一種肝靶向陽(yáng)離子聚合物及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種肝靶向陽(yáng)離子聚合物及其制備方法與應(yīng)用。肝靶向陽(yáng)離子聚合物，由BUCT?PGEA側(cè)鏈無(wú)規(guī)則地連接于普魯蘭主鏈上構(gòu)成。本發(fā)明還涉及肝靶向陽(yáng)離子聚合物的制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明首次公開(kāi)了利用制備的PuPGEA共運(yùn)載MEG3和P53基因所形成的納米復(fù)合物在HepG2和SMMC7721細(xì)胞中顯示出比載有單獨(dú)的pcDNA?MEG3和pcDNA?P53的復(fù)合物更高的抗癌活性，證明MEG3和P53的共傳遞對(duì)體外HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)有附加效應(yīng)。
【專利說(shuō)明】
一種肝靶向陽(yáng)離子聚合物及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種肝靶向陽(yáng)離子聚合物及其制備方法與應(yīng)用，特別涉及一種肝靶向 陽(yáng)離子聚合物(基因載體)和肝靶向納米復(fù)合物的制備方法與應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種高死亡率的原發(fā)性肝癌。在全 球范圍最常見(jiàn)的10種惡性腫瘤中，它位于第2位。大量的致病因素被證明可以引起這種惡性 腫瘤，例如:感染乙型肝炎病毒(HBV)或者丙型肝炎病毒(HCV);食用被黃曲霉素 B污染的食 物和酒精濫用。但是，被上述致病因素影響的個(gè)體中，僅有部分會(huì)患上肝細(xì)胞癌，表明還有 遺傳的因素參與了肝細(xì)胞癌的形成。在這些遺傳因素中，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)在癌癥 生物學(xué)方面扮演非常重要的角色，在癌癥的治療方面表現(xiàn)出很大的潛力。IncRNAs是一個(gè)家 族，它的大小從幾百核苷酸對(duì)到成千上萬(wàn)核苷酸對(duì)。很多IncRNAs包括(MEG3)被證實(shí)參與了 肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展。大量的證據(jù)表明MEG3充當(dāng)一個(gè)腫瘤抑制子，和正常組織比起來(lái)在 癌組織中低表達(dá)或不表達(dá)，這些反常表達(dá)是由于MEG3(maternal expressed gene3)基因是 一類印記基因，其轉(zhuǎn)錄缺失可能誘導(dǎo)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。MEG3也可以調(diào)節(jié)P53靶基因的表 達(dá)，和P53相互作用來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。
[0003] 作為基因傳遞載體中的一個(gè)重要類型，非病毒聚陽(yáng)離子基因載體，比如聚乙烯亞 胺(PEI)，聚賴氨酸，聚酰胺胺樹(shù)粧分子和pH敏感材料，被廣泛地研究。研究顯示乙醇胺(EA) 修飾的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(命名為BUCT-PGEA)具有優(yōu)良的轉(zhuǎn)染能力，因?yàn)锽UCT-PGEA 具有溫和的仲胺基團(tuán)和豐富的羥基。盡管聚陽(yáng)離子在宿主免疫原性，靈活性和合成方面比 病毒基因載體更優(yōu)越，但是它們?cè)隗w內(nèi)的毒性，轉(zhuǎn)染效率和靶向性能仍然需要改善。不同的 天然多糖，比如β-環(huán)糊精(β-⑶），葡聚糖，殼聚糖，羥丙基纖維素和普魯蘭，已經(jīng)被引入到陽(yáng) 離子基因載體中。在這些多糖中，普魯蘭具有肝靶向的特性，而且不會(huì)引起毒性，免疫原性 或者致癌性。含普魯蘭的陽(yáng)離子聚合物已經(jīng)顯示出有效地介導(dǎo)肝細(xì)胞中的基因傳遞的性 能。
[0004] 如何獲得具有高的傳遞PCDNA-MEG3和PCDNA-P53效率的材料，成為目前的研究熱 點(diǎn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種肝靶向陽(yáng)離子聚合物及其制備方法與應(yīng) 用。
[0006] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0007] -種肝靶向陽(yáng)離子聚合物，由BUCT-PGEA側(cè)鏈無(wú)規(guī)則地連接于普魯蘭主鏈上構(gòu)成， 結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0008]
[0009] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述肝靶向陽(yáng)離子聚合物結(jié)構(gòu)式中，m為4~6，n為87~91，x為 10 ~30〇
