作為生物標(biāo)記物的電中性金屬配合物的制作方法
【專利說明】作為生物標(biāo)記物的電中性金屬配合物
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年6月18日提交的題目為"作為生物標(biāo)記物的電中性金屬配合物" 美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61 /956，810的權(quán)益，將該申請(qǐng)的內(nèi)容并入本文作為參考。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及可生物偶聯(lián)的發(fā)光金屬配合物，以及它們作為新型標(biāo)記分子在化學(xué)、 生物化學(xué)和生物分析領(lǐng)域中的應(yīng)用，如免疫檢測(cè)和DNA探針。更具體的說，本發(fā)明涉及電中 性的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記分子以及它們?cè)陔娀瘜W(xué)發(fā)光免疫分析中的應(yīng)用。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 基于生物親和性（即兩種生物活性物質(zhì)，如抗體/抗原，的選擇性結(jié)合)的生物分析 方法在很大程度上依賴生物標(biāo)記分子，標(biāo)記技術(shù)以及對(duì)產(chǎn)生于標(biāo)記分子的信號(hào)的檢測(cè)。生 物標(biāo)記分子是能夠自身，或者在與其它試劑發(fā)生物理/化學(xué)相互作用時(shí)，發(fā)出能與被測(cè)物質(zhì) 的量相關(guān)的可檢測(cè)的信號(hào)的化學(xué)或生物化學(xué)物質(zhì)。生物標(biāo)記分子包括，但不僅限于:含放射 性原子的分子(放射性），發(fā)光化合物(在光激發(fā)或化學(xué)反應(yīng)中發(fā)光），電活性化合物(通過氧 化還原反應(yīng)產(chǎn)生電信號(hào)），磁性顆粒(磁信號(hào)）和酶(通過與底物的反應(yīng)，生成可檢測(cè)的物質(zhì) 或者光信號(hào)）。生物標(biāo)記分子包含一個(gè)或多個(gè)信號(hào)產(chǎn)生單元以及一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)。后 者與待標(biāo)記的生物分子易于形成共價(jià)鍵。標(biāo)記過程是將一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記分子和生物活性物 質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物保持對(duì)特定待檢測(cè)物質(zhì)的生物親和性。
[0006] 通過一系列的電化學(xué)氧化還原反應(yīng)以及與共反應(yīng)劑（諸如專利US 6451225和US 6702986中披露的三丙胺)發(fā)生的后續(xù)化學(xué)反應(yīng)，電化學(xué)發(fā)光(ECL)已經(jīng)發(fā)展成為一種成熟 的生物分析技術(shù)，在此技術(shù)中，一種金屬配位化合物，如舒（Π )多二亞胺(polydiimine)復(fù) 合物，被用作ECL標(biāo)記分子的信號(hào)產(chǎn)生單元。美國(guó)專利（5221605,5238808,5310687， 5714089,5731147,6140138,6316607)和許多研究論文披露了ECL標(biāo)記分子以及它們?cè)诿庖?分析和 DNA 探針領(lǐng)域的應(yīng)用 Η^Ι^η:6·Ρ·Β1α^Λι?Γηθ?Β?·，(：Ηη·αιθπκ1991，37/9，1534-1539;J.H.Kenten et al.，Clin.Chem.l991,37/9,1626-1632·)。
[0007] 對(duì)ECL標(biāo)記分子的改進(jìn)是一個(gè)長(zhǎng)期持續(xù)的努力方向。一方面，有大量的工作試圖通 過在一個(gè)或多個(gè)與釕（II)離子配位的配體上連接上功能基團(tuán)而重新設(shè)計(jì)釕（II)配合物。另 一方面，把ECL發(fā)光體從釕（II)配合物擴(kuò)展到其它金屬配合物的努力也進(jìn)行了很多，其中一 些在專利中有所披露。比如美國(guó)專利5858676和6468741分別公開了稀土金屬配合物和錸配 合物的 ECL。專利申請(qǐng) W02012107420，US2013/0323719，US2013/0323857，W02014019707， W02014019708和W02014019711則公開了用作ECL標(biāo)記分子的基于銥的新型配合物。
