專利名稱：用于抗SARS冠狀病毒治療的RNAi物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供用于治療嚴重急性呼吸道綜合癥(SARS)的組合物和方法。更具體地說，本發(fā)明描述了以呼吸道感染(包括SARS冠狀病毒)為目標的核酸物質(zhì)(如siRNA分子)及其類似物和其使用方法，用于臨床治療SARS和呼吸道病毒感染、用于生物防御所需的預(yù)防和治療呼吸道感染、用于治療呼吸道疾病以及用于開發(fā)呼吸道疾病和感染的治療靶點。本發(fā)明提供對人肺部疾病(包括遺傳疾病、感染性疾病、病理狀況和自身免疫疾病)的治療和方法。本發(fā)明還提供siRNA物質(zhì)和傳遞方法，以抑制基因在動物疾病模型(例如小鼠和猴)中的表達，作為開發(fā)和驗證藥物靶點功能的工具。
背景技術(shù)：
最近，在亞洲、北美和歐洲報道了一種叫做嚴重急性呼吸道綜合癥(SARS)的新疾病[1]。到2003年5月15日為止，在全世界已經(jīng)報道了約7628例SARS，587例死亡。一般而言，SARS始于超過100.4(＞38.0℃)的發(fā)燒。其它癥狀可包括頭痛、全身感覺不適及肌體疼痛。一些人還出現(xiàn)了輕微的呼吸道癥狀。2-7天后，SARS患者可發(fā)展為干咳和呼吸困難。大部分的SARS病例都涉及照料SARS患者或與SARS患者生活的人，或者直接接觸SARS患者的感染物(例如呼吸道分泌物)的人。SARS傳播的可能方式包括接觸其它人的皮膚或污染傳染性飛沫的物體，然后接觸你的眼睛、鼻子或嘴。因為這些疾病的病原學(xué)還沒有確定，所以當時不能提出特別的治療建議。經(jīng)驗療法應(yīng)包括對任何病原學(xué)不清楚的社區(qū)獲得性肺炎相關(guān)生物的覆蓋，包括具有抗典型和非典型呼吸道病原體活性的藥物。疾病嚴重程度可影響治療選擇。推薦傳染病會診。
與呼吸道感染的嚴重挑戰(zhàn)相類似，許多肺部和呼吸道疾病沒有獲得足夠治療，包括哮喘和COPD。這些疾病和其它的呼吸道疾病需要更好的與該疾病相關(guān)的生化途徑抑制劑。本發(fā)明使用設(shè)計用于抑制疾病途徑中的選定基因并以本發(fā)明提供方式傳遞的siRNA，突破了當前在呼吸道和肺部疾病治療方面的局限。
發(fā)明概述本發(fā)明提供用于抑制SARS-冠狀病毒(SARS-CoV)活性或其他病毒的新的RNA干擾(RNAi)物質(zhì)及傳遞方法。本發(fā)明提供對病毒關(guān)鍵蛋白生產(chǎn)的抑制，這些關(guān)鍵蛋白是復(fù)制、感染和病毒生命周期的其它關(guān)鍵功能所必需的。本發(fā)明還提供對病毒基因組RNA的直接破壞。本發(fā)明提供RNAi物質(zhì)小干擾RNA(siRNA)的序列，其在哺乳動物細胞和動物中具有有效抗病毒活性，可為化學(xué)合成或載體表達的、體外轉(zhuǎn)錄和載體表達的shRNA、siRNA、miRNA和其它類型的siRNA分子；用于在哺乳動物細胞和動物氣道和肺組織中進行siRNA-介導(dǎo)的基因抑制的物質(zhì)；用于將siRNA有效傳遞入動物模型氣道的物質(zhì)；SARS-CoV特異性siRNA雙鏈體在哺乳動物中抑制病毒感染和復(fù)制的作用機制；編碼冠狀病毒復(fù)制和感染所需的關(guān)鍵蛋白的靶序列；編碼和非編碼區(qū)中用于si-RNA介導(dǎo)的冠狀病毒病毒RNA基因組破壞的靶序列；傳遞核酸物質(zhì)及類似物給哺乳動物的途徑和方法；檢測病毒RNA基因組任一部分的基于RNA模板特異性RNA的RT-PCR方法和試劑，用于診斷和預(yù)后；以及使用核酸物質(zhì)及類似物治療肺部疾病和感染的方法。
更具體地說，本發(fā)明提供一種分離的雙鏈RNA分子，其含有的第一鏈具有對應(yīng)于SARS病毒核苷酸序列的核糖核苷酸序列，其含有的第二鏈具有與SARS病毒核苷酸序列互補的核糖核苷酸序列，其中該雙鏈分子抑制SARS病毒核苷酸序列的表達。
第一鏈和第二鏈可為單獨的互補鏈，或者可包含在單個分子中，其中該單個分子含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。SARS病毒的核苷酸序列可為例如nsp1序列、nsp9序列或刺突蛋白序列。
第一鏈可含有選自以下的序列AACCTTTGGAGAAGATACTGT、AATCACATTTGAGCTTGATGA、AAGTTGCTGGTTTTGCAAAGT、AAGGATGAGGAAGGCAATTTA、AAGCTCCTAATTACACTCAAC和AATGTTACAGGGTTTCATACT。
本發(fā)明還提供檢測樣品中SARS病毒的方法(a)使得自樣品的RNA與基因特異性引物接觸，并通過逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA分子，其中所述基因特異性引物含有與SARS序列互補的3′區(qū)和與SARS序列不互補的5′序列，接著(b)使用一對引物以PCR擴增第一鏈cDNA，其中第一個引物與基因特異性引物的5′區(qū)互補，其中第二個引物含有SARS基因組中基因特異性引物3′區(qū)識別區(qū)域上游的序列，以及(c)檢測PCR產(chǎn)物?；蛱禺愋砸锟膳c例如SARS nsp1、nsp9或刺突蛋白序列互補?；蛱禺愋砸锟珊羞x自以下的序列GAACAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gac aac ctg ctc ataaa、GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gag gat gggcat cag ca和GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gtgtta aaa cca gaa gg。第一個引物可含有序列GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATA。第二個引物可含有選自以下的序列GGG AAG TTC AAG GTT ACA AGA ATG TGAGAA、CGG TGT AAG TGC AGC CCG TCT TAC ACC GTG和CCTTGA CCG GTG CAC CAC TTT TGA TGA TGT。
本發(fā)明還提供治療或預(yù)防患者冠狀病毒感染(例如SARS病毒感染)的方法給予患者有效量的含分離雙鏈RNA分子的組合物，其中所述RNA分子含有的第一鏈包含對應(yīng)于冠狀病毒核苷酸序列的核糖核苷酸序列，其含有的第二鏈包含與冠狀病毒核苷酸序列互補的核糖核苷酸序列，其中該雙鏈分子抑制冠狀病毒核苷酸序列的表達。第一鏈和第二鏈可為單獨的互補鏈，或者可包含在單個分子中，其中該單個分子含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。SARS病毒的核苷酸序列可為例如nsp1序列、nsp9序列或刺突蛋白序列。第一鏈可含有選自以下的序列AACCTTTGGAGAAGATACTGT、AATCACATTTGAGCTTGATGA、AAGTTGCTGGTTTTGCAAAGT、AAGGATGAGGAAGGCAATTTA、AAGCTCCTAATTACACTCAAC和AATGTTACAGGGTTTCATACT。雙鏈RNA分子可含有選自以下的序列SC2、SC5、SC14和SC15。
在以上的治療或預(yù)防方法中，可通過例如鼻內(nèi)傳遞或傳遞入氣管，將雙鏈RNA分子傳遞入患者氣道。組合物可在載體中含有雙鏈RNA分子，該載體含無RNA酶的葡萄糖水溶液，例如5％葡萄糖溶液。雙鏈RNA分子的劑量可為1-100mg/kg患者體重。組合物還可以作為無RNA的水溶液在氣溶膠或粉末中傳遞。
本發(fā)明還提供治療患者呼吸道疾病的方法給予患者氣道雙鏈RNA分子，該RNA分子含有的第一鏈包含對應(yīng)于疾病相關(guān)基因核苷酸序列的核糖核苷酸序列，其含有第二鏈包含與該基因核苷酸序列互補的核糖核苷酸序列，其中疾病相關(guān)基因在疾病中表現(xiàn)出不需要的高水平基因表達，其中雙鏈分子抑制疾病相關(guān)基因核苷酸序列的表達。疾病相關(guān)基因可為病原生物如細菌、病毒或真菌的基因。疾病還可為例如自身免疫炎癥或肺癌。
