專利名稱：檢測(cè)馬冠狀病毒抗體的方法及專用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動(dòng)物傳染病檢測(cè)方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
馬冠狀病毒(ECV)為單股正鏈RNA病毒。1975年美國(guó)地區(qū)發(fā)生40多例新生幼駒以水樣腹瀉、發(fā)燒和淋巴組織病變?yōu)樘卣鞯膫魅拘约膊?，最后被證明是馬冠狀病毒(Equine coronavirus，ECV)感染所致。1983年Huang JC等又從具有嚴(yán)重腹瀉的病馬體內(nèi)分離到ECV，從此ECV也就走進(jìn)了人們研究的視線，并取得了一定的研究進(jìn)展。
建立特異快速的ECV診斷方法是控制消滅ECV的前提。目前，顧炳泉等在澳大利亞實(shí)驗(yàn)室建立起一個(gè)有效的RT-PCR診斷方法，可以對(duì)糞便和病料中ECV病原進(jìn)行檢測(cè)，敏感性和特異性均較高。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)條件的優(yōu)化，研制了RT-PCR檢測(cè)馬冠狀病毒試劑盒。
RT-PCR檢測(cè)馬冠狀病毒的方法雖然敏感性和特異性均較高，但手段比較繁瑣，費(fèi)用也較高，且對(duì)技術(shù)的要求也很高，如果對(duì)待檢馬的血清進(jìn)行檢測(cè)，那么相對(duì)來(lái)說(shuō)，檢測(cè)過(guò)程將會(huì)相對(duì)簡(jiǎn)單，費(fèi)用和對(duì)技術(shù)的要求也較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)簡(jiǎn)單、方便，檢測(cè)效果好的檢測(cè)馬冠狀病毒抗體的方法及專用試劑盒。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是
一種檢測(cè)馬冠狀病毒抗體的方法，其特征是包括下列步驟(1)包被有馬冠狀病毒核衣殼基因表達(dá)產(chǎn)物的聚苯乙烯酶標(biāo)板的制備用22mM碳酸鈉溶液包被真核系統(tǒng)表達(dá)的總蛋白，包被濃度10μg/ml，100μl/孔加入ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))板孔中，4℃16小時(shí)，棄去包被液，用磷酸鹽緩沖液洗滌，用吸水紙拍干，用5％脫脂奶粉液滿孔封閉，并用磷酸鹽緩沖液洗滌，干燥后得包被有馬冠狀病毒核衣殼基因表達(dá)產(chǎn)物的聚苯乙烯酶標(biāo)板，即反應(yīng)板；(2)反應(yīng)板每空加入待檢馬血清，37℃反應(yīng)45min，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照B、陰性對(duì)照N、陽(yáng)性對(duì)照P；其中待檢馬血清以1∶100比例用PBST(含0.5％Tween-80的磷酸鹽緩沖液)稀釋，陰性對(duì)照N是陰性馬血清與PBST以1∶100比例稀釋，陽(yáng)性對(duì)照P是昆蟲細(xì)胞總蛋白免疫的陽(yáng)性小鼠血清與PBST以1∶200的比例稀釋；棄去孔內(nèi)液體，每孔加入磷酸鹽緩沖液洗滌，用吸水紙拍干；(3)每孔加入酶標(biāo)記的抗馬IgG單克隆抗體，用磷酸鹽緩沖液洗滌，吸水紙拍干；(4)每孔加入新鮮配制的0.4～1.2mg/ml的鄰苯二胺(ODP)底物應(yīng)用液顯色，37℃避光顯色，顯色結(jié)束后，每孔加入2M/L H2SO450μl/孔終止顯色，測(cè)定OD490nm值。
鄰苯二胺底物應(yīng)用液是在底物緩沖液中加入0.15％的30％H2O2制成，底物緩沖液是4.86ml的0.1M的檸檬酸和5.14ml的0.2M的磷酸氫二鈉溶液的混合液。
