專利名稱：一種分離制備等電點相同的水溶性納米顆粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離制備等電點相同的水溶性納米顆粒的方法。
背景技術(shù)：
隨著納米科技的迅速發(fā)展，它與其他學(xué)科越來越深入的交叉，產(chǎn)生了許多新 的理論和方法，并從全新角度，對已有科學(xué)體系產(chǎn)生巨大影響，對解決許多世界性的重 大難題(例如癌癥治療)提供新的解決方法。目前用于醫(yī)用的納米粒子包括量子點 (QuantumDot)、脂類納米藥物載體、納米金(Gold nanoparticle)、納米銀和碳納米材料等。 研究表明，納米顆粒在極低的濃度下(nmol/L級)就可以抑制影響細胞膜、細胞骨架和細胞 核等亞細胞結(jié)構(gòu)。多個研究小組證實納米材料具有較強的抗菌和抗病毒活性，其作用機理 包括對細胞壁(膜)結(jié)構(gòu)的破壞，以及對能量代謝和呼吸鏈的抑制，因此近年來納米顆粒的 研究引起了生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)界的廣泛關(guān)注。而納米效應(yīng)的產(chǎn)生是基于納米材料的大 小、荷電、表面結(jié)構(gòu)等性質(zhì)，目前，納米顆粒的尺寸是研究比較清楚的性質(zhì)，主要是尺寸比較 易于觀察和控制，實際上荷電性質(zhì)也是影響納米效應(yīng)的重要性質(zhì)，尤其是近年的研究表明 納米材料的表面荷電性質(zhì)對生物安全性、合理地設(shè)計和優(yōu)化納米材料組裝體有非常重要的 指導(dǎo)意義。隨著研究者對納米材料生物效應(yīng)的日益關(guān)注，納米分子的功能化修飾，增強納米 分子的生物相容性成為納米材料研究領(lǐng)域的熱點。以碳納米材料富勒烯(Fullerene，C60) 為例，由于其獨特的籠形結(jié)構(gòu)、規(guī)則納米尺寸和穩(wěn)定的生物效應(yīng)，已經(jīng)被廣泛研究并應(yīng)用于 腫瘤治療和靶向藥物載運等領(lǐng)域。富勒烯的碳籠結(jié)構(gòu)具有強親脂性，為了解決富勒烯在水 中溶解性差的問題，研究者在富勒烯碳骨架上引入極性基團，改善其水溶性。水溶性的修飾 使得脂溶性的納米顆粒具有兩親的性質(zhì)。水溶性富勒烯衍生物的典型代表是富勒醇C6tl (OH) n，它是一種多羥基的富勒烯衍生物，在水中具有良好的溶解性。但富勒烯C6tl分子是32面體，以60個碳原子為頂點，由12個五邊形和20個六 邊形組成了封閉球面，球面上五邊形環(huán)為單鍵，環(huán)彼此不相連，六邊形環(huán)的公共棱邊則為雙 鍵，且環(huán)環(huán)互相連通，水溶性修飾很容易形成同分異構(gòu)體。水溶性修飾后的產(chǎn)物荷電性質(zhì)具 有很大差異，這種現(xiàn)象普遍存在于富勒烯家族分子，包括C6tl，CTO，C82，GdOC82，碳納米管、量子 點、納米金屬顆粒等。因為，荷電性質(zhì)也是影響納米效應(yīng)的重要性質(zhì)，所以獲得荷電性質(zhì)相 同的水溶性納米顆粒對藥物應(yīng)用和納米性質(zhì)研究有非常重要的意義。在CDerwent，EDerwent，MDerwent.數(shù)據(jù)庫中檢索，有396個關(guān)于等電聚焦 (isoelectricfocusing)的專利，分別46. 5%分布于(無序)的蛋白質(zhì)/多肽(B04-N04)、 76.0%分布于微生物檢測和83. 6%分布于電泳(S03-E03E)領(lǐng)域，而采用等電聚焦用于等 電點相同的水溶性納米顆粒分離純化的專利未見公開報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有研究，本發(fā)明的目的是提供一種分離制備等電點相同的水溶性納米顆粒的方法。該方法得到的水溶性納米分子具有相同的荷電性質(zhì)，能改善水溶性納米顆粒的穩(wěn) 定性，以便應(yīng)用于藥物應(yīng)用和納米性質(zhì)研究。本發(fā)明采用等電聚焦電泳來分離制備等電點(pi)相同的水溶性納米顆粒。