[0008] 在基于釕（II)的ECL發(fā)光體的改進(jìn)方面，美國(guó)專利US 5981286公開了帶有親水性 雙齒配體的釕（II)配合物。W0 99/15694公開了一種分子設(shè)計(jì)，其中金屬配合物發(fā)光體通過 共價(jià)鍵與共反應(yīng)劑（即三丙胺或其類似物)相連接。不過，由于在ECL過程中，共反應(yīng)劑是要 被消耗的（而不是循環(huán)使用），所以它的濃度在實(shí)際的生物測(cè)定中須比發(fā)光體的濃度高很多 倍。這種方案不能幫助提高ECL的強(qiáng)度。為了提高ECL生物檢測(cè)的靈敏度，美國(guó)專利US 5679519公開了一種多標(biāo)記的探針復(fù)合物，它包含有生物素化的牛血清白蛋白分子作為平 臺(tái)，以及大量被該平臺(tái)結(jié)合的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記分子。另外，美國(guó)專利申請(qǐng)US 2005/0059834 中也提出了構(gòu)造擔(dān)載有多個(gè)ECL發(fā)光體的樹枝狀構(gòu)架從而實(shí)現(xiàn)在生物分子的單個(gè)位點(diǎn)上進(jìn) 行多標(biāo)記（也見M.Zhou et al.，Anal.Chem.2003,75,6708-6717)。
[0009] 進(jìn)一步地，雙齒配體的的選擇也已經(jīng)超越了以2，2 聯(lián)吡啶和1，10-菲咯啉的基礎(chǔ) 類型。美國(guó)專利7750157 B2(EP1759204 A1)公開了一種釕（II)標(biāo)記物設(shè)計(jì)，其中生物偶聯(lián) 臂連接在一個(gè)既非2，2 聯(lián)吡啶也非1，10-菲咯啉的雙齒配體上。
[0010] 以上專利和研究論文中所披露的這些釕（II)ECL發(fā)光體（沒有生物偶聯(lián)基團(tuán)）和 ECL標(biāo)記分子(帶有生物偶聯(lián)基團(tuán)）的一個(gè)共同特點(diǎn)是它們都有一個(gè)帶正電荷的金屬配合物 發(fā)光體(見圖1A)，和不發(fā)光的反離子，如氯離子Cr或六氟磷酸根離子PFf等。用這些發(fā)光體 標(biāo)記的物質(zhì)的生物活性或者選擇性親和能力會(huì)由于帶正電的金屬配合物的引入而降低。降 低了的生物活性在基于生物親和性的生物檢測(cè)中會(huì)提升非特異性結(jié)合，從而降低生物分析 的靈敏度和重復(fù)性。針對(duì)帶有正電性ECL發(fā)光體的標(biāo)記物的這一缺點(diǎn)，美國(guó)專利5958783 (CN1134154，EP0720614 B1)公開了一類ECL標(biāo)記分子(見圖1B)，其特征在于，在帶正電的發(fā) 光體和反應(yīng)基團(tuán)（即生物偶聯(lián)基團(tuán)）之間有一個(gè)帶電荷的連接體。據(jù)其披露，由于降低了對(duì) 蛋白的非特異性結(jié)合，這類標(biāo)記物改進(jìn)了ECL免疫分析的性能。不過在這個(gè)標(biāo)記物中，信號(hào) 產(chǎn)生單元(ECL發(fā)光體)本身還是帶正電荷的金屬配合物，需要反離子來中和其正電荷。
[0011] 同樣為了降低有害的非特異性結(jié)合，美國(guó)專利6808939B2(CN1612861A)公開了一 類帶電荷(尤其是負(fù)電荷)功能基團(tuán)的雙齒配體（即聯(lián)吡啶和菲咯啉）以及含有這些帶電荷 配體的釕（II)配合物標(biāo)記分子(見圖1C)。這些結(jié)構(gòu)為M(L'）（L"） 2的二雜配標(biāo)記分子具有負(fù) 電荷以及可離解的陽(yáng)離子。結(jié)果顯示，一些帶負(fù)電荷的發(fā)光體標(biāo)記在抗體上后，非特異性的 ECL信號(hào)顯著降低。然而，在降低非特異性信號(hào)的同時(shí)，沒有顯示對(duì)特異性信號(hào)水平的改進(jìn)。