酶標(biāo)記的抗馬IgG單克隆抗體制備方法為每孔加入抗馬IgG單克隆抗體，37℃反應(yīng)45min，用磷酸鹽緩沖液洗滌、吸水紙拍干，然后每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗鼠IgG，37℃反應(yīng)45min。
一種檢測(cè)馬冠狀病毒抗體的方法專用試劑盒，其特征是包括有(1)包被有馬冠狀病毒核衣殼基因表達(dá)產(chǎn)物的聚苯乙烯酶標(biāo)板；(2)10×濃縮稀釋液0.1M pH7.2含0.5％Tween-80(吐溫-80)的磷酸鹽緩沖液；(3)10×濃縮洗液0.1M pH7.2含0.5％Tween-80的磷酸鹽緩沖液；(4)單抗抗馬IgG單克隆抗體，工作濃度為1∶2000；(5)HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG；(6)底物緩沖液4.86ml的0.1M的檸檬酸和5.14ml的0.2M的磷酸氫二鈉溶液的混合液；(7)雙氧水30％的雙氧水；(8)鄰苯二胺；(9)終止液2N H2SO4；(10)標(biāo)準(zhǔn)液昆蟲細(xì)胞總蛋白免疫的陽(yáng)性小鼠血清。
本發(fā)明運(yùn)用真核表達(dá)系統(tǒng)，重組桿狀病毒(rBac-ECV-N)感染昆蟲細(xì)胞，大量擴(kuò)增并獲得馬冠狀病毒核衣殼基因表達(dá)的蛋白。所表達(dá)的蛋白抗原包被ELISA板，加入待檢馬血清、抗馬IgG單克隆抗體、HRP酶標(biāo)抗體，研制出了簡(jiǎn)單、方便安全、特異有效、靈敏廉價(jià)的方法和試劑盒，便于馬冠狀病毒的診斷和疫情監(jiān)測(cè)及動(dòng)物疾病的治療，控制該病的流行和發(fā)生。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式(1)馬冠狀病毒核衣殼基因片段在原核系統(tǒng)中的表達(dá)根據(jù)NCBI發(fā)表ECV核衣殼基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，用PCR方法擴(kuò)增出ECV核衣殼基因片段；將該基因片段插入表達(dá)型載體pGEX-6p-1中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-ECV-N。提取pGEX-ECV-N質(zhì)粒，經(jīng)BamH I、EcoR I雙酶切鑒定正確后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并用SDS-PAGE凝膠電泳分析，結(jié)果證明本研究成功表達(dá)了GST-ECV-N融合蛋白。融合蛋白切膠免疫小鼠，其原核表達(dá)產(chǎn)物具有免疫原性。
(2)馬冠狀病毒核衣殼基因片段在真核系統(tǒng)中的表達(dá)用BamHI和EcoRI將ECV-N從pGEX-ECV-N載體切下，回收目的DNA片段，克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacl，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。用BamH I、EcoR I雙酶切鑒定，篩選出重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac-ECV-N，然后將載體質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒穿梭質(zhì)粒的大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，在轉(zhuǎn)座子作用下，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-ECV-N。提取正確重組的穿梭質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，結(jié)果獲得了重組桿狀病毒rBac-ECV-N。PCR進(jìn)一步鑒定結(jié)果表明，ECV-N基因片段已重組到桿狀病毒基因組中；用上述原核表達(dá)融合蛋白GST-ECV-N免疫小鼠制備的多抗血清與重組桿狀病毒感染的細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，結(jié)果證明，ECV-N在重組桿狀病毒中得到了很好的表達(dá)。