[0010]由普魯蘭主鏈和BUCT-PGEA側(cè)鏈構(gòu)成的PuPGEA主要是通過(guò)結(jié)合原子轉(zhuǎn)移自由基聚 合(ATRP)(基于合成的PuBr大分子引發(fā)劑)和后續(xù)的開(kāi)環(huán)反應(yīng)而合成出來(lái)的，具體的技術(shù)方 案如下：
[0011 ]上述肝靶向陽(yáng)離子聚合物的制備方法，包括如下步驟：
[0012] (1)將4-二甲氨基吡啶（DMAP)與普魯蘭多糖（Pullulan)按質(zhì)量比（0.024~ 0.073):1的比例混合后，溶于無(wú)水二甲基甲酰胺(DMF)，普魯蘭多糖與無(wú)水二甲基甲酰胺的 質(zhì)量體積比為(0.08~0.12): 1，單位g/ml，冰浴攪拌條件下，加入溶液A，普魯蘭多糖與溶液 A的質(zhì)量體積比為(2.70~8.10):1，單位g/ml，常溫反應(yīng)20~28h，經(jīng)透析，干燥，制得溴代異 丁基功能化的普魯蘭(PuBr);
[0013] 所述溶液A由2-溴代異丁酰溴(BIBB)與無(wú)水二甲基甲酰胺(DMF)按體積比（0.1~ 0.3):1的比例混合制得；
[0014] (2)將步驟（1)制得的溴代異丁基功能化的普魯蘭（PuBr)與無(wú)水二甲基亞砜 (DMS0)按質(zhì)量體積比（0.03~0.05): 1的比例混合，單位g/ml，制得混合液B，將甲基丙烯酸 縮水甘油酯(GMA)、溴化亞銅(CuBr)與2，2 ' -聯(lián)吡啶(Bipy)按摩爾比（80~120): 1:3的比例 加入到上述混合液B中，甲基丙烯酸縮水甘油酯與無(wú)水二甲基亞砜的體積比為(0.3~0.5): 1，除氧后常溫反應(yīng)5~30分鐘后，加入35~45倍體積的甲醇，固液分離，取沉淀，干燥，制得 數(shù)均分子量分別為20~54kDa的普魯蘭-g-聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PuPGMA);
[0015] (3)將步驟(2)制得的普魯蘭-g-聚甲基丙烯酸縮水甘油酯溶解于無(wú)水二甲基亞砜 中，普魯蘭-g-聚甲基丙烯酸縮水甘油酯與無(wú)水二甲基亞砜的質(zhì)量體積比為(0.01~0.04): 1，單位g/ml，然后加入10倍以上體積的乙醇胺(EA)，在45~55°C條件下反應(yīng)10~16小時(shí)或 者在75~85 °C條件下反應(yīng)0.4~0.8小時(shí)，經(jīng)透析，干燥，制得數(shù)均分子量為22~71kDa的肝 靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，除氧后常溫反應(yīng)時(shí)間為10分鐘，制得的肝靶 向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA的數(shù)均分子量為36kDa。將數(shù)均分子量為36kDa的肝靶向陽(yáng)離子聚合 物 PuPGEA 命名為 PuPGEAl。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，除氧后常溫反應(yīng)時(shí)間為20分鐘，制得的肝靶 向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA的數(shù)均分子量為56kDa。將數(shù)均分子量為56kDa的肝靶向陽(yáng)離子聚合 物 PuPGEA命名為 PuPGEA2。
[0018] 上述肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA在制備傳遞pcDNA-MEG3的納米復(fù)合藥物中的應(yīng) 用。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述應(yīng)用，肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA與PCDNA-MEG3的納米 復(fù)合藥物中，N/P比為5~20。
[0020] 上述納米復(fù)合藥物的制備方法，步驟如下：
[0021] 將由無(wú)菌去離子水配制成氮濃度為8~12mM的肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA溶液， 然后與PCDNA-MEG3溶液按體積比1: (0.8~1.2)的比例混合，在22~28°C下培養(yǎng)20~40分 鐘，制得納米復(fù)合藥物PuPGEA/MEG3。
[0022] 上述肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA在制備傳遞pcDNA-P53的納米復(fù)合藥物中的應(yīng) 用。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述應(yīng)用，肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA與pcDNA-P53的納米復(fù) 合藥物中，N/P比為5~20。