所述 等電聚焦電泳利用特殊緩沖液(即兩性電解質(zhì)溶液)在凝膠內(nèi)制造一個PH梯度，pH梯度 的制作是利用兩性電解質(zhì)具有相近但不同的PKa和pi值，在外電場作用下，自然形成pH梯 度。電泳時每種兩性物質(zhì)就將遷移到等于其等電點的PH處，此時兩性物質(zhì)不再帶有凈的正 或負電荷，形成一個很窄的區(qū)帶，可以進行收集純化。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種分離制備等電點相同的水溶性納米顆粒的方法，包括以下步驟1)制備樣品將水溶性納米顆粒與兩性電解質(zhì)(ampholyte)的混合，制備用于等 電聚焦電泳的樣品；2)進行等點聚焦電泳將步驟1)制得的所述樣品加樣到等電聚焦電泳系統(tǒng)，對所 述樣品進行等點聚焦電泳以將具有不同等電點的所述水溶性納米顆粒進行分離，獲得多組 經(jīng)過等電聚焦電泳分離后的所述樣品，該樣品中含有等電點相同的所述水溶性納米顆粒；3)去除兩性電解質(zhì)去除步驟2、中獲得每組樣品中的所述兩性電解質(zhì)以將所述 每組樣品中的所述水溶性納米顆粒進行純化，最終獲得具有相同等電點的水溶性納米顆 粒。優(yōu)選的，所述的水溶性納米顆粒的濃度為0. 1-lOmg/mL，所述兩性電解質(zhì)的濃度為 0. 1-50% (m/v)。優(yōu)選的，所述的水溶性納米顆粒是進行了羥基化、羧基化、氨基化、膦酸化等的表 面水溶性化學(xué)修飾的納米顆粒。優(yōu)選的，在進行步驟幻所述等點聚焦電泳之前，進行預(yù)電泳，所述預(yù)電泳的步驟 包括將具有固定質(zhì)子化濃度梯度的凝膠放到冷卻板上，在所述的具有固定質(zhì)子化濃度梯度 的凝膠上涂以液體礦物油以避免氣泡的產(chǎn)生，在恒壓條件下，對所述等電聚焦系統(tǒng)進行預(yù) 電泳，所述的預(yù)電泳時間為30-120分鐘，所述等點聚焦電泳時間為30-180分鐘。所述具有 固定質(zhì)子化濃度梯度的凝膠包括聚芳香酰胺、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、或淀粉的凝膠，所述聚 丙烯酰胺的平均分子量在500-90，000道爾頓之間。優(yōu)選的，步驟幻所述等點聚焦電泳包括平衡離子交換膜、組裝等電聚焦電泳儀、 加載所述樣品、聚焦運行、收集步驟。優(yōu)選的，所述的水溶性納米顆粒包括水溶性碳納米材料、水溶性量子點納米顆粒、 水溶性納米金屬顆粒，所述的水溶性碳納米材料包括表面水溶性修飾富勒烯納米顆粒、碳 納米管等；所述的水溶性量子點納米顆粒包括羥基化量子點的納米顆粒、羧基化量子點的 納米顆粒、氨基化量子點的納米顆粒等；所述的水溶性納米金屬顆粒還包括納米金顆粒、膠 體金顆粒、納米銀顆粒等。優(yōu)選的，所述表面水溶性修飾富勒烯納米顆粒包括羥基化富勒烯納米顆粒、羧基 化富勒烯納米顆粒、氨基化富勒烯納米顆粒、羥基化內(nèi)包金屬富勒烯納米顆粒、羧基化內(nèi)包 金屬富勒烯納米顆粒、氨基化金屬內(nèi)包富勒烯納米顆粒等。優(yōu)選的，所述的碳納米管包括羥基化單壁碳納米管、羧基化單壁碳納米管、氨基 化單壁碳納米管、表面聚乙二醇(PEG)修飾的碳納米管等。
優(yōu)選的，所述的兩性電解質(zhì)是多乙烯多胺的聚合物，所述多乙烯多胺的聚合物包 括乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺和四乙烯五胺的一種或幾種的聯(lián)產(chǎn)物。優(yōu)選的，步驟3)所述的去除所述的兩性電解質(zhì)是采用離心、離心過濾、目標物質(zhì) 沉淀離心、透析、電泳、柱層析、再沉淀、結(jié)晶或有機溶劑沉淀洗滌離心的方法。優(yōu)選的，所述有機溶劑沉淀洗滌離心的方法用于純化所述表面水溶性修飾富勒烯 納米顆粒。所述溶劑為異丙醇、乙醚和正己烷的混合乳液。同現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的分離制備等電點相同的水溶性納米顆粒的方法具有以 下優(yōu)點1、本發(fā)明首次將等電聚焦電泳的方法用于水溶性納米顆粒的分離，即利用納米粒 表面帶電性質(zhì)不同，用等電聚焦電泳的方法分離水溶性納米粒子，以得到表面電荷性質(zhì)相 同的納米顆粒，是對尺寸相同的納米顆粒的進一步純化。