(3)抗馬IgG單克隆抗體的研制用飽和硫酸銨法提取健康馬血清中的IgG，免疫Balb/c小鼠，取其脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，制抗馬IgG的單克隆抗體。用ELISA檢測(cè)融合細(xì)胞上清，結(jié)果篩選出兩株抗馬IgG的單克隆抗體，命名為EQ-IgG-3D10，EQ-IgG-6G6。兩株單抗生物學(xué)特性研究表明單抗亞類EQ-IgG-3D10亞類為IgG2b，EQ-IgG-6G6亞類為IgG3；單抗EQ-IgG-3D10細(xì)胞上清和腹水工作效價(jià)分別為1∶64和1∶5000，單抗EQ-IgG-6G6細(xì)胞上清和腹水工作效價(jià)分別為1∶512和1∶40000；單抗EQ-IgG-6G6與馬IgG有Western-blot反應(yīng)性；兩株單抗對(duì)馬立克氏病病毒蛋白、重組新城疫病毒蛋白、豬IgG、兔血清、鼠血清等均無(wú)交叉反應(yīng)，證明這些單抗具有良好的特異性。
(4)血清中馬冠狀病毒抗體檢測(cè)方法的建立將重組桿狀病毒rBac-ECV-N大量感染Sf9昆蟲細(xì)胞，以表達(dá)出的ECV-N蛋白作為抗原，以抗馬IgG特異性單抗為二抗，建立檢測(cè)馬抗冠狀病毒抗體的ELISA方法。結(jié)果表明，ECV-N蛋白質(zhì)最佳包被濃度為昆蟲細(xì)胞總蛋白10μg/mL，單抗EQ-IgG-6G6上清1∶10稀釋可以鑒別出陽(yáng)性抗馬冠狀病毒血清抗體。并組建了相應(yīng)檢測(cè)試劑盒，提出了判定標(biāo)準(zhǔn)即OD490讀值≥0.7為陽(yáng)性馬血清，OD490讀值為0.4-0.7時(shí)，判為可疑，OD490讀值＜0.4，判為陰性。
(5)按照血清中馬冠狀病毒抗體檢測(cè)方法的的建立進(jìn)行試劑盒的組裝包括有①包被有馬冠狀病毒核衣殼基因表達(dá)產(chǎn)物的聚苯乙烯酶標(biāo)板8×12孔酶標(biāo)板；②10×濃縮稀釋液(A號(hào)瓶)0.1M pH7.2含0.5％Tween-80的磷酸鹽緩沖液；③10×濃縮洗液(B號(hào)瓶)0.1M pH7.2含0.5％Tween-80的磷酸鹽緩沖液；
④單抗(C號(hào)指形管)抗馬IgG單克隆抗體，工作濃度為1∶2000；⑤HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG(D號(hào)指形管)；⑥底物緩沖液(E號(hào)瓶)4.86ml的0.1M的檸檬酸和5.14ml的0.2M的磷酸氫二鈉溶液的混合液；⑦雙氧水(G號(hào)瓶)30％的雙氧水；⑧鄰苯二胺(OPD片劑)；⑨終止液(H號(hào)瓶)2N H2SO4；⑩標(biāo)準(zhǔn)液(N號(hào)指形管)昆蟲細(xì)胞總蛋白免疫的陽(yáng)性小鼠血清。及封板膜、使用說(shuō)明書。
試劑盒中各組分的制備①包被有馬冠狀病毒核衣殼基因真核表達(dá)產(chǎn)物的聚苯乙烯酶標(biāo)板用22mM的碳酸鹽溶液將抗原，包被濃度10μg/mL，100μL/孔加入ELISA板孔中，4℃16小時(shí)；用洗液(PBST)洗滌3次，用封閉液(5％的脫脂奶粉)37℃濕盒封閉60分鐘，洗液洗3次，干燥后即為反應(yīng)板。
②濃縮稀釋液(10×)0.1M pH7.2含0.5％Tween-80的磷酸鹽緩沖液(PBST)。按常規(guī)法配制，4℃分裝保存。
③濃縮洗液(10×)0.1M pH7.2含0.5％Tween-80的磷酸鹽緩沖液(PBST)。按常規(guī)法配制，4℃分裝保存。
