一種基于香豆素席夫堿銅離子配合物硫醇熒光探針及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及應(yīng)用探針技術(shù)，具體設(shè)及一種基于香豆素席夫堿銅離子配合物硫醇巧 光探針及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 琉基(-SH)是細(xì)胞中化學(xué)活性很高的基團(tuán)。生物體中存在許多蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì) 琉基化合物，如還原型谷脫甘膚(GSH)和半脫氨酸(CYS)等，它們具有重要的生理功能。而運(yùn) 些硫醇水平的異常與許多疾病有關(guān)。谷脫甘膚是細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的硫醇，作為機(jī)體內(nèi)重 要的生物活性琉基化合物，谷脫甘膚在維持生物體內(nèi)正常氧化還原反應(yīng)、細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、 基因調(diào)控等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。更重要的是，還原型谷脫甘膚能夠清除體內(nèi)的有 害毒物和代謝產(chǎn)物，維持細(xì)胞膜的完整性，減少自由基對(duì)DNA的攻擊，從而減少DNA的損傷和 突變。谷脫甘膚還參與高鐵血紅蛋白的還原作用，及促進(jìn)鐵的吸收等。細(xì)胞內(nèi)谷脫甘膚的濃 度（1~IOmM)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)胞外水平(2uM)。人體許多疾病的產(chǎn)生都與谷脫甘膚的缺乏有關(guān)， 如:肝損傷、癌癥、艾滋病、神經(jīng)退行性疾病等。因此，快捷、方便、準(zhǔn)確、靈敏地測(cè)定生物體內(nèi) 的谷脫甘膚含量，始終備受人們的高度重視。
[0003] 在各種分析方法中，巧光檢測(cè)由于其簡(jiǎn)單、方便、成本低、靈敏度高和其潛在的細(xì) 胞內(nèi)成像等特性，已被證明是一種非常實(shí)用的檢測(cè)方法。目前，許多有機(jī)反應(yīng)已被用于硫醇 巧光探針的合成，如醒和氨基之間的環(huán)化反應(yīng)、邁克爾加成反應(yīng)、2,4-二硝基苯與硫醇的裂 解反應(yīng)、親和取代反應(yīng)、二硫化物交換反應(yīng)、Cu 2+絡(luò)合物脫金屬反應(yīng)等。一種方法是基于 ChemodosimetriC反應(yīng)的分子探針，但運(yùn)種方法需要較長(zhǎng)的解育時(shí)間，通常為20分鐘到1個(gè) 小時(shí)甚至更長(zhǎng)時(shí)間，實(shí)用性較低。另一種方法是利用Cu 2+與-甜的高親和力來設(shè)計(jì)巧光探針。 運(yùn)種反應(yīng)大多發(fā)生在1毫秒之內(nèi)，因此，預(yù)計(jì)可用于臨床檢測(cè)。由于硫醇與化的特異性親和 力，使其探針有較高的靈敏度，同時(shí)也提高了此方法用于各種巧光探針設(shè)計(jì)的可能性。
[0004] 香豆素是巧光成像探針使用最廣泛的巧光基團(tuán)之一。由于它們較強(qiáng)的巧光強(qiáng)度、 優(yōu)良的溶解性、高效的細(xì)胞滲透性和易于制備等優(yōu)點(diǎn)，使其成為非常有吸引力的原始巧光 材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種基于香豆素席夫堿銅離子配合物硫 醇巧光探針及其制備方法和應(yīng)用，新的巧光探針化合物1-Cu 2+。作為前體的化合物1是化合 物2 (香豆酷阱)和2，6-化晚二甲醒化合而成?；衔?與Cu2+配位，制備成化合物1 -Cu2+。化 合物1有較強(qiáng)的巧光，而化合物1-化2Tl乎沒有巧光。當(dāng)加入含琉基氨基酸后，化合物I-Cu 2+ 的巧光恢復(fù)，而加入不含琉基的氨基酸后，化合物1-化h的巧光強(qiáng)度幾乎沒有改變。因此，化 合物1-化可用于檢測(cè)硫醇，例如:如谷脫甘膚。甚至可應(yīng)用于細(xì)胞成像中。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種基于香豆素席夫堿銅離子配合物硫醇巧光探針的制備 方法，化合物2即香豆酷阱和2,6-化晚二甲醒化合制得化合物I即香豆素類席夫堿衍生物， 化合物1與化配位，制備成硫醇巧光探針即化合物1-化2+。
[0007] 本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)包括：