[0024]上述納米復(fù)合藥物的制備方法，步驟如下：
[0025] 將由無(wú)菌去離子水配制成氮濃度為8~12mM的肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA溶液， 然后與PCDNA-P53溶液按體積比1: (0.8~1.2)的比例混合，在22~28°C下培養(yǎng)20~40分鐘， 制得納米復(fù)合藥物PuPGEA/P53。
[0026] 上述肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA在制備傳遞pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的納米復(fù)合 藥物中的應(yīng)用。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述應(yīng)用，肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA在pcDNA-MEG3和 pcDNA-P53的納米復(fù)合藥物中，N/P比為5~20。
[0028]上述納米復(fù)合藥物的制備方法，步驟如下：
[0029] 將由無(wú)菌去離子水配制的氮濃度為8~12mM的肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA溶液與 pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的混合溶液按體積比1: (0.8~1.2)的比例混合，pcDNA-MEG3和 pcDNA-P53的質(zhì)量比為2:(0.8~1.2)，在22~28°(：下培養(yǎng)20~40分鐘，制得納米復(fù)合藥物 PuPGEA/(MEG3+P53)。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述PCDNA-MEG3和PCDNA-P53的質(zhì)量比為2:1。
[0031]有益效果
[0032] 1、本發(fā)明利用制備的 PuPGEA 運(yùn)載 pcDNA-MEG3，pcDNA-P53 或 pcDNA-MEG3+P53,形成 的納米復(fù)合物可以有效地抑制HCC細(xì)胞的增殖；
[0033] 2、本發(fā)明首次公開(kāi)了利用制備的PuPGEA共運(yùn)載MEG3和P53基因所形成的納米復(fù)合 物在HepG2和SMMC7721細(xì)胞中顯示出比載有單獨(dú)的pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的復(fù)合物更高 的抗癌活性，證明MEG3和P53的共傳遞對(duì)體外HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)有附加效應(yīng);通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，用 MEG3和P53基因的共轉(zhuǎn)染在HCC細(xì)胞中刺激了更多的P53蛋白的表達(dá)，IncRNA MEG3的表達(dá)的 提高能夠通過(guò)RNA-蛋白的相互作用作用于P53蛋白，增強(qiáng)P53的穩(wěn)定性，并活化P53介導(dǎo)的轉(zhuǎn) 錄活性和P53的靶向基因的表達(dá)。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1、用PuPGEA或者Lipo2000介導(dǎo)的MEG3和P53在肝癌細(xì)胞HepG2中不同氮磷比下 的相對(duì)表達(dá)量柱狀圖；
[0035] A、MEG3的相對(duì)表達(dá)量柱狀圖；
[0036] B、P53的相對(duì)表達(dá)量柱狀圖；
[0037] 圖 2、PuPGEA2/pc3·0、PuPGEA2/P53、PuPGEA2/MEG3和PuPGEA2/(MEG3+P53)納米復(fù) 合物影響ifepG2細(xì)胞的增殖的計(jì)數(shù)折線圖；
[0038] 圖 3、PuPGEA2/pc3·0、PuPGEA2/P53、PuPGEA2/MEG3和PuPGEA2/(MEG3+P53)納米復(fù) 合物影響ifepG2細(xì)胞的迀移的特征圖；
[0039] 圖4、PuPGEA2/pc3·0、PuPGEA2/P53、PuPGEA2/MEG3和PuPGEA2/(MEG3+P53)納米復(fù) 合物影響ifepG2細(xì)胞的侵襲的特征圖；
[0040] 圖5、通過(guò)尾靜脈注射PuPGEA2/P53和PuPGEA2/(MEG3+P53)的納米復(fù)合物后，P53在 小鼠的肝、脾、腎和心臟中的相對(duì)表達(dá)量柱狀圖；
[0041 ] 圖6、轉(zhuǎn)染PuPGEA2/ (MEG3+P53)的小鼠腫瘤體積明顯小于轉(zhuǎn)染PuPGEA2/pc3.0，證 明PuPGEA2/ (MEG3+P53)納米復(fù)合物具有極高的轉(zhuǎn)染效率和明確的體內(nèi)抑癌效果。
【具體實(shí)施方式】