2、本發(fā)明的適用范圍廣，其適用于表面荷電的納米分子聚集體，包括量子點 (Quantum Dot)、脂類納米藥物載體、納米金(Gold nanoparticle)、納米銀和碳納米材料， 尤其富勒烯家族的水溶性衍生物。現(xiàn)有技術(shù)中，水溶性富勒烯衍生物體系中，由于異構(gòu)效應(yīng) 產(chǎn)生的同分異構(gòu)體很多，則富勒烯聚集體中各個分子的帶電效應(yīng)很不相同，引起富勒烯聚 集體的不穩(wěn)定，導(dǎo)致顆粒的沉淀析出。但是本發(fā)明利用水溶性納米顆粒的等電點性質(zhì)將具 有相同帶電性質(zhì)的富勒烯納米顆粒進行了分離，所獲得納米顆粒具有相同的帶電性質(zhì)，因 此納米水懸液具有更好的穩(wěn)定性。因此采用本發(fā)明的方法制備的水溶性納米顆粒具有更優(yōu) 異的熱穩(wěn)定性等性能。


圖1為本發(fā)明的樣品聚焦室的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明的等電聚焦電泳的預(yù)電泳結(jié)束的示意圖；圖3為本發(fā)明的等電聚焦電泳結(jié)束的示意圖；圖4為本發(fā)明的等電聚焦電泳產(chǎn)物收集后的示意圖；圖5為本發(fā)明的等電聚焦電泳產(chǎn)物的pi和小室數(shù)量的關(guān)系圖；圖6為本發(fā)明等電聚焦電泳分離的不同等電點的產(chǎn)物(a為樣品聚焦小室1分離 的產(chǎn)物，b為樣品聚焦小室2分離的產(chǎn)物，c為樣品聚焦小室3分離的產(chǎn)物，d為樣品聚焦小 室4分離的產(chǎn)物)毛細管電泳分析圖。圖7為本發(fā)明等電聚焦電泳分離的不同等電點的產(chǎn)物(a為樣品聚焦小室1分離 的產(chǎn)物，b為樣品聚焦小室2分離的產(chǎn)物，c為樣品聚焦小室3分離的產(chǎn)物，d為樣品聚焦小 室4分離的產(chǎn)物)紅外分析8為本發(fā)明等電聚焦電泳分離的不同等電點的產(chǎn)物(a為樣品聚焦小室1分離 的產(chǎn)物，b為樣品聚焦小室2分離的產(chǎn)物，c為樣品聚焦小室3分離的產(chǎn)物，d為樣品聚焦小 室4分離的產(chǎn)物)XPS光電子能譜分析圖其中1、電極膜(陰極)；2、樣品聚焦小室；3、電極膜(陽極)。
具體實施例方式實施例1
分離制備等電點相同的富勒醇(C6ci(OH)m)納米顆粒的方法，該方法包括以下步 驟1)制備樣品將富勒醇(C6ci(OH)m)納米顆粒和兩性電解質(zhì)混合，得到上述兩種物 質(zhì)的混合水溶液以制備用于等電聚焦電泳的樣品，所述的富勒醇(C6tl(OH)24)納米顆粒通過 用在商業(yè)上可獲得的富勒烯納米顆粒C6tl的甲苯溶液中，加入NaOH、四丁基氫氧化銨(TBAH) 和H2A反應(yīng)獲得，所述富勒醇(C6ci(OH)m)納米顆粒的濃度為0. 1-lOmg/mL，所述兩性電解質(zhì) 為pH 3-10的三乙烯四胺和四乙烯五胺混合物，其濃度為0. 1-50% (m/v)。2)預(yù)電泳，具體步驟如下將聚丙烯酰胺凝膠放到冷卻板上，在所述的聚丙烯酰胺凝膠上涂以液體礦物油以 避免氣泡的產(chǎn)生，用正極液與負極液分別潤濕正極與負極電極條，然后將所述正極與負極 電極條分別放于等電聚焦電泳系統(tǒng)的陽極與陰極上，將電極對準電極條中心，加蓋，在起始 電壓200V下，對等電聚焦系統(tǒng)進行預(yù)電泳，運行30-120分鐘。3)等點聚焦電泳采用Bio-RAD公司的Mini-MicroRotofor等電聚焦電泳系統(tǒng)對 樣品進行等電聚焦電泳分離，具體步驟如下平衡離子交換膜干燥的離子交換膜在電解液過夜浸潤；組裝等電聚焦電泳儀用去離子水沖洗平衡離子交換膜，在樣品聚焦室的兩端插 入一個陽極膜和陰極膜，組裝陽極、陰極兩個電極組件；加載樣品在所述樣品聚焦室上設(shè)有兩排孔，其中一排孔用膠帶密封，調(diào)整另一排 孔與所述電極組件上的通風(fēng)口在一條直線上，用填充注射器將3毫升樣品加入所述樣品聚 焦室，所述樣品會慢慢擴散到并填滿所述樣品聚焦小室，確保趕走所有氣泡，以免氣泡破壞 電場，擦干所述樣品聚焦室的外表面，用膠帶密封所述樣品聚焦室；樣品聚焦室由10個樣 品聚焦小室組成，每個小室之間相通但有隔膜，所述的隔膜具有較大孔洞，目的是在不影響 樣品電泳遷移的條件下隔離各個小室收集的樣品(見附圖1)。