由以下的詳述可清楚看出本發(fā)明的其它目標、特征和優(yōu)勢。但是，應(yīng)當理解的是，給出的詳述和具體實施例盡管顯示本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但僅是說明性的，因為根據(jù)此詳述，屬于本發(fā)明精神和范圍的各種改變和修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
附圖簡述


圖1顯示SARS冠狀病毒CUHK-WIUrbani的基因組結(jié)構(gòu)。SARS冠狀病毒CUHK-WI毒株(AY278554.1)的基因組序列長29206bp?；虻拇笮“幢壤L出。結(jié)構(gòu)蛋白以實心方框表示。L是前導(dǎo)序列；“p65？”表示推定的MHVp65樣蛋白；數(shù)字1-13表示非結(jié)構(gòu)(nsp)蛋白，其中nsp8在公開的序列數(shù)據(jù)中遺漏了。S是刺突蛋白；M是膜糖蛋白；U是未知蛋白。箭頭表示非結(jié)構(gòu)多蛋白。黑條顯示siRNA-靶向序列的位置。
圖2顯示29727bp長的SARS冠狀病毒Urbani毒株(AY278741.1)的基因組結(jié)構(gòu)。基因的大小按比例繪出。結(jié)構(gòu)蛋白以實心方框表示。S是刺突蛋白；E是包膜蛋白；M是膜糖蛋白；N是核殼磷蛋白。箭頭表示非結(jié)構(gòu)多蛋白。編號的黑條顯示siRNA-靶向序列的位置。
圖3顯示不同SARS冠狀病毒分離株上siRNA靶的位置。使用基于SARS冠狀病毒CUHK-WI設(shè)計的靶序列查明其對不同SARS冠狀病毒分離株的特異性。第5個和第6個靶序列(刺突蛋白-1和-2)與GZ-01分離株的“錯配”只不過是因為提交的GZ01分離株的序列數(shù)據(jù)不完整；HKU39849上的第3個靶序列(nsp9-A)的錯配是因為在HKU39849序列中的13496nt位置有一個堿基對錯配，其它分離株的基因組序列不存在此情況。
圖4顯示向肺系統(tǒng)的核酸傳遞。經(jīng)多個途徑進行氣道傳遞非常有效。氣溶膠、鼻內(nèi)裝置和口-氣管傳遞是傳遞RNAi分子的非侵入性途徑。
圖5顯示siRNA在肺中對熒光素酶表達的抑制。使用5％葡萄糖或Infasurf，將熒光素酶質(zhì)粒連同GFP或熒光素酶特異性siRNA經(jīng)口-氣管傳遞給小鼠。16小時后檢測肺勻漿中的熒光素酶活性。
圖6顯示使用鼻孔傳遞途徑時，熒光標記的siRNA在小鼠呼吸道中的分布。將30μg熒光標記的siRNA雙鏈體的50μl鼻孔傳遞溶液(5％葡萄糖和12μg/μl Infasurf)經(jīng)鼻孔傳遞途徑傳遞入呼吸道。傳遞后4小時，處死小鼠，分離呼吸道氣管和肺。組織的熒光顯微鏡檢測揭示，siRNA在呼吸道和肺中廣泛分布，甚至在用PBS清洗組織以去除非特異性粘附至細胞表面的siRNA之后也是如此。
圖7顯示使用口-氣管傳遞途徑時，熒光標記的siRNA在小鼠呼吸道中的分布。將30μg熒光標記的siRNA雙鏈體的50μl口-氣管傳遞溶液(5％葡萄糖和12μg/μl Infasurf)經(jīng)鼻孔傳遞途徑傳遞入呼吸道。傳遞后4小時，處死小鼠，分離呼吸氣管和肺。組織的熒光顯微鏡檢測揭示，siRNA在呼吸道和肺中廣泛分布，甚至在用PBS清洗組織以去除非特異性粘附至細胞表面的siRNA之后也是如此。
圖8顯示SARS-CoV基因組中48個siRNA靶向序列的位置。整個基因組約29.7kb，由14個ORF組成，這些ORF在5′端編碼復(fù)制酶和轉(zhuǎn)錄酶，在3′端編碼結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白。16個雙鏈體靶向ORF1a和ORF1b區(qū)，而32個雙鏈體靶向ORF2至ORF9區(qū)域。編碼刺突蛋白、膜糖蛋白、包膜蛋白和ORF3的區(qū)域各有6或7個雙鏈體大規(guī)模靶向。粗條表示各個siRNA靶向序列的位置。箭頭指向產(chǎn)生強抗-SARS-CoV活性的序列。
圖9顯示用于細胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)染以測試其抗-SARS-CoV活性的48個siRNA分子。
圖10顯示siRNA在FRhK-4細胞中的抗病毒效力。A、B和C顯示了細胞在SARS-CoV感染作用下的CPE。當健康細胞(A)受到病毒感染時，觀察到顯著的CPE(B)，相反，細胞先用siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染接著再用病毒感染時，沒有出現(xiàn)明顯的CPE(C)。
圖11顯示SARS-CoV的電鏡照片，箭頭表示感染細胞中的SARS-CoV(D)，相反，在先用siRNA轉(zhuǎn)染保護接著用病毒感染的細胞中，沒有可見的病毒(E)。
圖12顯示相對病毒基因組拷貝檢測的選定siRNA雙鏈體的預(yù)防效力。對全部48種雙鏈體進行CPE篩選，選擇4種siRNASC2、SC5、SC14和SC15，測試其在FRhK-4細胞中作為預(yù)防劑的效力。實時定量PCR檢測揭示，這些siRNA雙鏈體能夠顯著(p＜0.01)減少病毒復(fù)制。
圖13顯示培養(yǎng)基中相對病毒量(TCID50)檢測的選定siRNA雙鏈體的預(yù)防效力。相比于沒有預(yù)處理的對照組，siRNA預(yù)處理組顯著(p＜0.01)下降。
圖14顯示siRNA-介導(dǎo)的預(yù)防效力的時程。在SC5 siRNA轉(zhuǎn)染后4、8、16、24、48、60和72小時感染FRhK-4細胞。36小時后，檢測病毒滴度，以評價siRNA在不同時間點抗SARS-CoV感染的預(yù)防效力。黑條表示未用siRNA預(yù)處理的樣品的相對病毒基因組拷貝，相反，白條表示預(yù)處理的樣品。每種樣品進行三次平行測試，并圖示了標準偏差。
圖15顯示細胞培養(yǎng)物中用病毒基因組拷貝檢測的選定siRNA雙鏈體的治療效力。用SARS-CoV感染FRhK-4細胞，接著用SC2、SC5、SC14和SC15 siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后36小時進行治療效力檢測。每種樣品進行三次平行測試，并圖示了標準偏差。
圖16顯示用病毒滴度(TCID50)檢測的選定siRNA雙鏈體的治療效力。每種樣品進行三次平行測試，并圖示了標準偏差。
圖17顯示組合siRNA雙鏈體的治療效力。用SARS-CoV感染FRhK-4細胞，接著用各種組合的活性siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染，之后檢測相對病毒基因組拷貝。在轉(zhuǎn)染后36小時，收集細胞和培養(yǎng)基進行Q-RT-PCR和病毒滴度檢測。在用組合siRNA雙鏈體處理的感染細胞中觀察到顯著的抗病毒治療效力。每種樣品進行三次平行測試，并圖示了標準偏差。
圖18用相對病毒基因組拷貝數(shù)顯示各種siRNA組合的預(yù)防效力。將4種選定siRNA雙鏈體的7種組合轉(zhuǎn)染入FRhK-4細胞，8小時后用SARS-CoV感染。感染后24小時收集樣品進行Q-RT-PCR。
圖19顯示SC2和SC5 siRNA組合的保護效力的時程。黑條表示未用siRNA預(yù)處理樣品的相對病毒基因組拷貝，相反，白條表示預(yù)處理樣品。每種樣品進行三次平行測試，并圖示了標準偏差。
圖20顯示以CMV驅(qū)動熒光素酶和SARS-CoV序列(包括SC2和SC5)融合構(gòu)建的哺乳動物表達載體pCI-Luc-SC。當SC2和SC5siRNA雙鏈體與該載體共轉(zhuǎn)染入293細胞時，熒光素酶表達水平顯著下調(diào)。
圖21顯示pCI-Luc-SC質(zhì)粒與SC2和SC5 siRNA雙鏈體通過氣管內(nèi)給予共傳遞入小鼠肺部后24小時的作用。肺中熒光素酶表達受抑制表示siRNA-介導(dǎo)的序列特異性抑制(knockdown)。