④抗體工作濃度為1∶2000，-70℃保存。
⑤酶標(biāo)抗體購(gòu)自Sigma公司。工作濃度為1∶30000，-20℃保存。
⑥底物緩沖液磷酸氫二鈉14.2g，檸檬酸10.5g，加去離子水定容至500mL，分裝4℃保存。
⑦底物溶液在底物緩沖液中加入0.15％的30％的H2O2。
⑧終止液0.2M硫酸溶液。
⑨底物片劑鄰苯二胺片劑。底物片劑在4℃避光保存1年以上應(yīng)穩(wěn)定、不變色，放入底物緩沖液中應(yīng)在2-3分鐘溶解。
(6)臨床血清樣品檢測(cè)用建立檢測(cè)試劑盒對(duì)1064份馬血清進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明國(guó)內(nèi)馬血清中檢測(cè)出7份陽(yáng)性血清，6份疑似陽(yáng)性；澳大利亞馬血清中檢測(cè)出23份陽(yáng)性陽(yáng)性血清，8份疑似陽(yáng)性；而瑞典馬血清中沒(méi)有檢測(cè)到陽(yáng)性和疑似陽(yáng)性的血清。
①檢測(cè)血樣的處理采集馬血，離心取上清備用。
②測(cè)定方法血清中馬冠狀病毒抗體檢測(cè)試劑盒的操作方法及結(jié)果分析使用前取B瓶液(濃縮洗滌液)按1∶10用蒸餾水稀釋至工作濃度為洗滌液；C管液100μL用A液1∶100稀釋待用；D管液100μL用A液1∶100稀釋待用；N管液用A液作系列梯度稀釋待用。先將樣品分別加入待檢孔中，37℃水浴作用45分鐘，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液至滿孔，棄去洗滌液，于吸水紙上拍干，重復(fù)洗滌3遍；每孔中加入單抗，在板外37℃水浴作用45分鐘，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液至滿孔，棄去洗滌液，于吸水紙上拍干，重復(fù)洗滌5遍。洗滌后立即在每孔中加入稀釋好的D液100μL，置37℃水浴45分鐘。棄去孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液至滿孔，放置2min，棄去洗滌液，于吸水紙上拍干，重復(fù)洗滌5遍。將F管中片劑(4～12mg)溶于10mL底物緩沖液(E液)，完全溶解后，加入30ul G液混勻后每孔加入100μL，37℃避光顯色30min。顯色結(jié)束，每孔加50μL的H液；以A1孔為調(diào)零孔，用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的OD490值。
結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)加入H液后各孔顏色由黃色變?yōu)槌燃t色，用酶標(biāo)儀測(cè)定在490nm波長(zhǎng)處每孔的光吸收值(OD490值)，判定標(biāo)準(zhǔn)為OD490讀值≥0.7為陽(yáng)性馬血清，OD490讀值為0.4-0.7時(shí)，判為可疑，OD490讀值＜0.4，判為陰性。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)馬冠狀病毒抗體的方法，其特征是包括下列步驟(1)包被有馬冠狀病毒核衣殼基因表達(dá)產(chǎn)物的聚苯乙烯酶標(biāo)板的制備用22mM碳酸鈉溶液包被真核系統(tǒng)表達(dá)的總蛋白，包被濃度10μg/ml，100μl/孔加入ELISA板孔中，4℃16小時(shí)，棄去包被液，用磷酸鹽緩沖液洗滌，用吸水紙拍干，用5％脫脂奶粉液滿孔封閉，并用磷酸鹽緩沖液洗滌，干燥后得包被有馬冠狀病毒核衣殼基因表達(dá)產(chǎn)物的聚苯乙烯酶標(biāo)板，即反應(yīng)板；(2)反應(yīng)板每空加入待檢馬血清，37℃反應(yīng)45min，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照B、陰性對(duì)照N、陽(yáng)性對(duì)照P；其中待檢馬血清以1∶100比例用PBST稀釋，陰性對(duì)照N是陰性馬血清與PBST以1∶100比例稀釋，陽(yáng)性對(duì)照P是昆蟲細(xì)胞總蛋白免疫的陽(yáng)性小鼠血清與PBST以1∶200的比例稀釋；棄去孔內(nèi)液體，每孔加入磷酸鹽緩沖液洗滌，用吸水紙拍干；(3)每孔加入酶標(biāo)記的抗馬IgG單克隆抗體，用磷酸鹽緩沖液洗滌，吸水紙拍干；(4)每孔加入新鮮配制的0.4mg/ml的鄰苯二胺底物應(yīng)用液顯色，37℃避光顯色，顯色結(jié)束后，每孔加入2M/L