聚焦運行將組裝了所述電極組件的所述樣品聚焦室，使用IOml注射器，分別在 所述電極組件中的陰極加0. IMNaOH,在所述電極組件中的陽極加0. IM H3PO4,覆蓋冷卻板， 打開旋轉(zhuǎn)開關(guān)，放置機箱蓋子，對所述陰極和陽極施加電場，功率為1W，當運行電壓不再增 加時，等點聚焦電泳運行30-180分鐘；收集等電聚焦運行完成，盡快將樣品聚焦室插入真空樣品收集模塊上，將樣品聚 焦室內(nèi)的樣品真空吸入收集室(見附圖4)，獲得多組等電點不同的所述樣品，每組樣品中 含有等電點相同的所述富勒醇(C6tl(OH)24)納米顆粒，盡量減少所述樣品聚焦室震動，以避 免擴散；pH測量使用小直徑的pH電極測定每一個等電聚焦電泳小室內(nèi)的pH，即測定納米 顆粒的等電點(Pl)。4)去除兩性電解質(zhì)將步驟3)獲得的每組樣品采用異丙醇、乙醚和正己烷(所述 異丙醇、乙醚和正己烷的混合乳液的比例為1 1 1或1 2 3或3 2 1)的乳液 進行洗滌離心來所述樣品中的所述水溶性納米顆粒進行純化，以去除兩性電解質(zhì)，最終獲 得具有相同等電點的納米顆粒。通常兩性電解質(zhì)的分子量范圍300-1，200道爾頓，與目標 納米顆粒以弱靜電結(jié)合，這可能會干擾納米粒的性質(zhì)和活性。許多方法(如離心過濾、透 析、電泳等)可以被用來從目標納米顆粒上分離兩性電解質(zhì)，其它的方法本申請不再累述。
經(jīng)過等電聚焦電泳分離純化得到的不同等電點的富勒醇(C6ci(OH)m)納米顆粒經(jīng) 過CE(毛細管電泳)測得的保留時間具有差異(見圖6)，表明富勒醇的等電點具有差異，進 一步紅外光譜圖發(fā)現(xiàn)不同等電點的富勒醇表面基團存在差異，尤其羥基的狀態(tài)不同(見圖 7)，XPS光電子能譜的分析也可以看出，富勒醇表面的羥基存在更復(fù)雜的變化(見圖8)。實施例2分離制備等電點相同的水溶性羧基化富勒烯(C6tl(C(COOH)2)2)納米顆粒的方法， 所述方法包括以下步驟1)制備樣品將水溶性羧基化富勒烯(C6tl(C(COOH)2)2)納米顆粒和兩性電解質(zhì)混 合，得到上述兩種物質(zhì)的混合水溶液以制備用于等電聚焦電泳的樣品，該水溶性羧基化富 勒烯用商業(yè)上可獲得的富勒烯納米顆粒通過經(jīng)典的Bingle-Hirsch反應(yīng)獲得不同加成數(shù) 目的C60丙二酸酯衍生物，然后在堿性條件下酯裂解反應(yīng)獲得，所述水溶性羧基化富勒烯 (C60(C(COOH)2)2)納米顆粒的濃度為lmg/mL，兩性電解質(zhì)為pH 3_10的三乙烯四胺和四乙烯 五胺混合物，其濃度為40% (m/v)。2)預(yù)電泳的具體步驟同實施例1，其中預(yù)電泳運行的時間50分鐘；3)等點聚焦電泳的具體步驟同實施例1，其中等點聚焦電泳運行100分鐘；4)去除兩性電解質(zhì)將步驟幻獲得的每組樣品通過無水乙醇沉淀離心過濾，再用 去離子水復(fù)溶羧基化富勒烯(C6tl(C(COOH)2)2)納米顆粒進行純化，最終獲得具有相同等電 點的羧基化富勒烯(C6tl(C(COOH)2)2)納米顆粒。經(jīng)過等電聚焦電泳分離純化得到的不同等電點的羧基化富勒烯(C6tl (C (COOH) 2) 2) 納米顆?？梢越?jīng)過CE (毛細管電泳)、紅外光譜、XPS光電子能譜、TEM透射電鏡等手段檢測 到差異，本申請不再累述。實施例3分離制備等電點相同的水溶性羥基化金屬內(nèi)包富勒烯Gd@C82(0Hh2納米顆粒的方 法，所述方法包括以下步驟1)制備樣品將水溶性羥基化金屬內(nèi)包富勒烯Gd@C82(0Hh2納米顆粒和兩性電解 質(zhì)混合，得到上述兩種物質(zhì)的混合水溶液以制備用于等電聚焦電泳的樣品，該GdOC82 (OH) 22 納米顆粒用商業(yè)上可獲得的金屬Gd和C82通過電弧放電法合成內(nèi)嵌金屬富勒烯GdOC82顆 粒，該內(nèi)嵌金屬富勒烯GdOC82顆粒通過加入NaOH、四丁基氫氧化銨(TBAH)反應(yīng)獲得，所述 水溶性金屬內(nèi)包富勒烯GdOC82 (OH) 22納米顆粒的濃度為ang/mL，所述兩性電解質(zhì)為pH 3-10 的三乙烯四胺和四乙烯五胺混合物，其濃度為30% (m/v)。