圖22顯示使用組合siRNA雙鏈體抑制肺中SARS-CoV感染的非人靈長類動物研究的病理組織學(xué)數(shù)據(jù)。用單獨的SARS-CoV感染或在不同的時間點通過鼻內(nèi)傳遞0.5ml鹽水溶液共傳遞SARS-CoV和siRNA雙鏈體，處理5組測試動物，每組4只猴子。組I用SC2和SC5 siRNA(30mg/劑)組合處理，然后進行SARS-CoV感染。組II用SC2-SC5 siRNA和SARS-CoV共給予(30mg/劑)，接著再給予兩劑。組III先用SARS-CoV病毒處理，然后重復(fù)傳遞3次SC2-SC5 siRNA組合。組IV用相同量的對照siRNA處理，接著進行SARS-CoV感染。組V僅用SARS-CoV感染。處死猴子，收集肺組織進行病理組織學(xué)分析。組I和組II顯示出病理改變比組IV和組V少得多。
圖23顯示代表病理改變的猴肺病理組織學(xué)染色。
發(fā)明詳述本發(fā)明通過使用體內(nèi)傳遞的siRNA分子抑制冠狀病毒基因表達，提供在哺乳動物中，特別是在靈長類動物和人中，治療冠狀病毒感染的組合物和方法。
更具體地說，本發(fā)明提供在肺組織中對基因或基因組物質(zhì)的抑制。通過抑制病毒的基因或基因組，提供對感染性疾病的治療或預(yù)防療法。本發(fā)明提供短雙鏈RNA寡核苷酸或siRNA，其抑制具有錯配序列的基因表達或抑制RNA病毒基因組。本發(fā)明還提供核酸(包括RNA或DNA)治療劑。本發(fā)明還提供傳遞入肺組織的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供冠狀病毒病毒特別是SARS冠狀病毒的抑制劑。這些呼吸道感染(包括呼吸道病毒感染)的抑制劑可用作治療性治療，并可用作預(yù)防性治療。
通過抑制哺乳動物基因提供對疾病的治療。已經(jīng)鑒別出許多基因具有引發(fā)、保持和惡化肺部疾病的作用。例如，COPD特征為肺部組織炎癥和退化，已鑒別出許多基因具有COPD的這些破壞性作用，包括眾多的細胞因子和眾多的蛋白酶。同樣，哮喘特征為氣道有害縮窄，已鑒別出許多基因具有該作用，包括離子通道。因此，本發(fā)明提供對引發(fā)這些作用、維持這些作用和惡化這些作用的哺乳動物基因的抑制。本發(fā)明提供的抑制劑提供對肺部疾病的治療性治療。
本發(fā)明提供由感染物天然或工程改變而產(chǎn)生的呼吸道感染的抑制劑。這種感染物中的天然或工程改變產(chǎn)生新的感染物，引起新的呼吸道感染。這些新的感染需要新的治療。本發(fā)明僅通過獲得新感染物的基因組，并鑒定siRNA靶向的獨特序列，就提供了抑制這種新感染物的治療方法。
SARS在亞洲、歐洲和北美的許多實驗室中，科學(xué)家晝夜不停地研究SARS病因。已經(jīng)由SARS患者中分離出一種先前不認識的冠狀病毒，已對其測序并在猴子模型中進行了測試[2-4]。這種新冠狀病毒是引起SARS的第一候選，WHO將其命名為SARS冠狀病毒。但是，其它的感染物作為SARS的潛在病因仍在研究中。目前有美國、加拿大、香港、荷蘭等地的小組報道的多個SARS-CoV基因組序列[5]。序列信息為設(shè)計用于RT-PCR或ELISA的診斷劑提供了關(guān)鍵的知識基礎(chǔ)。更重要地是，基于這些序列，我們設(shè)計了siRNA雙鏈體，以抑制幾種重要的病毒蛋白，理論上它們?nèi)磕軌蚱茐恼湶《净蚪M，因此抑制SARS-CoV的復(fù)制過程。產(chǎn)生這種siRNA雙鏈體的成功使得可以開發(fā)出傳遞入患者氣道的基于siRNA的療法，同時用于預(yù)防和治療SARS。SARS-CoV是有義單鏈RNA，可在人中引發(fā)一種流行性最強的感染。SARS-CoV的毒力源自i)其易于通過懸浮顆粒和其它的人-人接觸傳播，ii)其能夠通過經(jīng)常改變病毒抗原(幾乎所有RNA病毒的特征)而逃避保護性免疫，和iii)病毒的新毒株急速涌現(xiàn)。可能存在的SARS-CoV新毒株的威脅是很嚴重的，因為盡管作了很大的努力，但還沒有獲得預(yù)防和治療SARS-CoV感染的有效療法或疫苗，關(guān)于該疾病的流行病學(xué)、病原學(xué)的詳情還有很多不清楚。
RNA干擾(RNAi)抑制SARS-CoV感染和復(fù)制RNAi是一種作用，通過該作用，雙鏈RNA引導(dǎo)動物和植物細胞中的mRNA序列特異性降解[6-8]。已經(jīng)證明，一種RNAi小干擾RNA(siRNA，21nt長)雙鏈體有效阻斷病毒的體外和體內(nèi)感染和復(fù)制[9-12]。該方法對RNA病毒組、HIV、HCV和流感病毒等特別有用，對各種哺乳動物細胞系統(tǒng)和動物模型系統(tǒng)中的病毒感染產(chǎn)生顯著抑制[13-23]。
RNAi對干擾SARS CoV感染似乎很理想。首先，SARS CoV是單鏈RNA病毒，在其生命周期中沒有任何DNA中間體。除了mRNA之外，vRNA和cRNA是siRNA-介導(dǎo)降解的潛在標靶。其次，SARS CoV基因組RNA編碼多個蛋白。每種蛋白或者是病毒結(jié)構(gòu)的組成部分，或者在病毒生命周期中起關(guān)鍵作用。干擾任一蛋白的產(chǎn)生似乎對病毒復(fù)制和生產(chǎn)產(chǎn)生嚴重影響。因此，病毒存在多個siRNA靶，針對不同病毒靶的siRNA組合可同時使用。同時使用兩個或更多個siRNA可能是防止抗性病毒出現(xiàn)所必須的，類似于HIV治療中“雞尾酒”藥物的用法。第三，SARS CoV在人中感染上呼吸道和肺的上皮細胞。因此，siRNA可經(jīng)鼻內(nèi)或肺部途徑便利地給予，這又可產(chǎn)生比全身注射所獲得的siRNA濃度高得多的局部siRNA濃度?？紤]到在自然感染之初病毒體的數(shù)量可能較少，故上氣道和肺的上皮細胞可吸收足量的siRNA，以抑制病毒復(fù)制或產(chǎn)生，因此潛在地可達到預(yù)防或治療效果。
本文描述了多個在人中靶向SARS CoV感染和復(fù)制所必須的關(guān)鍵蛋白編碼序列的siRNA雙鏈體。由于SARS CoV的單鏈RNA基因組結(jié)構(gòu)，所以SARS CoV可直接被siRNA介導(dǎo)的RNA降解致死。為使用這些siRNA雙鏈體在人中預(yù)防和治療SARS CoV感染，必須將siRNA傳遞入通常出現(xiàn)病毒感染的上氣道和肺上皮細胞中。
基于siRNA的治療抗SARS CoV效力的臨床前研究的成功取決于1.siRNA雙鏈體的抗病毒活性；2.siRNA雙鏈體進入動物氣道的傳遞效率和3.臨床相關(guān)動物模型的可耐受毒性。
設(shè)計在培養(yǎng)細胞和動物模型中有效抑制SARS冠狀病毒產(chǎn)生的siRNA雙鏈體。為應(yīng)用這些RNAi雙鏈體在人中預(yù)防和治療SARS CoV感染，必須將siRNA傳遞入通常出現(xiàn)病毒感染的上氣道和肺上皮細胞中。
體外鑒別有效的siRNA分子方法和材料SARS冠狀病毒毒株選擇使用先前描述的方法[1]，通過用2003年3月在香港感染SARS的患者的鼻咽抽取液(NPA)感染恒河猴胎腎(FRhK-4)細胞，分離SARSCoV毒株HKU-66078分離株(AY304494)。HKU-66078毒株在FRhK-4細胞中的連續(xù)傳代物始終產(chǎn)生致細胞病變作用(CPE)，滴度為107TCID50/ml。局部長度測序和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析顯示該毒株與報道的毒株TOR2(AY274119)、FRA(AY291315和AY310120)以及CUHK-WI(AY278554)非常相似。選擇該毒株的原因是其高感染性和毒力特性，產(chǎn)生CPE比其他毒株快(數(shù)據(jù)未公開)。