[0042]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于 此。
[0043]實(shí)施例1肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA和肝靶向納米復(fù)合物的制備 [0044]肝靶向陽(yáng)離子聚合物的制備方法，步驟如下：
[0045] (1)將普魯蘭多糖(Pullulan，3g)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.15g)完全地溶于無(wú) 水二甲基甲酰胺（DMF，30mL)之后，在冰浴和攪拌的條件下加入2-溴代異丁酰溴（BIBB， 0.148mL)的DMF(0.6mL)溶液。然后將體系轉(zhuǎn)移到常溫下反應(yīng)24小時(shí)，再通過(guò)透析和凍干得 到作為聚合的引發(fā)劑的溴代異丁基功能化的普魯蘭(PuBr)。
[0046] (2)將80mg的PuBr投入到無(wú)水二甲基亞砜(DMS0,2mL)中，將甲基丙烯酸縮水甘油 酯（61^，0.811^)、溴化亞銅（0^〇和2,2'-聯(lián)吡啶（8丨？7)以100:1:3的摩爾比加入到上述 DMS0中，通過(guò)鼓泡的方式通入氮?dú)?0分鐘后密封，再在常溫下反應(yīng)10分鐘，再用40倍體積的 甲醇將DMS0中的聚合物沉淀出來(lái)，并在真空下抽干，制得數(shù)均分子量約30kDa的普魯蘭-g-聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PuPGMA);
[0047] (3)將250mg步驟(2)制得的普魯蘭-g-聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PuPGMA)溶解于 DMS0(16mL)中，再加入10倍體積的乙醇胺(EA)，在80°C下反應(yīng)0.7小時(shí)，然后透析和凍干，制 得數(shù)均分子量約36kDa的肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA，命名為PuPGEAl。
[0048] 各階段的產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過(guò)核磁共振氫譜(? NMR)來(lái)分析。1H NMR的譜圖是使 用Bruker公司產(chǎn)的ARX 400MHz分光儀測(cè)得的，其中PuPGMA的溶劑是DMS〇-d6，PuBr，和 PuPGEA的溶劑是D20。
[0049] 結(jié)果顯示終產(chǎn)物肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA具有普魯蘭多糖、PGMA和EA的特征 峰，表明成功制得肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA，結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0050]
[0051 ] 式中：m為3~4，n為89~94，x為14~18。
[0052]肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA與pcDNA-MEG3的納米復(fù)合藥物的制備方法，步驟如 下：
[0053] 將由無(wú)菌去離子水配制成氮濃度為10mM的肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA溶液，然后 與pcDNA-MEG3溶液按體積比1:1的比例混合，在25 °C下培養(yǎng)30分鐘，制得納米復(fù)合藥物 PuPGEA/MEG3，N/P 比為 10。
[0054] 肝革E1向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA與pcDNA-P53的納米復(fù)合藥物的制備方法，步驟如下：
[0055] 將由無(wú)菌去離子水配制成氮濃度為10mM的肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA溶液，然后 與pcDNA-P53溶液按體積比1:1的比例混合，在25°C下培養(yǎng)30分鐘，制得納米復(fù)合藥物 PuPGEA/P53，N/P比為10。
[0056] 肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA與pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的納米復(fù)合藥物的制備方 法，步驟如下：
[0057] 將由無(wú)菌去離子水配制的氮濃度為10mM的肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA溶液與 pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的混合溶液按體積比1:1的比例混合，pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的 質(zhì)量比為2:1，在25°C下培養(yǎng)30分鐘，制得納米復(fù)合藥物PuPGEA/(MEG3+P53)，N/P比為10。 [0058]實(shí)施例2肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA和肝靶向納米復(fù)合物的制備