[0012] 這些ECL發(fā)光體或含這些發(fā)光體的標(biāo)記分子或者帶正電荷（絕大多數(shù)情況），或者 帶負(fù)電荷，都需要有反離子來中和電荷。它們都是離子性化合物，在電解液溶液中均會(huì)分開 或電離成陽(yáng)離子和陰離子。此外，已經(jīng)合成的這些金屬配合物或者是二雜配，或者是均配金 屬配合物，即配合物中至少有兩個(gè)二齒配體是相同的。
[0013] L.Della Ciana等（J.Phys.Chem.C 2010,114,3653-3658)描述了一個(gè)二雜配兩性 離子釕(II)發(fā)光體，其含有兩個(gè)相同的2,2'_聯(lián)吡啶配體和一個(gè)苯磺酸化的菲咯啉配體，該 發(fā)光體在水相中的ECL強(qiáng)度與三聯(lián)吡啶釕（II)配合物相比要高。不過，和其它一些不具有生 物偶聯(lián)基團(tuán)的、報(bào)道所稱的高強(qiáng)度ECL發(fā)光體一樣，該發(fā)光體用于ECL免疫分析不可行，而且 在該金屬配合物上引入反應(yīng)性生物偶聯(lián)基團(tuán)的合成方法也未建立。
[0014] 釕(II)配合物在包含有共反應(yīng)劑和溶劑的特定電解質(zhì)溶液中的ECL強(qiáng)度隨著配體 的結(jié)構(gòu)和配體的組合方式不同而差別巨大。由于ECL產(chǎn)生過程的復(fù)雜性(W.Miao et al， JACS，2002，124，14478-14485)，一般共識(shí)是，任何單一的性質(zhì)，諸如光量子效率，氧化還原 電勢(shì)，發(fā)光波長(zhǎng)以及發(fā)光體的電荷狀態(tài)與ECL強(qiáng)度沒有相關(guān)性（M.Zhou et al， Inorg. Chem. 2005，44，8317-8325)。不過，用電中性的發(fā)光體標(biāo)記一個(gè)生物物質(zhì)不會(huì)改變?cè)?物質(zhì)的電荷狀態(tài)。因此，在大小相近或分子量類似的標(biāo)記物中，電中性的標(biāo)記分子對(duì)于待標(biāo) 記生物物質(zhì)的生物活性的影響最小。鑒于此，本發(fā)明注重設(shè)計(jì)配體的結(jié)合方式，以使金屬配 合物(例如釕（II)配合物)成為電中性的ECL標(biāo)記物，其在水性緩沖溶液或任何其它溶劑中 不解離成陽(yáng)離子和陰離子。
[0015] 在我們通過使用電中性標(biāo)記物降低標(biāo)記物對(duì)被標(biāo)記物活性的影響的同時(shí)，我們驚 奇地發(fā)現(xiàn)電中性的ECL標(biāo)記物不僅降低了非特異性信號(hào)，一部分電中性ECL標(biāo)記分子還產(chǎn)生 了更高的ECL強(qiáng)度。
[0016] 過去公開的釕（II)配合物標(biāo)記分子的合成主要遵循一種方法(見下面反應(yīng)式）。在 這種方法中，首先合成順式I了二亞胺二氯化物(cis-ruthenium diimine(L)dicholoride)， 即cis-RU(L)2Cl 2)，然后再將具有生物偶聯(lián)功能的二亞胺配體與金屬離子配位。
[0017] RuCl3\xH2〇+L-cis-Ru(L)2Cl2(l)
[0018] cis-Ru(L)2Cl2+L'-Ru(L)2(L'）C12(2)
[0019] 美國(guó)專利US 6808929B2公開了另一種合成方法(專利中的實(shí)施例2)。其中，一個(gè)具 有生物偶聯(lián)功能的二亞胺配體，即4-甲基-4'-(3-羧丙基)-2,2'_聯(lián)吡啶，先和氯化釕（II) 發(fā)生配位，而后再引入另外兩個(gè)相同的配體，形成ECL標(biāo)記物。
[0020] 這些合成方法產(chǎn)生二雜配配合物標(biāo)記分子，它們具有兩個(gè)不具有生物偶聯(lián)功能的 相同配體和一個(gè)具有生物偶聯(lián)功能的配體。合成三雜配金屬配合物ECL標(biāo)記分子的工作在 現(xiàn)有技術(shù)中還未見報(bào)道。
[0021] 不同于圖1A-C中那些具有帶正電荷或者帶負(fù)電荷的釕（II)發(fā)光體，圖1D所示的電 中性ECL標(biāo)記分子具有三個(gè)不同的配體，不能套用二雜配配合物標(biāo)記分子的合成方法來進(jìn) 行合成。所以，本發(fā)明中除了披露配體組合模式外，該發(fā)明也涉及一種將三個(gè)不同的二亞胺 配體依次與金屬離子配位形成三雜配ECL標(biāo)記分子的合成方法。