細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和病毒感染用96孔板在含10％FCS的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)FRhK-4細胞。為進行病毒感染，用PBS清洗細胞兩次，以3PFU/細胞接種病毒，在無FCS的MEM中溫育1小時。然后用MEM清洗細胞兩次，在含10％FCS的MEM培養(yǎng)基中于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時或更長時間。感染后約20小時出現(xiàn)CPE，并再在28小時內(nèi)快速擴散至整個細胞單層。為進行預(yù)防研究，在96孔板中用siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染90-95％匯合的FRhK-4細胞，其中siRNA雙鏈體按照生產(chǎn)商的方法以0.3μg/孔與0.5μl Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)混合。轉(zhuǎn)染后8小時，用SARS CoV以3PFU/細胞感染細胞。為進行治療研究，在96孔板中用SARS CoV以3PFU/細胞感染80％匯合的FRhK-4細胞。在感染后1小時，用siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染細胞，其中siRNA雙鏈體按照生產(chǎn)商的方法以0.3μg/孔與0.5μlLipofectamine 2000混合。轉(zhuǎn)染后4小時，清洗細胞，并在含10％FCS的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
siRNA的設(shè)計與合成使用基于TOR2(AY274119)、CUHK-WI(AY278554)和HKU-66078(AY304494)的SARS CoV基因組序列作為模板，設(shè)計siRNA靶序列。所有的siRNA雙鏈體都是21個核苷酸(nt)的雙鏈RNA，在兩個3′端都含有dTdT突出端，符合Elbashir et al.提出的規(guī)則[25]。對照GenBank對靶序列進行BLAST檢索，以確保其僅是SARS-CoV基因組獨有的。還設(shè)計了另外的40個siRNA雙鏈體(圖9)，并通過Qiagen(Germantown，MD)合成。
電鏡檢查收獲有或沒有SARS-CoV感染的FRhK-4細胞，并在2.5％戊二醛(Electron Microscopy Sciences，Washington，USA)中固定4小時，在1％四氧化鋨中后固定1小時。然后將細胞轉(zhuǎn)移至1.5ml試管中，以1,000rpm離心10分鐘。一去除上清液，就向細胞沉淀中加入55-60℃的液化2％瓊脂(Sigma，St.Louis，USA)溶液。凝膠固化后，制備含細胞沉淀的約1mm3立方體，并在分級乙醇中脫水。將立方體包埋在環(huán)氧樹脂(Polysciences，Warrington，USA)中。制備70nm厚度的超薄切片，用乙酸雙氧鈾(Electron Microscopy Sciences，Washington，USA)和檸檬酸鉛(Leica Microsystem，Vienna，Austria)染色。在PhilipsEM208S電鏡下以80kV檢測切片。影像以200nm長度標記。
病毒滴定和實時定量RT-PCR使用基于CPE的TCID50實驗，通過滴定培養(yǎng)物上清液中的病毒量測定培養(yǎng)基中的釋放病毒。用MEM以10倍連續(xù)稀釋培養(yǎng)物上清液，并接種96孔板中的FRhK-4細胞。培養(yǎng)3天后評價結(jié)果。使用實時定量RT-PCR(Q-RT-PCR)定量毒基因組RNA的胞內(nèi)拷貝數(shù)。用PBS清洗細胞兩次，使用QIAamp RNA分離試劑盒(RocheMolecular Biochemicals)提取細胞中的總RNA。使用RNA H+逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)和隨機引物合成第一鏈的cDNA。使用2μl各反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR。將正向引物(5′-GCATGAAATTGCCTGGTTCAC-3′，終濃度900nM)、反向引物(5′-GCATTCCCCTTTGAAAGTGTC-3′，終濃度900nM)和熒光探針(FAMAGCTACGAGCACCAGACACCCTTCGAAA-TRMA，終濃度250nM)與Master Mix混合，并使用ABl7900 Sequence DetectionSystem(ABI，F(xiàn)oster City，CA，USA)進行實時PCR。PCR運行條件是50℃，5分鐘；95℃，10分鐘以及40個循環(huán)的95℃，15秒和61℃，1分鐘。所有的檢測都進行3次，以進行統(tǒng)計學(xué)分析。
結(jié)果選擇最有效的siRNA雙鏈體盡管siRNA雙鏈體一般來說能夠抑制互補RNA序列，但已知靶向同一基因不同區(qū)域的siRNA的沉默效果有顯著不同。盡管控制有效siRNA導(dǎo)向基因沉默的規(guī)則仍不明確，但siRNA序列的堿基組成可能不是決定抑制靶基因效力的唯一因素。本研究采取的策略是集中在SARS CoV感染和復(fù)制的某些關(guān)鍵蛋白的編碼區(qū)域，同時覆蓋整個病毒基因組RNA中的區(qū)域，以確?？设b別出有效抑制SARSCoV的siRNA雙鏈體。選擇各21nt的48個序列作為標靶，用于siRNA介導(dǎo)的SARS CoV感染和復(fù)制的抑制。根據(jù)最近描述的SARS CoV基因組結(jié)構(gòu)[27-29]，在圖8顯示了各個siRNA靶向的序列在基因組RNA中的位置，各個siRNA靶向序列的詳細信息列于圖9。
序列分析揭示了SARS CoV基因組的29,740個堿基(FRA分離株，AY310120)的結(jié)構(gòu)[27-29]。核苷酸1-72含有預(yù)測的RNA前導(dǎo)序列，之后是跨越192個核苷酸的非翻譯區(qū)(UTR)[26]。SARS CoV基因組表達始于兩個大復(fù)制酶可讀框ORF1a和ORF1b的翻譯，這兩個可讀框都編碼多蛋白，這些多蛋白被加工成一組很少鑒定的復(fù)制酶。推測這些復(fù)制酶亞單位形成病毒復(fù)制復(fù)合物，負責在宿主細胞中合成和復(fù)制病毒RNA[29]。在它們之中，由nsp-3區(qū)編碼的木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶(PLpro)對病毒蛋白的成熟很重要，而由nsp-12區(qū)編碼的RNA依賴性RNA聚合酶在催化病毒RNA合成中起關(guān)鍵作用。由ORF2編碼的刺突蛋白位于病毒體表面，負責趨向、受體識別、細胞粘附以及誘導(dǎo)中和抗體。最初，對病毒序列功能作用的理解引致合理設(shè)計出8個靶向前導(dǎo)序列、nsp-3、nsp-12和刺突蛋白編碼區(qū)的siRNA雙鏈體(SC1-SC8)。將siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染入之前剛用SARSCoV感染的FRhk-4細胞。感染后36小時，評價處理細胞的致細胞病變作用(CPE)，以此代表siRNA介導(dǎo)的對病毒感染的保護作用。一個nsp-12特異性siRNA SC5和一個刺突蛋白特異性siRNA SC2顯示顯著降低CPE(＞80％)，而其它6個雙鏈體僅顯示出中等(50％-70％)或最小的CPE下降(＜30％)。
此初始成功促使使用相同的基于CPE的方法，在基因組范圍內(nèi)篩選靶向整個SARS-CoV基因組RNA中不同區(qū)域的另外40個siRNA(圖8)。令人驚奇的是，僅有兩個另外的siRNA雙鏈體，即靶向nsp-13區(qū)的SC14和靶向nsp-16區(qū)的SC15，顯示出類似于用SC2和SC5觀測到的降低CPE的效力。在SARS-CoV感染前用SC14 siRNA轉(zhuǎn)染的FRhK-4細胞表現(xiàn)出極深的對CPE的預(yù)防性保護作用(