[0059] 肝靶向陽(yáng)離子聚合物的制備方法，步驟如下：
[0060] (1)將普魯蘭多糖(Pullulan，2g)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.438g)完全地溶于無(wú) 水二甲基甲酰胺（DMF，20mL)之后，在冰浴和攪拌的條件下加入2-溴代異丁酰溴（BIBB， 0.19mL)的DMF(l.OmL)溶液。然后將體系轉(zhuǎn)移到常溫下反應(yīng)24小時(shí)，再通過(guò)透析和凍干得到 作為聚合的引發(fā)劑的溴代異丁基功能化的普魯蘭(PuBr)。
[0061 ] (2)將30mg的PuBr投入到無(wú)水二甲基亞砜(DMS0，lmL)中，將甲基丙烯酸縮水甘油 酯(GMA，0 · 5mL)、溴化亞銅(CuBr)和2，2 ' -聯(lián)吡啶(Bipy)以80:1:3的摩爾比加入到上述DMS0 中，通過(guò)鼓泡的方式通入氮?dú)?0分鐘后密封，再在常溫下反應(yīng)20分鐘，再用40倍體積的甲醇 將DMS0中的聚合物沉淀出來(lái)，并在真空下抽干，制得數(shù)均分子量約54kDa的普魯蘭-g-聚甲 基丙烯酸縮水甘油酯(PuPGMA);
[0062] (3)將200mg步驟(2)制得的普魯蘭-g-聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PuPGMA)溶解于 DMS0( 20mL)中，再加入10倍體積的乙醇胺(EA)，在50°C下反應(yīng)13小時(shí)，然后透析和凍干，制 得數(shù)均分子量約56kDa的肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA，命名為PuPGEA2。
[0063]檢測(cè)方法同實(shí)施例1，結(jié)果顯示終產(chǎn)物肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA具有普魯蘭多 糖、PGMA和EA的特征峰，表明成功制得肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA，結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0064]
[0065] m為5 ~7，n為87 ~91，x為30 ~34。
[0066]實(shí)施例3肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA和肝靶向納米復(fù)合物的制備 [0067]肝靶向陽(yáng)離子聚合物的制備方法，步驟如下：
[0068] (1)將普魯蘭多糖(Pullulan，4g)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，576mg)完全地溶于無(wú) 水二甲基甲酰胺（DMF，40mL)之后，在冰浴和攪拌的條件下加入2-溴代異丁酰溴（BIBB， 0.54mL)的DMF(5mL)溶液。然后將體系轉(zhuǎn)移到常溫下反應(yīng)24小時(shí)，再通過(guò)透析和凍干得到作 為聚合的引發(fā)劑的溴代異丁基功能化的普魯蘭(PuBr)。
[0069] (2)將O.lg的PuBr投入到無(wú)水二甲基亞砜(DMS0,3mL)中，將甲基丙烯酸縮水甘油 酯（61^，0.911^)、溴化亞銅（0^〇和2,2'-聯(lián)吡啶（8丨？7)以120 :1:3的摩爾比加入到上述 DMS0中，通過(guò)鼓泡的方式通入氮?dú)?0分鐘后密封，再在常溫下反應(yīng)5分鐘，再用40倍體積的 甲醇將DMS0中的聚合物沉淀出來(lái)，并在真空下抽干，制得數(shù)均分子量約20kDa的普魯蘭-g-聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PuPGMA);
[0070] (3)將240mg步驟(2)制得的普魯蘭-g-聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PuPGMA)溶解于 DMS0(6mL)中，再加入10倍體積的乙醇胺(EA)，在80 °C下反應(yīng)0.6小時(shí)，然后透析和凍干，制 得數(shù)均分子量約22kDa的肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA
[0071] 檢測(cè)方法同實(shí)施例1，結(jié)果顯示終產(chǎn)物肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA具有普魯蘭多 糖、PGMA和EA的特征峰，表明成功制得肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA，結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0072] L0073J 式中：m為7~9，n為83~92，x為4~6。