H2SO450μl/孔終止顯色，測(cè)定OD490nm值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)馬冠狀病毒抗體的方法，其特征是鄰苯二胺底物應(yīng)用液是在底物緩沖液中加入0.15％的30％H2O2制成，底物緩沖液是4.86ml的0.1M的檸檬酸和5.14ml的0.2M的磷酸氫二鈉溶液的混合液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)馬冠狀病毒抗體的方法，其特征是酶標(biāo)記的抗馬IgG單克隆抗體制備方法為每孔加入抗馬IgG單克隆抗體，37℃反應(yīng)45min，用磷酸鹽緩沖液洗滌、吸水紙拍干，然后每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠IgG，37℃反應(yīng)45min。
4.一種檢測(cè)馬冠狀病毒抗體的方法專用試劑盒，其特征是包括有(1)包被有馬冠狀病毒核衣殼基因表達(dá)產(chǎn)物的聚苯乙烯酶標(biāo)板；(2)10×濃縮稀釋液0.1M pH7.2含0.5％Tween-80的磷酸鹽緩沖液；(3)10×濃縮洗液0.1M pH7.2含0.5％Tween-80的磷酸鹽緩沖液；(4)單抗抗馬IgG單克隆抗體，工作濃度為1∶2000；(5)HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG；(6)底物緩沖液4.86ml的0.1M的檸檬酸和5.14ml的0.2M的磷酸氫二鈉溶液的混合液；(7)雙氧水30％的雙氧水；(8)鄰苯二胺；(9)終止液2N H2SO4；(10)標(biāo)準(zhǔn)液昆蟲細(xì)胞總蛋白免疫的陽(yáng)性小鼠血清。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)馬冠狀病毒抗體的方法及專用試劑盒，包括包被有馬冠狀病毒核衣殼基因表達(dá)產(chǎn)物的聚苯乙烯酶標(biāo)板的制備、反應(yīng)板每空加入待檢馬血清反應(yīng)、加入酶標(biāo)記的抗馬IgG單克隆抗體、顯色、測(cè)定OD490nm值等步驟。本發(fā)明運(yùn)用真核表達(dá)系統(tǒng)，重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞，大量擴(kuò)增并獲得馬冠狀病毒核衣殼基因表達(dá)的蛋白。所表達(dá)的蛋白抗原包被ELISA板，加入待檢馬血清、抗馬IgG單克隆抗體、HRP酶標(biāo)抗體，研制出了簡(jiǎn)單、方便安全、特異有效、靈敏廉價(jià)的方法和試劑盒，便于馬冠狀病毒的診斷和疫情監(jiān)測(cè)及動(dòng)物疾病的治療，控制該病的流行和發(fā)生。
文檔編號(hào)G01N33/544GK101017173SQ20071002039
公開(kāi)日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2007年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月14日
發(fā)明者顧炳泉, 秦愛(ài)建, 冉俊祥, 李建, 陶宏錦, 王金龍, 張敬友, 孫謙 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)南通出入境檢驗(yàn)檢疫局