2)等點聚焦電泳的具體步驟同實施例1，其中等點聚焦電泳運行80分鐘；3)去除兩性電解質(zhì)將步驟2、獲得的每組樣品通過無水乙醇沉淀離心過濾得到 等電點相同的水溶性金屬內(nèi)包富勒烯Gd@C82(0Hh2納米顆粒，再用去離子水復(fù)溶水溶性金 屬內(nèi)包富勒烯GdOC82 (OH) 22納米顆粒進行純化。經(jīng)過等電聚焦電泳分離純化得到的不同等電點的水溶性金屬內(nèi)包富勒烯GdO C82(OH)22納米顆?？梢越?jīng)過CE (毛細管電泳)、紅外光譜、XPS光電子能譜、TEM透射電鏡等 手段檢測到差異，本申請不再累述。實施例4分離制備等電點相同的水溶性富勒烯衍生物單加成亞甲基富勒烯W0] 二膦酸四
7乙酸(MMPF)納米顆粒的方法，所述方法包括以下步驟1)制備樣品將水溶性富勒烯衍生物單加成亞甲基富勒烯B0] 二膦酸四乙酸 (MMPF)納米顆粒和兩性電解質(zhì)混合，得到上述兩種物質(zhì)的混合水溶液以制備用于等電聚焦 電泳的樣品，單加成亞甲基富勒烯W0] 二膦酸四乙酸(MMPF)采用商業(yè)可獲得的富勒烯納 米顆粒通過在堿性環(huán)境和碘的作用下，與含有活潑性亞甲基的亞甲基二膦酸酯四乙酯及碘 反應(yīng)得到環(huán)丙烷化的產(chǎn)物，再經(jīng)過堿性條件的酯裂解反應(yīng)獲得，所述單加成亞甲基富勒烯 [60] 二膦酸四乙酸的濃度為0. 5mg/mL，所述兩性電解質(zhì)為pH 3-7的三乙烯四胺和四乙烯 五胺混合物，其濃度為10% (m/v)。2)預(yù)電泳的具體步驟同實施例1，其中所述的預(yù)電泳時間為30分鐘；3)等點聚焦電泳的具體步驟同實施例1，其中等點聚焦電泳運行90分鐘；4)去除兩性電解質(zhì)將步驟3)獲得的每組樣品采用比例為1 1 1的異丙醇、 乙醚和正己烷的乳液進行洗滌離心來進行純化，以去除兩性電解質(zhì)，得到等電點相同的水 溶性富勒烯衍生物單加成亞甲基富勒烯W0] 二膦酸四乙酸納米顆粒。經(jīng)過等電聚焦電泳分離純化得到的不同等電點的單加成亞甲基富勒烯W0] 二膦 酸四乙酸納米顆粒可以經(jīng)過CE (毛細管電泳)、紅外光譜、XPS光電子能譜、TEM透射電鏡等 手段檢測到差異，本申請不再累述。實施例5分離制備等電點相同的羧基化單壁碳納米管SWCT(C(COOH)2)n的方法，所述方法 包括以下步驟1)制備樣品將羧基化單壁碳納米管SWCT(C(COOH)2)n和兩性電解質(zhì)混合，得 到上述兩種物質(zhì)的混合水溶液以制備用于等電聚焦電泳的樣品，該羧基化單壁碳納米管 用商業(yè)上可獲得的單壁納米管通過?；Ⅴセ趸磻?yīng)獲得，所述羧基化單壁碳納米管 SWCT (C (COOH) 2)n的濃度為0. 1-lOmg/mL，兩性電解質(zhì)為PH 3-7的二乙烯三胺和四乙烯五胺 混合物，其濃度為0. 1-50% (m/v)；2)等點聚焦電泳的具體步驟同實施例1，其中，等點聚焦電泳運行30-180分鐘；3)去除兩性電解質(zhì)將步驟2)獲得的每組樣品采用超速離心過濾的方法 來進行純化，離心轉(zhuǎn)速10000-80000g，最終獲得等電點相同的羧基化單壁碳納米管 SffCT (C (COOH) 2)n。經(jīng)過等電聚焦電泳分離純化得到的不同等電點的水溶性的羧基化單壁碳納米管 SffCT (C (COOH) 2) n可以經(jīng)過紅外光譜、XPS光電子能譜、TEM透射電鏡等手段檢測到差異，本 申請不再累述。實施例6分離制備等電點相同的氨基化單壁碳納米管SWCT(NH2)n的方法，所述方法包括以 下步驟1)制備樣品將氨基化單壁碳納米管SWCT (NH2)n和兩性電解質(zhì)混合，得到上述兩 種物質(zhì)的混合水溶液以制備用于等電聚焦電泳的樣品，該氨基化單壁碳納米管用商業(yè)上可 獲得的單壁納米管通過酰化反應(yīng)預(yù)先合成胺基功能化反應(yīng)獲得，所述氨基化單壁碳納米管 SffCT(NH2)n的濃度為5mg/mL，所述兩性電解質(zhì)為pH 3-10的三乙烯四胺和四乙烯五胺混合 物，其濃度為20% (m/v)；