[0074] 實(shí)施例4PuPGEA/MEG3和PuPGEA/P53納米復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率的試驗(yàn) [0075]轉(zhuǎn)染試驗(yàn):在轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中，將每孔1 X 105個(gè)HepG2細(xì)胞鋪到12孔板中，培養(yǎng)12小時(shí)。 以脂質(zhì)體2000與基因的復(fù)合物(Lip〇2000/MEG3和Lip 〇2000/P53)作為陽(yáng)性對(duì)照，以實(shí)施例1 制得的PuPGEA/MEG3和PuPGEA/P53納米復(fù)合物作為轉(zhuǎn)染材料進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，用熒光定量PCR 檢測(cè)MEG3和P53的信使RNA的表達(dá)水平，結(jié)果如圖1所示。
[0076]圖1中的相關(guān)結(jié)果顯示，本發(fā)明實(shí)施例1制得的PuPGEAl和實(shí)施例2制得的PuPGEA2 所介導(dǎo)的MEG3和P53的相對(duì)表達(dá)量都比Lip〇2000介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率高，表明PuPGEAl和 PuPGEA2的轉(zhuǎn)染效率均優(yōu)于Lipo2000。
[0077]實(shí)施例 5PuPGEA2/MEG3、PuPGEA2/P53 和 PuPGEA2/(MEG3+P53)納米復(fù)合物抑制細(xì)胞 增殖的試驗(yàn)
[0078]細(xì)胞增殖試驗(yàn)：將每孔1 X 105個(gè)HepG2細(xì)胞鋪到12孔板中培養(yǎng)12小時(shí)，然后加入 PuPGEA2/pc3.0、實(shí)施例 1 制得的PuPGEA2/MEG3、實(shí)施例 1 制得的PuPGEA2/P53或PuPGEA2/ (MEG3+P53)納米復(fù)合物與細(xì)胞共同培養(yǎng)。分別在轉(zhuǎn)染24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后用胰酶消 化細(xì)胞，并用臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖2所示。
[0079]圖2中的相關(guān)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照PuPGEA2/pc3.0復(fù)合物相比，本發(fā)明實(shí)施例1制 得的 PuPGEA2/MEG3、PuPGEA2/P53 和 PuPGEA2/(MEG3+P53)納米復(fù)合物抑制了 HepG2 細(xì)胞的增 殖，且PuPGEA2/(MEG3+P53)納米復(fù)合物的抑制效果最好。
[0080]實(shí)施例 6PuPGEA2/MEG3、PuPGEA2/P53 和 PuPGEA2AMEG3+P53)納米復(fù)合物抑制 HepG2細(xì)胞的迀移的試驗(yàn)
[0081 ] 劃痕修復(fù)試驗(yàn):將每孔1 X 105個(gè)HepG2細(xì)胞鋪到12孔板中，用PuPGEA2/pc3.0、實(shí)施 例1制得的PuPGEA2/MEG3、實(shí)施例1制得的PuPGEA2/P53或PuPGEA2/(MEG3+P53)納米復(fù)合物 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞接近愈合的時(shí)候用槍頭比著直尺，盡 可能筆直地劃痕，在0、12、24、48和72小時(shí)后拍照，結(jié)果如圖3所示。
[0082]圖3中的相關(guān)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照PuPGEA2/pc3.0復(fù)合物相比，本發(fā)明實(shí)施例1制 得的 PuPGEA2/MEG3、PuPGEA/P53 和 PuPGEA2/(MEG3+P53)納米復(fù)合物抑制了 HepG2 細(xì)胞的迀 移，其中PuPGEA2/(MEG3+P53)納米復(fù)合物的抑制效果最明顯。
[0083]實(shí)施例 7PuPGEA2/MEG3、PuPGEA2/P53 和 PuPGEA2AMEG3+P53)納米復(fù)合物抑制 HepG2細(xì)胞的侵襲的試驗(yàn)