[000引將0.3028g的化合物2( 1. Immol)溶于最少量的乙醇中，加入0. 0676g的2，6-化晚二 甲醒(0.5mmol);氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加熱回流12小時(shí);冷卻后有沉淀析出，得到的純凈物即為化合 物1。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種基于香豆素席夫堿銅離子配合物硫醇巧光探針， 按照上述的方法制得。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種基于香豆素席夫堿銅離子配合物硫醇巧光探針的應(yīng)用，具體 是在檢測(cè)琉基氨基酸中的應(yīng)用。
[0011] 所述的應(yīng)用，具體是在檢測(cè)谷脫甘膚中的應(yīng)用。
[0012] 所述的應(yīng)用，具體是用于生物體內(nèi)硫醇化合物的檢測(cè)。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種基于香豆素席夫堿銅離子配合物硫醇巧光探針的應(yīng)用， 在活細(xì)胞中谷脫甘膚成像中的應(yīng)用。
[0014] 所述的應(yīng)用，具體是在人子宮頸鱗癌細(xì)胞中成像的應(yīng)用。
[001引本發(fā)明用香豆酷阱和2,6-化晚二甲醒合成了一種新的化合物1，當(dāng)化合物1與Cu2+ 配位后，制備出硫醇巧光探針，即化合物I-Cu2+。巧光光譜測(cè)試表明：在C曲CN:肥PES (3:2，v/ V)溶液中，該探針對(duì)硫醇具有很好的選擇性和靈敏性，尤其是對(duì)GSH。除此之外，探針還具有 良好的細(xì)胞膜滲透性和低的細(xì)胞毒性，可用于活細(xì)胞中GSH成像，將有望用于臨床上GSH的 檢測(cè)。
【附圖說明】
[0016] 圖1是在C出CN:肥陽S(3:2，v/v)溶液中，隨著Cu2+的加入，化合物1(10皿ol/u的紫 外光譜。嵌入圖：在440nm處，化合物1的紫外可見滴定光譜。
[0017] 圖2是在C出CN:肥陽S(3:2，v/v)溶液中，隨著Cu2+的加入，化合物1(10皿ol/L)的巧 光光譜。嵌入圖：在485nm處，化合物1的巧光滴定光譜(激發(fā):440nm)。
[001引圖3是在C出CN:肥陽S (3:2，v/v)溶液中，隨著GSH的加入，化合物1 -Cu2+ (10皿01 /L) 的巧光響應(yīng)。嵌入圖：在485nm處，化合物1-化的巧光滴定光譜(激發(fā):440皿）。
[0019] 圖4是化合物1-化2+(10wiio1/L)對(duì)不同氨基酸的巧光響應(yīng)強(qiáng)度(發(fā)射:485皿)。第一 欄代表加入不同氨基酸后的巧光強(qiáng)度;第二欄代表同時(shí)加入GSH和非琉基氨基酸后的巧光 強(qiáng)度。
[0020] 圖5a是在Si化細(xì)胞中，化合物1的巧光成像。
[0021] 圖化是在Si化細(xì)胞中，化合物1-化的巧光成像。
[0022] 圖5c是在Si化細(xì)胞中，化合物1-化h+G甜的巧光成像。
[0023] 圖5d是在Si化細(xì)胞中，化合物1的明場(chǎng)。
[0024] 圖5e是在Si化細(xì)胞中，化合物1-化的明場(chǎng)。
[0025] 圖5f是在Si化細(xì)胞中，化合物1-化h+G甜的明場(chǎng)。
[0026] 圖6是化合物1的氨譜。
[0027] 圖7是化合物1的碳譜。
[0028] 圖8是化合物I的質(zhì)譜。
[0029] 圖9是化合物1(10皿ol/L)在C出CN:肥PES(3:2，v/v)溶液中，對(duì)各種金屬離子的紫 外可見吸收光譜。
[0030] 圖10是化合物1(10皿ol/L)在C曲CN:肥陽S(3:2，v/v)溶液中，對(duì)各種金屬離子的 巧光光譜響應(yīng)。
【具體實(shí)施方式】
[0031 ]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明。
[0032]實(shí)施例1 [00削試劑
[0034] 4-二乙基氨基水楊醒，丙二酸二乙醋，贓晚，80%水合阱，2,6-化晚二甲醒，各種金 屬離子的高氯酸鹽他 3+，Ag+，F(xiàn)e]+，r，Na+，Mg2+，Pb2+，Cah，呢2+，Mn2+，Cd2+，F(xiàn)e2+，Zn2+，Ni 2+，C〇2 + ,Cu2+)的水溶液(2.OX I(T2M),各種氨基酸的水溶液(2.OX I(T2M),無水乙醇，乙臘(色譜 純），二甲基甲酯胺(分析純），肥陽S(抑:7.35-7.45)溶液等。
[0035] 合成過程
[0036] 合成過程式1所示:7-N，N-二甲基氨基-2-氧-2H-3-香豆酸醋(化合物3)和化合物2 是現(xiàn)有技術(shù)合成的?；衔?是由化合物2和2,6-化晚二甲醒合成，并通過氨譜、碳譜、質(zhì)譜 進(jìn)行表征（圖6,7,8)?；衔颕-Cu 2+是由化合物1與Cu(Cl〇4)2 ? 6出0制備的。
[0037]
[003引化合物1對(duì)化的紫外可見吸收和巧光光譜響應(yīng)
[0039] 在C出CN:肥陽S(3:2，v/v)溶液中，化合物1(10皿ol/U的紫外可見吸收光譜如圖1 所示，最大紫外吸收在440nm處。隨著Cu(Cl〇4)2