2)預(yù)電泳的具體步驟同實施例1，其中預(yù)電泳時間為90分鐘；3)等點聚焦電泳的具體步驟同實施例1，其中等點聚焦電泳運行90分鐘；4)去除兩性電解質(zhì)將步驟幻獲得的每組樣品采用超速離心過濾的方法來 進行純化，離心轉(zhuǎn)速10000-80000g，最終獲得所述的等電點相同的氨基化單壁碳納米管 SffCT (NH2) n。經(jīng)過等電聚焦電泳分離純化得到的不同等電點的水溶性的氨基化單壁碳納米管 SWCT (NH2)n納米顆?？梢越?jīng)過紅外光譜、XPS光電子能譜、TEM透射電鏡等手段檢測到差異， 本申請不再累述。實施例7分離制備等電點相同的羥基化單壁碳納米管SWCT(OH)n的方法，所述方法包括以 下步驟1)制備樣品將羥基化單壁碳納米管SWCT (OH)n和兩性電解質(zhì)混合，得到上述兩 種物質(zhì)的混合水溶液以制備用于等電聚焦電泳的樣品，該羥基化單壁碳納米管用商業(yè)上可 獲得的單壁納米管通過NaOH或H2A的羥基化反應(yīng)獲得，所述羥基化單壁碳納米管SWCT (OH) 的濃度為10mg/mL，所述兩性電解質(zhì)為pH 3-10的乙二胺和四乙烯五胺混合物，其濃度為 0. 1 % (m/v)；2)預(yù)電泳的具體步驟同實施例1，其中預(yù)電泳時間為40分鐘；3)等點聚焦電泳的具體步驟同實施例1，其中等點聚焦電泳運行180分鐘；4)去除兩性電解質(zhì)將步驟幻獲得的每組樣品采用超速離心過濾的方法來 進行純化，離心轉(zhuǎn)速10000-80000g，最終獲得所述的等電點相同的羥基化單壁碳納米管 SffCT (OH) n。經(jīng)過等電聚焦電泳分離純化得到的不同等電點的水溶性的羥基化單壁碳納米管 SWCT (OH)n納米顆?？梢越?jīng)過紅外光譜、XPS光電子能譜、TEM透射電鏡等手段檢測到差異， 本申請不再累述。實施例8分離制備等電點相同的氨基化量子點的納米顆粒的方法，包括以下步驟1)制備樣品將氨基化量子點的納米顆粒(從Sigma公司購得)和兩性電解質(zhì)混 合，得到上述兩種物質(zhì)的混合水溶液以制備用于等電聚焦電泳的樣品，所述氨基化量子點 的納米顆粒的濃度為7mg/mL，所述兩性電解質(zhì)為pH 3-10的三乙烯四胺和四乙烯五胺混合 物，其濃度為5% (m/v)；2)預(yù)電泳的具體步驟同實施例1，其中所述的預(yù)電泳時間為120分鐘；3)等點聚焦電泳的具體步驟同實施例1，其中等點聚焦電泳運行120分鐘；4)去除兩性電解質(zhì)將步驟幻獲得的每組樣品采用超速離心過濾的方法來進行 純化，離心轉(zhuǎn)速40000g，最終獲得所述的等電點相同的氨基化量子點的納米顆粒。經(jīng)過等電聚焦電泳分離純化得到的不同等電點的水溶性氨基化量子點的納米顆 粒可以經(jīng)過紅外光譜、XPS光電子能譜、TEM透射電鏡等手段檢測到差異，本申請不再累述。實施例9分離制備等電點相同的羥基化量子點的納米顆粒的方法，包括以下步驟1)制備樣品將羥基化量子點的納米顆粒(從Sigma公司購得)和兩性電解質(zhì)混合，得到上述兩種物質(zhì)的混合水溶液以制備用于等電聚焦電泳的樣品，所述羥基化量子點 的納米顆粒的濃度為8mg/mL，所述兩性電解質(zhì)為pH 3-10的三乙烯四胺和四乙烯五胺混合 物，其濃度為10% (m/v)；2)預(yù)電泳的具體步驟同實施例1，其中所述的預(yù)電泳時間為90分鐘；3)等點聚焦電泳的具體步驟同實施例1，其中等點聚焦電泳運行100分鐘；4)去除兩性電解質(zhì)將步驟幻獲得的每組樣品采用超速離心過濾的方法來進行 純化，離心轉(zhuǎn)速80000g，最終獲得所述的等電點相同的羥基化量子點的納米顆粒。經(jīng)過等電聚焦電泳分離純化得到的不同等電點的水溶性羥基化量子點的納米顆 ?？梢越?jīng)過紅外光譜、XPS光電子能譜、TEM透射電鏡等手段檢測到差異，本申請不再累述。實施例10分離制備等電點相同的羧基化量子點的納米顆粒的方法，包括以下步驟1)制備樣品將羧基化量子點的納米顆粒(從Sigma公司購得)和兩性電解質(zhì) 混合，得到上述兩種物質(zhì)的混合水溶液以制備用于等電聚焦電泳的樣品，所述羧基化量子 點的納米顆粒的濃度為0. lmg/mL，所述兩性電解質(zhì)為pH 3-10的乙二胺和二乙烯三胺混合 物，其濃度為2% (m/v)；2)預(yù)電泳的具體步驟同實施例1，其中所述的預(yù)電泳時間為50分鐘；3)等點聚焦電泳的具體步驟同實施例1，其中等點聚焦電泳運行30分鐘；4)去除兩性電解質(zhì)將步驟幻獲得的每組樣品采用超速離心過濾的方法來進行 純化，離心轉(zhuǎn)速eoooog，最終獲得所述的等電點相同的羧基化量子點的納米顆粒。