[0084] 人工基底膜侵襲試驗(yàn)：膜上均勻鋪100微升/孔的人工基底膜膠（Matrigel， Biosciences Clontech公司）在37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在上室中加入200微升含 0.2%血清的無(wú)雙抗培養(yǎng)基（IX 104個(gè)細(xì)胞），在下室中加入650微升含10%血清的培養(yǎng)基。 48小時(shí)后，將transwell小室中的培養(yǎng)基吸出，用PBS洗兩遍，接著在小室中加入3.7%甲醛 用于固定細(xì)胞，再用PBS洗兩次；加入甲醇lmL，通透細(xì)胞20min，加入結(jié)晶紫進(jìn)行染色，用棉 簽小心地將小室擦干凈，風(fēng)干并拍照，結(jié)果如圖4所示。
[0085]圖4中的相關(guān)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照PuPGEA2/pc3.0復(fù)合物相比，本發(fā)明實(shí)施例1制 得的 PuPGEA2/MEG3、PuPGEA/P53 和 PuPGEA2/(MEG3+P53)納米復(fù)合物抑制了 HepG2 細(xì)胞的侵 襲，其中PuPGEA2/(MEG3+P53)納米復(fù)合物的抑制效果最明顯。
[0086] 實(shí)施例8PuPGEA2/pc3.0、PuPGEA2/MEG3和PuPGEA2/P53納米復(fù)合物在小鼠的主要 器官中的分布的試驗(yàn)
[0087]納米復(fù)合物在器官中的分布試驗(yàn):為了評(píng)價(jià)PuPGEA2/MEG3納米復(fù)合物在活體主要 器官中的積累，我們選用9只BALB/c近交系雌性小鼠并隨機(jī)分為3組。通過(guò)尾靜脈注射的方 法，給每只老鼠注射100微升的包含30微克的pc3.0、P53質(zhì)粒的納米復(fù)合物溶液。48小時(shí)后， 將小鼠的肝、腎、脾和心臟取出，迅速冷凍至液氮中。提取RNA，通過(guò)熒光定量PCR評(píng)價(jià)不同器 官中P53的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示。
[0088]圖5中的相關(guān)結(jié)果顯示，肝臟中的P53的表達(dá)遠(yuǎn)高于脾、腎和心臟，證明本發(fā)明實(shí)施 例1制得的PuPGEA2納米復(fù)合物具有肝靶向性。
[0089] 實(shí)施例9PuPGEA2/pc3.0和PuPGEA2/(MEG3+P53)納米復(fù)合物抑制裸鼠成瘤
[0090] 活體肝細(xì)胞癌移植實(shí)驗(yàn):為了評(píng)價(jià)PuPGEA2介導(dǎo)的MEG3和P53基因的轉(zhuǎn)染效率，我 們確定了以HepG2細(xì)胞來(lái)建立的肝細(xì)胞癌動(dòng)物模型。將1X108個(gè)HepG2細(xì)胞接種到6周齡裸 鼠的腋下，待肝細(xì)胞動(dòng)物模型建立后，在腫瘤上注射PuPGEA/pc3.0或PuPGEA/(MEG3+P53)質(zhì) 粒，每天量腫瘤的體積直至對(duì)照的均值達(dá)到1 X 103立方毫米。
[0091]圖6中的相關(guān)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PuPGEA2/ (MEG3+P53)的小鼠腫瘤體積明顯小于轉(zhuǎn)染 PuPGEA2/3.0，證明本發(fā)明實(shí)施例1制得的PuPGEA2/ (MEG3+P53)納米復(fù)合物具有極高的轉(zhuǎn)染 效率和明確的體內(nèi)抑癌效果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種肝靶向陽(yáng)離子聚合物，其特征在于，由BUCT-PGEA側(cè)鏈無(wú)規(guī)則地連接于普魯蘭主 鏈上構(gòu)成，結(jié)構(gòu)式如下所示：2. 如權(quán)利要求1所述的肝靶向陽(yáng)離子聚合物，其特征在于，所述肝靶向陽(yáng)離子聚合物結(jié) 構(gòu)式中，m為4~6，η為87~91，x為10~30。3. 權(quán)利要求1所述肝靶向陽(yáng)離子聚合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將4-二甲氨基吡啶(DMAP)與普魯蘭多糖(Pullulan)按質(zhì)量比（0.024~0.073):1的 比例混合后，溶于無(wú)水二甲基甲酰胺(DMF)，普魯蘭多糖與無(wú)水二甲基甲酰胺的質(zhì)量體積比 為(0.08~0.12): 1，單位g/ml，冰浴攪拌條件下，加入溶液A，普魯蘭多糖與溶液A的質(zhì)量體 積比為（2.70~8.10):1，單位g/ml，常溫反應(yīng)20~28h，經(jīng)透析，干燥，制得溴代異丁基功能 化的普魯蘭(PuBr); 所述溶液A由2-溴代異丁酰溴(BIBB)與無(wú)水二甲基甲酰胺(DMF)按體積比（0.1~0.3): 1的比例混合制得； (2) 將步驟（1)制得的溴代異丁基功能化的普魯蘭(PuBr)與無(wú)水二甲基亞砜(DMSO)按 質(zhì)量體積比(〇 . 03~0.05): 1的比例混合，單位g/ml，制得混合液B，將甲基丙烯酸縮水甘油 酯(61^)、溴化亞銅(0^〇與2,2'-聯(lián)吡啶(8丨？ 