圖10)。已經(jīng)證實，當細胞在HIV病毒感染前用siRNA轉(zhuǎn)染時，合成的siRNA雙鏈體能夠降解病毒基因組RNA[30]。因為siRNA在胞質(zhì)中有效，所以在感染過程中進入細胞的基因組病毒RNA不得不遭遇此初始防御機制。
siRNA靶向引入的基因組病毒RNA的能力暗示siRNA在SARS-CoV感染治療中具有治療性用途。電鏡圖進一步說明了保護FRhK-4細胞抗SARS-CoV感染的作用(
圖11)。不過，在48個siRNA雙鏈體中僅有4個顯示出顯著降低SARS-CoV感染導(dǎo)致的CPE。這4個siRNA雙鏈體的GC含量在38％-48％的范圍內(nèi)。似乎siRNA靶向序列在病毒基因組中的位置直接影響對病毒RNA破壞的效力。更令人感興趣的是，這4個最有效的抑制劑SC2、SC5、SC14和SC15全部都靶向病毒基因組序列的中段(nt 13500-21600)。它們中的3個直接靶向ORF1b區(qū)，這一事實強有力地支持了此編碼區(qū)對病毒基因組穩(wěn)定性可能起關(guān)鍵作用的觀點。而且，在7個靶向ORF1b區(qū)的siRNA雙鏈體中只有3個具有強抑制作用，這表明在編碼區(qū)中存在序列偏好。
在這3個待認識的雙鏈體中，RNAi易感性更好的序列模式和基序特征還不明了。在本研究中觀察到的病毒基因組水平上的位置作用確切機制需要進一步研究來徹底理解。7個靶向刺突蛋白的siRNA雙鏈體中的一個SC2 siRNA能夠顯著降低SARS-CoV誘發(fā)的CPE。這進一步證實了各個ORF中siRNA靶向序列的位置作用可顯著不同[25]。
選定siRNA雙鏈體的預(yù)防效力HIV-1研究[13-14]和呼吸道合胞體病毒(RSV)研究[30]表明，病毒基因組RNA和mRNA都對預(yù)先存在于宿主細胞中的siRNA敏感。為研究靶向SARS CoV的選定活性siRNA的預(yù)防效力，在病毒感染前用siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染FRhK-4細胞。通過使用Q-RT-PCR檢測胞質(zhì)病毒基因組拷貝數(shù)，并滴定培養(yǎng)基中的病毒量(TCID50)，評價抗病毒效力。
圖12顯示了在病毒感染前8小時將siRNA雙鏈體SC2、SC5、SC14和SC15轉(zhuǎn)染入FRhK-4細胞時SARS-CoV基因組拷貝數(shù)的下降。感染后72小時收集樣品，使用Q-RT-PCR檢測相對病毒基因組拷貝數(shù)。
圖13顯示了siRNA雙鏈體對培養(yǎng)基中的SARS CoV量的抑制作用。兩個檢測都證明SC5、SC14和SC15 siRNA雙鏈體能夠大量抑制病毒復(fù)制，而SC14表現(xiàn)出最強的效力。所觀測的預(yù)防性抑制作用提供了直接的證據(jù)，表明宿主細胞中預(yù)先存在的siRNA能夠預(yù)防SARS CoV感染，并抑制病毒復(fù)制。
一個要研究的問題是該siRNA介導(dǎo)的預(yù)防性作用在抗SARS CoVsiRNA單獨轉(zhuǎn)染后可維持多久。為解決此問題，進行時程研究，以明確siRNA介導(dǎo)的預(yù)防活性的持續(xù)時間。在相同劑量的SC5 siRNA轉(zhuǎn)染后4、8、16、24、48、60和72小時的時間點，用相同劑量的SARSCoV感染FRhK-4細胞。siRNA介導(dǎo)的抗SARS CoV預(yù)防性作用維持達72小時，是研究中的最長時間周期(
圖14)，盡管已經(jīng)報道了相對穩(wěn)定和持續(xù)長時間的siRNA介導(dǎo)的沉默作用[25，31]。在此時程中，預(yù)處理組的病毒基因組拷貝數(shù)在所有時間點都保持在低水平，相比之下，在沒有siRNA的情況下，在感染后8小時病毒基因組拷貝數(shù)快速增加。該結(jié)果表明，至少在72小時內(nèi)，siRNA雙鏈體在FRhK-4細胞中保持穩(wěn)定和活性。這種延長的預(yù)防性作用提示，siRNA用作抗SARS CoV感染的預(yù)防手段的潛在用途，例如在衛(wèi)生保健專業(yè)人員接觸SARS患者前給予其siRNA，因為預(yù)防性的siRNA能夠在數(shù)小時內(nèi)迅速起作用并維持數(shù)天。預(yù)防性的抗病毒作用還可以激發(fā)起有價值的研究即研究預(yù)先存在的siRNA物質(zhì)可預(yù)防病毒感染宿主細胞的機制。
選定的siRNA雙鏈體的治療效力在病毒復(fù)制早期，RNAi方法僅處理基因組RNA。但是，在病毒進入細胞后，復(fù)制激活，在感染細胞中新生出成千上萬的病毒轉(zhuǎn)錄物，病毒基因組RNA和mRNA的降解對RNAi機制來說成為了更艱巨的任務(wù)。為評價選定的siRNA雙鏈體的治療作用，在SARS CoV感染后1小時，使用在預(yù)防性研究中使用的相同劑量的siRNA轉(zhuǎn)染FRhK-4細胞。
24小時后，收集細胞和培養(yǎng)基，通過Q-RT-PCR檢測胞質(zhì)病毒基因組拷貝，通過TCID50檢測病毒滴度。相對病毒基因組拷貝數(shù)(
圖15)表明，僅有一個siRNA雙鏈體SC15能夠?qū)崿F(xiàn)顯著下降。另一方面，SC5和SC14能夠使病毒滴度明顯降低(
圖16)。顯然，對已經(jīng)感染SARS CoV的細胞siRNA介導(dǎo)的治療效力遠弱于預(yù)防效力。
這些數(shù)據(jù)暗示，siRNA作為治療劑的效力弱可能是源于降解預(yù)先存在的病毒基因組RNA和sg mRNA的任務(wù)，以及由病毒感染引起的對siRNA轉(zhuǎn)染的潛在阻礙。為提升靶向SARS CoV的siRNA雙鏈體的治療效力，合理的方案是增加轉(zhuǎn)染的siRNA的劑量或組合多個靶向病毒基因組RNA多個區(qū)域的siRNA雙鏈體。在以下的實驗中，增強靶向SARS CoV的siRNA的治療效力以及預(yù)防效力的努力很大程度上集中于這兩種方法。
多個siRNA雙鏈體的組合效力盡管有多個關(guān)于靶向單個基因或單個序列區(qū)域的siRNA介導(dǎo)的抗病毒活性的報道，但有限證據(jù)表明多個靶向不同基因或區(qū)域的siRNA組合的用途。在增強抗SARS-CoV治療效力的嘗試中，評價組合多個靶向不同病毒基因的siRNA雙鏈體的策略。在4個選定的活性siRNA雙鏈體中選擇siRNA組合。用于轉(zhuǎn)染的劑量相同，與siRNA種類的數(shù)目和組成無關(guān)。
為驗證組合多個活性siRNA雙鏈體將提升治療效力的假說，將7種相同劑量的活性siRNA組合轉(zhuǎn)染入已感染SARS-CoV的細胞。轉(zhuǎn)染后36小時，收集樣品，檢測病毒基因組拷貝數(shù)和病毒滴度。所有組合都顯示治療作用的效力大幅提升根據(jù)病毒基因組拷貝數(shù)的檢測(
圖17)，抑制病毒復(fù)制達80％，但是，將SC5的劑量增加至2-4倍沒有提升對SARS-CoV的抑制效力。
這些數(shù)據(jù)清楚表明，靶向病毒基因組RNA不同區(qū)域的多個siRNA雙鏈體的組合顯著增強抗SARS的治療效力，而增加活性siRNA雙鏈體的劑量可沒有任何顯著的影響，另外，該結(jié)果還提示SARS-CoV感染不影響siRNA轉(zhuǎn)染和功能。在預(yù)防效力的研究過程中，如所述方法所描述的一樣，在SARS-CoV感染后轉(zhuǎn)染各種組合的活性siRNA雙鏈體。24小時后，收集細胞和培養(yǎng)基進行Q-RT-PCR和TCID50。和對照樣品相比，當細胞用各種組合的活性siRNA雙鏈體預(yù)處理時，觀測到病毒基因組拷貝數(shù)顯著下降(
圖18)。令人感興趣的是，增加研究中使用的SC2的劑量(3×SC3)對預(yù)防效力沒有顯著提升。在使用組合的siRNA雙鏈體SC2和SC5時，還觀測到預(yù)防效力延長至72小時(
圖19)。