經(jīng)過等電聚焦電泳分離純化得到的不同等電點的水溶性羧基化量子點的納米顆 ?？梢越?jīng)過紅外光譜、XPS光電子能譜、TEM透射電鏡等手段檢測到差異，本申請不再累述。實施例11分離制備等電點相同的水溶性納米金顆粒的方法，包括以下步驟1)制備樣品將水溶性納米金顆粒(從BBI和NANOCS公司購得)和兩性電解質(zhì) 混合，得到上述兩種物質(zhì)的混合水溶液以制備用于等電聚焦電泳的樣品所述水溶性納米金 顆粒的濃度為10mg/mL，所述兩性電解質(zhì)為pH 3-10的乙二胺和三乙烯四胺混合物，其濃度 % 50% (m/v)；2)預(yù)電泳的具體步驟同實施例1，其中所述的預(yù)電泳時間為70分鐘；3)等點聚焦電泳的具體步驟同實施例1，其中等點聚焦電泳運行180分鐘；4)去除兩性電解質(zhì)將步驟3)獲得的每組樣品采用去離子水透析的方法進行純 化，最終獲得所述的等電點相同的水溶性納米金顆粒。經(jīng)過等電聚焦電泳分離純化得到的不同等電點的水溶性納米金顆?？梢越?jīng)過紅 外光譜、XPS光電子能譜、TEM透射電鏡等手段檢測到差異，本申請不再累述。實施例12分離制備等電點相同的水溶性納米銀顆粒的方法，包括以下步驟1)制備樣品將水溶性納米銀顆粒(從BBI和NANOCS公司購得)和兩性電解質(zhì) 混合，得到上述兩種物質(zhì)的混合水溶液以制備用于等電聚焦電泳的樣品，所述水溶性納米 銀顆粒的濃度為3. 5mg/mL，所述兩性電解質(zhì)為pH 3-10的乙二胺和三乙烯四胺混合物，其 濃度為30% (m/v)；
2)預(yù)電泳的具體步驟同實施例1，其中所述的預(yù)電泳時間為50分鐘；3)等點聚焦電泳的具體步驟同實施例1，其中等點聚焦電泳運行60分鐘；4)去除兩性電解質(zhì)將步驟3)獲得的每組樣品采用去離子水透析的方法進行純 化，最終獲得所述的等電點相同的水溶性納米銀顆粒。經(jīng)過等電聚焦電泳分離純化得到的不同等電點的水溶性納米銀顆?？梢越?jīng)過紅 外光譜、XPS光電子能譜、TEM透射電鏡等手段檢測到差異，本申請不再累述。實施例13分離制備等電點相同的水溶性膠體金顆粒的方法，包括以下步驟1)制備樣品將水溶性膠體金顆粒(從BBI和NANOCS公司購得)和兩性電解質(zhì)混 合，得到上述兩種物質(zhì)的混合水溶液以制備用于等電聚焦電泳的樣品，所述水溶性膠體金 顆粒的濃度為0. %ig/mL，所述兩性電解質(zhì)為pH 3-10的三乙烯四胺，其質(zhì)量濃度為5% (m/ ν)；2)預(yù)電泳的具體步驟同實施例1，其中預(yù)電泳時間為40分鐘；3)等點聚焦電泳的具體步驟同實施例1，其中等點聚焦電泳運行120分鐘；4)去除兩性電解質(zhì)將步驟3)獲得的每組樣品采用去離子水透析的方法進行純 化，最終獲得所述的等電點相同的水溶性膠體金顆粒。經(jīng)過等電聚焦電泳分離純化得到的不同等電點的水溶性膠體金顆?？梢越?jīng)過紅 外光譜、XPS光電子能譜、TEM透射電鏡等手段檢測到差異，本申請不再累述。上述的實施例只是為了更好的解釋本發(fā)明，其不應(yīng)該理解為對本發(fā)明的限制。本 領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所采用的等同變換或等同替換而形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā) 明權(quán)利保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種分離制備等電點相同的水溶性納米顆粒的方法，包括以下步驟1)制備樣品將水溶性納米顆粒與兩性電解質(zhì)混合，制備用于等電聚焦電泳的樣品；2)進行等點聚焦電泳將步驟1)制得的所述樣品加樣到等電聚焦電泳系統(tǒng)，對所述樣 品進行等點聚焦電泳以將具有不同等電點的所述水溶性納米顆粒進行分離，獲得多組經(jīng)過 等電聚焦電泳分離后的所述樣品，該樣品中含有等電點相同的所述水溶性納米顆粒；3)去除兩性電解質(zhì)去除步驟幻中獲得每組樣品中的所述兩性電解質(zhì)以將所述每組 樣品中的所述水溶性納米顆粒進行純化，最終獲得具有相同等電點的水溶性納米顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水溶性納米顆粒的濃度為 0. 