孔加入100μL用稀釋液配制的1∶5000的羊抗兔酶標(biāo)二抗，37℃恒溫水浴中孵育1h，取出用Tween-PBS緩沖液洗滌三次，加入100μL用pH5.0檸檬酸配制的鄰苯二胺和過氧化氫底物液，37℃恒溫水浴中放置15min，每孔加入50μL 10％硫酸，然后在酶標(biāo)儀上用490nm波長讀取OD值，取6孔平均計算結(jié)果。
競爭抑制ELISA試驗結(jié)果

上表數(shù)據(jù)說明加入甲氰菊酯孔的顏色均比沒加甲氰菊酯孔的顏色淺，比對照孔深，而且隨著所加入的甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品的增加，酶與底物反應(yīng)的顏色變得越來越淺，說明抗血清中存在能與甲氰菊酯反應(yīng)的抗體，從而證明免子產(chǎn)生了抗甲氰菊酯的特異性抗體，進(jìn)一步證明人工抗原合成成功。
實施例二本發(fā)明甲氰菊酯人工抗原的制備方法采用以下工藝步驟稱取100mg甲氰菊酸[Fenpropathrin，(RS)-a-氰基-3-苯氧芐基2，2，3，3-四甲基環(huán)丙烷羧酸酯]，溶于3mL 25％的乙醇溶液中，溶解4h后離心，取上清液。取200mg卵清蛋白(OVA)和100mg碳二亞胺(EDC)，分別溶于8mL和4mL的無菌水中，向卵清蛋白(OVA)溶液中邊攪拌邊緩慢滴加3mL的甲氰菊酸上清液和3mL的碳二亞胺(EDC)溶液，于4℃冰浴下遮光反應(yīng)6h，再向混合液中滴加剩余的1mL碳二亞胺(EDC)溶液，于4℃冰浴下繼續(xù)遮光反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，以4000r/min離心10min，取上清液于透析袋中，于0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液中4℃透析5d，每天更換2次透析液，透析完畢后冷凍六個月可獲得人工抗原。上述人工抗原采用實施例1中人工抗原的鑒定方法，通過紫外光譜掃描、SDS凝膠電泳和免疫動物的方法，證實人工抗原合成成功，為以后篩選出它的特異性抗體和建立免疫分析方法提供基礎(chǔ)。
實施例三本發(fā)明甲氰菊酯人工抗原的制備方法采用以下工藝步驟
稱取50mg甲氰菊酸[Fenpropathrin，(RS)-a-氰基-3-苯氧芐基2，2，3，3-四甲基環(huán)丙烷羧酸酯]，溶于2mL 25％的乙醇溶液中，溶解4h后離心，取上清液。取100mg牛血清白蛋白(BSA)和100mg碳二亞胺(EDC)，分別溶于5mL和3mL的無菌水中，向牛血清白蛋白(BSA)溶液中邊攪拌邊緩慢滴加2mL的甲氰菊酸上清液和2mL的碳二亞胺(EDC)溶液，于4℃冰浴下遮光反應(yīng)6h，再向混合液中滴加剩余的1mL碳二亞胺(EDC)溶液，于4℃冰浴下繼續(xù)遮光反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，以4000r/min離心10min，取上清液于透析袋中，于0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液中4℃透析5d，每天更換2次透析液，透析完畢后冷凍可獲得人工抗原。用卵清蛋白(OVA)取代BSA可同樣制得包被抗原。本實施例中獲得的人工抗原采用實施例1中人工抗原的鑒定方法，通過紫外光譜掃描、SDS凝膠電泳和免疫動物的方法，同樣可證實人工抗原合成成功?？朔似渌椒ǚ爆?、生產(chǎn)率低、特異性差等缺點，為建立甲氰菊酯的免疫學(xué)分析技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種甲氰菊酯人工抗原的制備方法，其特征是采用以下工藝步驟(1)、取50～200mg甲氰菊酸，溶于1～5mL25％的乙醇溶液中，經(jīng)溶解4～6h后離心，取上清液；(2)、取100～400mg牛血清白蛋白和50～200mg碳二亞胺，分別溶于5～10mL和1～6mL的無菌水中；(3)、向牛血清白蛋白溶液中邊攪拌邊緩慢滴加1～5mL的甲氰菊酸和1～3mL的碳二亞胺溶液，于3.8～4.2℃冰浴下遮光反應(yīng)5～7h；(4)、再向上述混合液中滴加剩余的1～3mL碳二亞胺溶液，于3.8～4.2℃冰浴下繼續(xù)遮光反應(yīng)23～25h；(5)、反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)離心后，取上清液于透析袋中，于0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液中，在3～5℃溫度下透析4～6d，透析后于-18～-22℃凍存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲氰菊酯人工抗原的制備方法，其特征在于所述的牛血清白蛋白可采用卵清蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲氰菊酯人工抗原的制備方法，其特征在于所述的離心速度為3800～4200r/min，離心時間為8～12min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲氰菊酯人工抗原的制備方法，其特征在于所述的凍存時間在六個月之內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種甲氰菊酯人工抗原的制備方法，屬于免疫化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域。其主要取甲氰菊酸，溶于乙醇溶液中，經(jīng)溶解后離心，取上清液待用；再取牛血清白蛋白和碳二亞胺，分別溶于無菌水中；向牛血清白蛋白溶液中邊攪拌邊緩慢滴加甲氰菊酸和碳二亞胺溶液，于冰浴下遮光反應(yīng)；再向上述混合液中滴加剩余的碳二亞胺溶液，于冰浴下繼續(xù)遮光反應(yīng)；經(jīng)離心取上清液于透析袋中透析，經(jīng)凍存獲得人工抗原。本發(fā)明通過紫外光譜掃描、SDS凝膠電泳和免疫動物的方法，證實人工抗原合成成功；本方法操作簡便，一步完成反應(yīng)，克服了其它方法繁瑣、生產(chǎn)率低、特異性差等缺點，為以后篩選出它的特異性抗體和建立免疫分析方法提供基礎(chǔ)。
文檔編號G01N33/53GK101017165SQ20071002023
公開日2007年8月15日 申請日期2007年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月9日
發(fā)明者吳偉, 楊健, 瞿建宏, 劉洪波 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心