在該研究中觀測到的siRNA介導(dǎo)對SARS-CoV復(fù)制的抑制可能是源于siRNA能夠破壞病毒基因組RNA、失活病毒復(fù)制機制和降低感染毒性。盡管已廣泛認可了可讀框中siRNA的位置作用[13，16]，但還沒有完全認識到siRNA對病毒基因組RNA的位置作用。研究結(jié)果表明，在非人靈長類動物細胞培養(yǎng)物中siRNA介導(dǎo)的抗SARS-CoV活性既是基因組位置依賴性的，也是基因序列依賴性的。例如，三個最有效的siRNA雙鏈體靶向病毒基因組的中間區(qū)域，而SC2和SC5siRNA靶向可讀框的前50-200nt。刺突蛋白特異性siRNA SC2同時降低了病毒滴度和病毒基因組拷貝數(shù)，盡管刺突蛋白的生物學(xué)作用主要在病毒感染方面。
似乎病毒基因組拷貝數(shù)的降低主要是SC2 siRNA的作用，而不是刺突蛋白表達受抑制。以下的事實也支持該結(jié)論在32個同時靶向病毒基因組RNA右側(cè)1/3區(qū)域和各種sg mRNA的siRNA雙鏈體中，僅有SC2產(chǎn)生顯著的抑制作用。顯然，大多數(shù)靶向sg mRNA的siRNA雙鏈體對病毒復(fù)制抑制幾乎沒有作用。因此，基因組RNA破壞可能是這些抗SARS-CoV siRNA的主要功能。
其它因素I.復(fù)制和感染所需的關(guān)鍵蛋白因為在目前對新SARS冠狀病毒基因的功能和基因組組成幾乎沒有了解，所以使用先前已明確的病毒登革熱病毒(DEN)的基因組結(jié)構(gòu)信息鑒別新鑒定的冠狀病毒基因組序列的關(guān)鍵蛋白的可讀框。
選擇DEN病毒是因為DEN病毒類似于冠狀病毒，因為它們都是正單鏈RNA病毒，已經(jīng)報道了DEN病毒復(fù)制受到靶向DEN病毒prM基因的siRNA的抑制。根據(jù)先前已知的關(guān)于DEN病毒基因組結(jié)構(gòu)和公開的SARS冠狀病毒基因組序列的信息，鑒別出3個推定的關(guān)鍵蛋白可讀框作為siRNA介導(dǎo)抑制的標靶nsp1，用于蛋白成熟的加工酶；nsp9，RNA依賴性RNA聚合酶，對RNA基因組復(fù)制和亞基因組mRNA的生產(chǎn)很重要；以及S蛋白(刺突蛋白)，用于受體結(jié)合、細胞融合、誘導(dǎo)中和抗體和細胞免疫的表面糖蛋白。
II.設(shè)計siRNA雙鏈體使用模板病毒基因組序列SARS-CUHM-WI(AY278554，GI30023518)選擇靶向?qū)?yīng)基因(可讀框)的特異性siRNA雙鏈體。靶基因如下所列靶向的基因nsp1編碼蛋白酶，nsp9編碼RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)，SARS-CUHM-WI和SARS-Tor2的序列相同。
S編碼刺突蛋白，該刺突蛋白結(jié)合細胞受體、誘導(dǎo)融合、誘導(dǎo)中和抗體和T細胞免疫。其有3bp與SARS-To2不同源，這在設(shè)計siRNA雙鏈體時加以避免。
基于Tuschl指導(dǎo)為每種靶基因設(shè)計兩個siRNA雙鏈體。這些siRNA寡聚物的序列和位置列于下表。圖2還顯示了帶有靶向序列位置的SARS冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)圖。
表.siRNA靶向的冠狀病毒序列所有的靶序列都進行BLAST檢索，以檢出可能存在的非相關(guān)序列的干擾。示于以下的序列都是僅與公開的SARS冠狀病毒序列(包括SARS-Urbani和SARS-Tor2毒株)同源的獨有序列。
選定的靶在病毒基因組中的位置選擇兩個siRNA雙鏈體，以靶向每個推定的可讀框。
其它的SARS冠狀病毒序列保持出現(xiàn)在公開結(jié)構(gòu)域中。選定的靶序列與這些毒株中的大多數(shù)在對應(yīng)區(qū)域100％同源，只有HKU39849例外(圖3)。
除了以上實施例之外，有效根除冠狀病毒感染和復(fù)制的特異性RNAi物質(zhì)還可以靶向SARS冠狀病毒中的其它可讀框和非編碼區(qū)。
III.RS-PCR檢測SARS冠狀病毒設(shè)計一種獨特的RT-PCR實驗檢測SARS冠狀病毒RNA，該RT-PCR實驗叫做RNA模板特異性PCR(RS-PCR)。
a.基于RS-PCR的SARS診斷實驗使用引物檢測SARS冠狀病毒序列。簡而言之，該實驗使用SARS冠狀病毒基因特異性引物(SRT引物)，其含有與SARS冠狀病毒序列互補的17nt序列以及附著于其5′的30nt特殊序列，用于由SARS冠狀病毒基因的RNA逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)合成cDNA的第一鏈。然后使用一對引物進行PCR擴增。正向引物(Forw-引物)識別SARS冠狀病毒基因組中SRT引物識別的17nt區(qū)域上游的序列。反向引物(Rev-引物)識別附著于SRT引物的特殊序列。在高退火溫度(72℃)進行PCR擴增，在該溫度只有RT的cDNA可以擴增，但不能擴增任何潛在的DNA污染物。RS-PCR實驗可容易地放大至大規(guī)模的診斷和預(yù)后應(yīng)用。
b.RS-PCR引物設(shè)計引物1正向-nsp1Up(30聚體，推定的nsp1基因編碼序列的41-70nt，或冠狀病毒序列AY278554的2734-2763nt)，5′---GGG AAG TTCAAG GTT ACA AGA ATG TGA GAA---3′引物2SRT-nsp1Dn(47聚體，在3′的17聚體與推定的nsp1基因編碼序列的1041-1025nt或冠狀病毒序列AY278554的3734-3718nt互補)。5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gacaac ctg ctc ata aa---3′引物3正向-nsp9Up(30聚體，推定的nsp9基因編碼序列的35-64nt，或冠狀病毒序列AY278554的13381-13410nt)。5′---CGG TGT AAGTGC AGC CCG TCT TAC ACC GTG---3′引物4SRT-nsp9Dn(47聚體，在3′的17聚體與推定的nsp9基因編碼序列的734-718nt或冠狀病毒序列AY278554的14080-14064nt互補)。5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gaggat ggg cat cag ca---3′引物5正向-SpikeUp(30聚體，推定的刺突蛋白基因編碼序列的45-74nt，或冠狀病毒序列AY278554的21511-21540nt)。5′---CCTTGA CCG GTG CAC CAC TTT TGA TGA TGT---3′引物6SRT-SpikeDn(47聚體，在3′的17聚體與推定的刺突蛋白基因編碼序列的644-628nt或冠狀病毒序列AY278554的22110-22094nt互補)。5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCGATA gtg tta aaa cca gaa gg---3′引物7(反向-引物)5′-AACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATA-3′c.RS-PCR。
以下的方法用于RS-PCR，以檢測生物樣品中的SARS冠狀病毒，所述生物樣品例如為細胞裂解物、動物組織和人類患者組織。還可以使用其它的組織。
1).使用RNAwizTM試劑(Ambion)由人樣品中分離總RNA。MuLv逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑得自Applied Biosystems，RS-PCR中使用得所有其它試劑都得自PE Biosystems。
2).SRT反應(yīng)將1μg總RNA樣品與2μl 10×PCRII緩沖液、4μl 25mM MgSO4、0.5μl 10mM dNTP、1μl RNA酶抑制劑(20U/μl)、1μl 20μm SRT引物、1μl MuLv逆轉(zhuǎn)錄酶(50U/μl)和無RNA酶水混合至總體積為20μl。樣品于37℃溫育30分鐘，接著于42℃溫育15分鐘，然后于94℃加熱5分鐘。