1-lOmg/mL，所述兩性電解質(zhì)的濃度為0. 1-50% (m/v)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水溶性納米顆粒是進行了羥基化、 羧基化、氨基化、膦酸化的表面水溶性化學(xué)修飾的納米顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在進行步驟2)所述等點聚焦電泳之前， 進行預(yù)電泳，所述預(yù)電泳的步驟包括將具有固定質(zhì)子化濃度梯度的凝膠放到冷卻板上，在 所述的具有固定質(zhì)子化濃度梯度的凝膠上涂以液體礦物油以避免氣泡的產(chǎn)生，在恒壓條件 下，對所述等電聚焦系統(tǒng)進行預(yù)電泳，所述的預(yù)電泳時間為30-120分鐘，所述等點聚焦電 泳時間為30-180分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟幻所述等點聚焦電泳包括平衡離子 交換膜、組裝等電聚焦電泳儀、加載所述樣品、聚焦運行、收集步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項所述的方法，其特征在于，所述的水溶性納米顆粒包括 水溶性碳納米材料、水溶性量子點納米顆粒、水溶性納米金屬顆粒，所述的水溶性碳納米材 料包括表面水溶性修飾富勒烯納米顆粒、碳納米管；所述的水溶性量子點納米顆粒包括羥 基化量子點的納米顆粒、羧基化量子點的納米顆粒、氨基化量子點的納米顆粒；所述的水溶 性納米金屬顆粒還包括納米金顆粒、膠體金顆粒、納米銀顆粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述表面水溶性修飾富勒烯納米顆粒包 括羥基化富勒烯納米顆粒、羧基化富勒烯納米顆粒、氨基化富勒烯納米顆粒、羥基化內(nèi)包 金屬富勒烯納米顆粒、羧基化內(nèi)包金屬富勒烯納米顆粒、氨基化金屬內(nèi)包富勒烯納米顆粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的碳納米管包括羥基化單壁碳納米 管、羧基化單壁碳納米管、氨基化單壁碳納米管、表面聚乙二醇修飾的碳納米管。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項所述的方法，其特征在于，所述的兩性電解質(zhì)是多乙烯 多胺的聚合物，所述多乙烯多胺的聚合物包括乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺和四乙烯 五胺的一種或幾種的聯(lián)產(chǎn)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的去除所述的兩性電解質(zhì)是 采用離心、離心過濾、目標物質(zhì)沉淀離心、透析、電泳、柱層析、再沉淀、結(jié)晶或有機溶劑沉淀 洗滌離心的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離制備等電點相同的水溶性納米顆粒的方法，包括以下步驟1)制備樣品將水溶性納米顆粒與兩性電解質(zhì)的混合，制備用于等電聚焦電泳的樣品；將步驟1)制得的所述樣品加樣到等電聚焦電泳系統(tǒng)，對所述樣品進行等點聚焦電泳以將具有不同等電點的所述水溶性納米顆粒進行分離，獲得多組經(jīng)過等電聚焦電泳分離后的所述樣品，該樣品中含有等電點相同的所述水溶性納米顆粒；3)去除兩性電解質(zhì)去除步驟2)中獲得每組樣品中的所述兩性電解質(zhì)以將所述每組樣品中的所述水溶性納米顆粒進行純化，最終獲得具有相同等電點的水溶性納米顆粒。該方法能夠得到表面電荷性質(zhì)相同的納米顆粒，是對尺寸相同的納米顆粒的進一步純化。
文檔編號B01D57/02GK102145255SQ20111000095
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者李娟 , 邢更妹 申請人:中國科學(xué)院高能物理研究所