7)按摩爾比（80~120):1:3的比例加入到上 述混合液B中，甲基丙烯酸縮水甘油酯與無(wú)水二甲基亞砜的體積比為(0.3~0.5):1，除氧后 常溫反應(yīng)5~30分鐘后，加入35~45倍體積的甲醇，固液分離，取沉淀，干燥，制得數(shù)均分子 量分別為20~54kDa的普魯蘭-g-聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PuPGMA); (3) 將步驟(2)制得的普魯蘭-g-聚甲基丙烯酸縮水甘油酯溶解于無(wú)水二甲基亞砜中， 普魯蘭-g-聚甲基丙烯酸縮水甘油酯與無(wú)水二甲基亞砜的質(zhì)量體積比為(0.01~0.04): 1， 單位g/ml，然后加入10倍以上體積的乙醇胺(EA)，在45~55°C條件下反應(yīng)10~16小時(shí)或者 在75~85°C條件下反應(yīng)0.4~0.8小時(shí)，經(jīng)透析，干燥，制得數(shù)均分子量為22~71kDa的肝靶 向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA。4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，除氧后常溫反應(yīng)時(shí)間為 10分鐘，制得的肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA的數(shù)均分子量為36kDa; 優(yōu)選的，所述步驟(2)中，除氧后常溫反應(yīng)時(shí)間為20分鐘，制得的肝靶向陽(yáng)離子聚合物 PuPGEA的數(shù)均分子量為56kDa。5. 權(quán)利要求1所述肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA在制備傳遞pcDNA-MEG3的納米復(fù)合藥物 中的應(yīng)用； 優(yōu)選的，肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA與pcDNA-MEG3的納米復(fù)合藥物中，N/P比為5~20。6. 權(quán)利要求5所述納米復(fù)合藥物的制備方法，其特征在于，步驟如下： 將由無(wú)菌去離子水配制成氮濃度為8~12mM的肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA溶液，然后 與pcDNA-MEG3溶液按體積比1: (0.8~1.2)的比例混合，在22~28°C下培養(yǎng)20~40分鐘，制 得納米復(fù)合藥物PuPGEA/MEG3。7. 權(quán)利要求1所述肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA在制備傳遞pcDNA-P53的納米復(fù)合藥物 中的應(yīng)用； 優(yōu)選的，肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA與pcDNA-P53的納米復(fù)合藥物中，N/P比為5~20。8. 權(quán)利要求7所述納米復(fù)合藥物的制備方法，其特征在于，步驟如下： 將由無(wú)菌去離子水配制成氮濃度為8~12mM的肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA溶液，然后 與pcDNA-P53溶液按體積比1: (0.8~1.2)的比例混合，在22~28°C下培養(yǎng)20~40分鐘，制得 納米復(fù)合藥物PuPGEA/P53。9. 權(quán)利要求1所述肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA在制備傳遞pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的 納米復(fù)合藥物中的應(yīng)用； 優(yōu)選的，肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA在pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的納米復(fù)合藥物中，N/ P比為5~20。10. 權(quán)利要求9所述納米復(fù)合藥物的制備方法，步驟如下： 將由無(wú)菌去離子水配制的氮濃度為8~12mM的肝靶向陽(yáng)離子聚合物PuPGEA溶液與 pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的混合溶液按體積比1: (0.8~1.2)的比例混合，pcDNA-MEG3和 pcDNA-P53的質(zhì)量比為2:(0.8~1.2)，在22~28°(：下培養(yǎng)20~40分鐘，制得納米復(fù)合藥物 PuPGEA/(MEG3+P53)； 優(yōu)選的，所述pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的質(zhì)量比為2:1。
【文檔編號(hào)】C08F8/32GK106065047SQ201610554672
【公開(kāi)日】2016年11月2日
【申請(qǐng)日】2016年7月14日
【發(fā)明人】楊明, 徐福建, 李瑞全, 任艷利
【申請(qǐng)人】山東省腫瘤防治研究院