3).PCR將10μl SRT產(chǎn)物與4μl 10×PCRII緩沖液、3μl 25mMMgSO4、1μl 10mM dNTP、1μl 20μM正向引物、1μl 20μM反向引物、0.5μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)和蒸餾水混合至總體積為50μl。樣品于94℃加熱2分鐘，然后進行35個周期的2步PCR94℃退火1分鐘以及72℃延長2分鐘。在PCR結(jié)束時于72℃再溫育10分鐘，接著于4℃溫育，之后通過在0.8％瓊脂糖凝膠上對10μl RS-PCR產(chǎn)物進行電泳分析PCR產(chǎn)物。
表.RS-PCR產(chǎn)物的長度
IV.肺部siRNA傳遞有多個途徑可將核酸有效傳遞入哺乳動物氣道(圖4)。我們開發(fā)了口-氣管傳遞siRNA雙鏈體和其它有效基因表達操作的核酸(圖5)。與此類傳遞相關(guān)的獨特制劑包括表面活性劑、脂質(zhì)體和肽聚合物。也可應(yīng)用鼻傳遞和其它類型的氣道傳遞方法，以實現(xiàn)最有效的核酸傳遞。當將熒光標記的siRNA雙鏈體給予上氣道(通過鼻傳遞)和下氣道(通過口-氣管傳遞)時，氣管和肺都被點亮，甚至在透徹清洗后也是如此(圖6和圖7)。
體內(nèi)驗證活性siRNA分子根據(jù)在2003年進行的48個SARS特異性siRNA的體外研究[32]可得到以下結(jié)果1)選擇的幾個有效的siRNA在感染細胞中抑制SARS-CoV復(fù)制達90％。2)這些有效的siRNA當在病毒感染前48-72小時轉(zhuǎn)染入細胞時，抑制SARS-CoV病毒復(fù)制達90％，提示siRNA具有預(yù)防效力。3)同時傳遞幾種靶向病毒基因組不同位置的siRNA表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用。證明所選擇的siRNA的用藥程式安全性及其抗SARS-CoV效力的關(guān)鍵性步驟是在已建立的SARS動物模型中進行體內(nèi)實驗。
在將siRNA介導(dǎo)的SARS-CoV抑制研究直接轉(zhuǎn)移到非人靈長類動物之前，我們首先通過融合含SC2和SC5靶序列的SARS-CoV序列片段和熒光素酶cDNA，構(gòu)建替代質(zhì)粒pCI-Luc-SC(圖20)。當我們將pCI-Luc-SC連同SC2和SC5 siRNA共轉(zhuǎn)染入293細胞時，與對照siRNA雙鏈體相比，pCI-Luc-SC的熒光素酶表達受到顯著抑制(未列出數(shù)據(jù))。我們證實此替代方案在體外運行良好之后，接著我們通過氣管內(nèi)給予將質(zhì)粒和SC2-SC5 siRNA雙鏈體共傳遞入小鼠肺中。當收集肺組織并將檢測的熒光素酶活性與對照siRNA比較時，熒光素酶表達受到顯著抑制(圖21)。此結(jié)果為以下事實提供了強有力的支持siRNA在動物氣道中有活性，能夠抑制靶基因表達。
盡管正在探索某些替代的動物模型，但非人靈長類動物模型仍是廣為接受的標準，原因僅僅是其與人在遺傳學(xué)和生理學(xué)方面類似。SARS的病程由三個階段組成病毒復(fù)制、免疫功能亢進和肺部破壞；siRNA用藥程式控制SARS疾病發(fā)展的最佳階段是第一個階段。因此，在所提出的體內(nèi)實驗中，我們測試了siRNA用藥程式在實驗性SARS疾病早期的效力。為避免由大量接觸siRNA而可能引起的無法耐受的毒性，在使用多劑量時，我們在感染后5天內(nèi)施用siRNA(p.i.)。該研究的主要目標是測試siRNA抗SARS的效力，并研究測試劑量的siRNA試劑在猴子模型中的毒性模式。動物實驗以及隨后的測定在Institute of Laboratory Animal Science，CAMS(ILAS)的設(shè)備上進行。所有的實驗方案都滿足中國衛(wèi)生部制定的相關(guān)法規(guī)。
測試系統(tǒng)動物、病毒株和動物分組恒河猴SARS模型體系由ILAS建立。該模型顯示猴子感染分離自中國SARS患者的SARS-CoV毒株。感染的猴子出現(xiàn)SARS樣癥狀、病理學(xué)和血液學(xué)模式。我們使用和ILAS相同的SARS-CoV毒株攻擊猴子，并將siRNA傳遞入呼吸道。在首個實驗中，使用5組動物(共20只猴子)(表1)。分組原則是組1(G1)指定用于觀察預(yù)防效力，G2和G3用于觀察治療效力，不同之處在于首劑siRNA是否與病毒感染同時施用。G4周作治療性siRNA的對照，使用不相關(guān)的siRNA；而G5是未治療組，用病毒攻擊健康動物。表2概述了使用的siRNA的總量。
病毒攻擊通過不同傳遞途徑的比較研究，經(jīng)ILAS選擇的鼻吸入和噴霧給予SARS CoV。
siRNA的傳遞將siRNA與合適體積的溶解溶液(5％葡萄糖的無RNA酶水溶液)混合。盡管在siRNA有效傳遞入猴肺方面沒有可利用的文獻，但最近的小鼠研究表明肺特異性siRNA傳遞可通過鼻內(nèi)給予實現(xiàn)，而不需要病毒載體或轉(zhuǎn)染劑。我們通過鼻吸入和噴霧傳遞siRNA溶液，與病毒攻擊所使用的相同。
表1.治療組
表2.使用的試劑
評價siRNA的效力和毒性siRNA對SARS-CoV病毒復(fù)制、癥狀、病理學(xué)和生理學(xué)指標的抑制作用反映出siRNA抗SARS的效力。siRNA的毒性主要由臨床體征和/或病理學(xué)顯示，基本上可由動物對施用的siRNA劑量的耐受能力反映。
SARS-CoV病毒的復(fù)制在感染后第0(恰好在攻擊前)、4和7天，麻醉猴子，并取出鼻/咽拭樣和血樣。拭樣用于檢測病毒基因組mRNA拷貝數(shù)(通過實時定量RT-PCR，Q-RT-PCR)和分離SARS-CoV(通過感染容納細胞)；血樣用于Q-RT-PCR。在處死猴子時(感染后第7天兩只，感染后第11天兩只)，收集肺和血樣進行病毒分離。用于Q-RT-PCR的引物先前已描述。如上所述通過用拭樣或血樣感染容納細胞(例如Vero細胞)進行病毒分離。在組織培養(yǎng)物上經(jīng)過1-3次盲傳之后可出現(xiàn)CPE。記錄CPE，通過Q-RT-PCR測試每次傳代的組織培養(yǎng)物的上清液。根據(jù)出現(xiàn)的CPE，對比同一代的某些組織培養(yǎng)物上清液樣品的病毒滴度，病毒滴度以TCID50表示。這有希望顯示出測試組和對照組之間的某些動態(tài)差異。作為參照，Q-RT-PCR實驗可檢測89％SARS患者的89％，病毒分離可采用組織培養(yǎng)物中1輪以上的傳代物。
臨床體征和肺功能每天記錄，包括呼吸道癥狀、體溫、氣管支氣管淋巴結(jié)大小。另外，分析動脈血，還檢測脈搏血氧。
組織學(xué)測試在感染后第7天和第11天，分別處死每組的兩只猴子。對肺組織切片進行傳統(tǒng)的組織學(xué)和免疫組織學(xué)檢查(包括原位雜交，F(xiàn)ISH)。
常規(guī)血檢在取拭樣的同時取血樣。檢測常規(guī)血檢的主要項目，例如WBC、DC、RBC、GB、HCT、MCV、MCH和RDW。
肝酶活性檢查進行常規(guī)的肝活性檢查，例如血清ALT、血清膽紅素、凝血酶原、白蛋白、LDH等。
初步結(jié)果以30mg/劑的劑量和4次重復(fù)給藥傳遞siRNA雙鏈體是安全的。治療的猴子在給藥后沒有出現(xiàn)可見的癥狀，所治療猴肺的損傷不是由siRNA傳遞引起，而是由SARS-CoV感染引起。向猴肺重復(fù)鼻內(nèi)給予0.5ml含siRNA藥物的溶液非常有效(圖22)。根據(jù)組I和組IV或V之間的動物肺病理狀況對比(圖23)，觀測到siRNA雙鏈體在猴肺中的預(yù)防效力。
根據(jù)組I和組IV或V之間動物肺病理狀況對比，向猴肺中共給予siRNA雙鏈體和SARS-CoV產(chǎn)生抗SARS-CoV活性。顯然，我們在細胞培養(yǎng)研究中觀測到的抗SARS-CoV活性在此猴子實驗中得到進一步證實。這些結(jié)果表明基于siRNA的抗SARS-CoV療法對SARS治療有效，具有高度的特異性和安全性。
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權(quán)利要求
1.一種分離的雙鏈RNA分子，所述分子包含的第一鏈含有對應(yīng)于SARS病毒核苷酸序列的核糖核苷酸序列，包含的第二鏈含有與所述SARS病毒所述核苷酸序列互補的核糖核苷酸序列，其中所述雙鏈分子抑制所述SARS病毒所述核苷酸序列的表達。
2.權(quán)利要求1的RNA分子，其中所述第一鏈和第二鏈是單獨的互補鏈。
3.權(quán)利要求1的RNA分子，其中所述第一鏈和第二鏈包含在單個分子中，其中所述單個分子包含環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
4.任一前述權(quán)利要求的RNA分子，其中所述SARS病毒的核苷酸序列選自nsp1序列、nsp9序列和刺突蛋白序列。
5.權(quán)利要求4的RNA分子，其中所述第一鏈包含選自以下的序列AACCTTTGGAGAAGATACTGT、AATCACATTTGAGCTTGATGA、AAGTTGCTGGTTTTGCAAAGT、AAGGATGAGGAAGGCAATTTA、AAGCTCCTAATTACACTCAAC和AATGTTACAGGGTTTCATACT。
6.一種檢測樣品中SARS病毒的方法，所述方法包括(a)使得自所述樣品的RNA接觸基因特異性引物，并通過逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈的cDNA分子，其中所述基因特異性引物包含的3′區(qū)與SARS序列互補，其包含的5′序列與SARS序列不互補；接著(b)使用一對引物以PCR擴增所述第一鏈的cDNA，其中第一個引物與所述基因特異性引物的所述5′區(qū)互補，其中第二個引物含有SARS基因組中所述基因特異性引物所述3′區(qū)識別區(qū)域上游的序列，以及(c)檢測所述PCR的產(chǎn)物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述基因特異性引物與SARS nsp1、nsp9或刺突蛋白序列互補。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述基因特異性引物含有選自以下的序列GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gac aac ctgctc ata aa、GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gag gatggg cat cag ca和GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATAgtg tta aaa cca gaa gg。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述第一個引物含有序列GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATA。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述第二個引物含有選自以下的序列GGG AAG TTC AAG GTT ACA AGA ATG TGA GAA、CGG TGTAAG TGC AGC CCG TCT TAC ACC GTG和CCT TGA CCG GTGCAC CAC TTT TGA TGA TGT。
11.一種治療或預(yù)防患者冠狀病毒感染的方法，所述方法包括給予所述患者有效量的含分離雙鏈RNA分子的組合物，其中所述RNA分子含有的第一鏈包含對應(yīng)于冠狀病毒核苷酸序列的核糖核苷酸序列，含有的第二鏈包含與所述冠狀病毒所述核苷酸序列互補的核糖核苷酸序列，其中所述雙鏈分子抑制所述冠狀病毒的所述核苷酸序列的表達。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述冠狀病毒是SARS病毒。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述第一鏈和第二鏈是單獨的互補鏈。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述第一鏈和第二鏈包含在單個分子中，其中所述單個分子包含環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
15.權(quán)利要求12-13任一項的方法，其中所述SARS病毒的核苷酸序列選自nsp1序列、nsp9序列和刺突蛋白序列。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述第一鏈包含選自以下的序列AACCTTTGGAGAAGATACTGT、AATCACATTTGAGCTTGATGA、AAGTTGCTGGTTTTGCAAAGT、AAGGATGAGGAAGGCAATTTA、AAGCTCCTAATTACACTCAAC和AATGTTACAGGGTTTCATACT。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述雙鏈RNA分子含選自以下的序列SC2、SC5、SC14和SC15。
18.權(quán)利要求12的方法，其中所述雙鏈RNA分子傳遞入所述患者的氣道中。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述傳遞入所述氣道中通過鼻內(nèi)傳遞或通過傳遞入氣管實現(xiàn)。
20.權(quán)利要求12的方法，其中所述組合物包含載體中的所述雙鏈RNA分子，所述載體含無RNA酶的葡萄糖水溶液。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述葡萄糖溶液含約5％葡萄糖。
22.權(quán)利要求12的方法，其中所述雙鏈RNA分子的劑量為1-100mg/kg所述患者體重。
23.權(quán)利要求12的方法，其中所述組合物作為無RNA的水溶液在氣溶膠或粉末中傳遞。
24.一種治療患者呼吸道疾病的方法，所述方法包括給予所述患者氣道雙鏈RNA分子，所述雙鏈RNA分子含有的第一鏈包含對應(yīng)于所述疾病相關(guān)基因核苷酸序列的核糖核苷酸序列，含有的第二鏈包含與所述基因所述核苷酸序列互補的核糖核苷酸序列，其中所述疾病相關(guān)基因在所述疾病中表現(xiàn)出不需要的高水平基因表達，其中所述雙鏈分子抑制所述疾病所述相關(guān)基因的所述核苷酸序列的表達。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述疾病所述相關(guān)基因是病原生物基因。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述病原生物為細菌、病毒或真菌。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述疾病為自身免疫炎癥或肺癌。
28.權(quán)利要求12的方法，其中使用至少兩種雙鏈RNA分子，所述雙鏈RNA分子靶向SARS病毒的至少兩種不同核苷酸序列。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述兩種核苷酸序列選自nsp1序列、nsp9序列和刺突蛋白序列。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療嚴重急性呼吸道綜合癥(SARS)的組合物和方法。更具體地說，本發(fā)明描述了以呼吸道感染(包括SARS冠狀病毒)為目標的核酸物質(zhì)如siRNA分子及其類似物和其使用方法，用于臨床治療SARS、呼吸道病毒感染、用于生物防御所需的預(yù)防和治療呼吸道感染、用于治療呼吸道疾病以及用于開發(fā)呼吸道疾病和感染的治療靶點。
文檔編號A01N43/04GK1922330SQ200480017121
公開日2007年2月28日 申請日期2004年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月25日
發(fā)明者Q·Q·唐, P·Y·盧, F·Y·謝, Y·劉, J·徐, M·C·沃德爾 申請人:因特拉迪格姆公司