[0022]本發(fā)明進(jìn)一步公開了用這類中性ECL發(fā)光體標(biāo)記的生物物質(zhì)以及它們?cè)贓CL免疫 分析中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有電中性金屬配合物發(fā)光體的發(fā)光生物標(biāo)記物。
[0024] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供導(dǎo)致金屬配合物發(fā)光體呈電中性的不同的配體組合 模式。
[0025] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供具有電中性金屬配合物發(fā)光體的三雜配標(biāo)記物的合 成方法。
[0026] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供標(biāo)記有電中性金屬配合物發(fā)光體的物質(zhì)。
[0027] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供用于開展化學(xué)物質(zhì)、生物化學(xué)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)的 ECL定量分析的生物標(biāo)記分子。
[0028] 發(fā)明概述
[0029]本發(fā)明涉及生物分析方法的改進(jìn)，具體來說是利用金屬配合物的電產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光 或電化學(xué)發(fā)光(ECL)的免疫分析和核酸檢測(cè)。本發(fā)明所描述的金屬配合物以釕（II)配合物 作為實(shí)例。但是，能生成與金屬釕(II)多二亞胺配合物類似的金屬螯合物的其它過渡金屬， 如金屬鋨、鉑、錸、銥等，也在本發(fā)明的涵蓋范圍內(nèi)。
【附圖說明】
[0030]圖1展不現(xiàn)有技術(shù)公開的(A-C)和本發(fā)明披露的(D)ECL標(biāo)記分子。
[0031] 圖2是化合物3的1H NMR圖譜。
[0032] 圖3是化合物6的1H NMR圖譜。
[0033] 圖4是化合物10的1H NMR圖譜。
[0034] 圖5是化合物15的1H NMR圖譜。
[0035] 圖6是化合物16的1H NMR圖譜。
[0036] 圖7是標(biāo)記分子17的1H NMR圖譜（圖譜左邊:芳香環(huán)區(qū)；圖譜右邊:脂肪鏈區(qū)）。
[0037] 圖8是標(biāo)記分子18的1H NMR圖譜。
[0038] 圖9是標(biāo)記分子19的1H NMR圖譜。
[0039] 圖10是標(biāo)記分子20的1H NMR圖譜。
[0040] 圖11是標(biāo)記分子16，19,27和Ru(2,2'_聯(lián)吡啶)2[4-(2,2'_聯(lián)吡啶-4-基)丁酸]Cl 2 (標(biāo)識(shí)為Ru-Ref)的吸收光譜。
[0041 ] 圖12是標(biāo)記分子16，19,27和Ru(2,2'_聯(lián)吡啶)2[4-(2,2'_聯(lián)吡啶-4-基)丁酸]Cl 2 (標(biāo)識(shí)為Ru-Ref)的光致發(fā)光光譜。
[0042]圖13比較不同標(biāo)記分子在含有三丙胺的pH值為6.8的磷酸鹽緩沖溶液中以1.4V vs.Ag/AgCl階躍電勢(shì)激發(fā)所得到的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。釕（II)配合物的濃度均為:0.1μπι〇1 L-、
[0043] 圖14比較標(biāo)記分子16和Ru-Ref在含有三丙胺的pH值為6.8的磷酸緩沖溶液中以 1.4V vs.Ag/AgCl電階躍電勢(shì)激發(fā)所得到的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。釕(II)配合物的濃度分別為： 10-7，10- 8，10-9mol L-、
[0044] 圖15比較使用標(biāo)記分子16和Ru-Ref在免疫分析測(cè)試中的ECL信號(hào)強(qiáng)度。
[0045] 發(fā)明詳述
[0046] 本文中所用到的術(shù)語(yǔ)"金屬配合物"，"配位金屬配合物"，"發(fā)光金屬配合物"，"ECL 金屬配合物"，"釕（II)配合物"，"金屬釕（II)配合物"和"金屬螯合物"有時(shí)可交替使用。在 本發(fā)明的范圍里，金屬配合物或者ECL金屬配合物包含"發(fā)光體"或"ECL發(fā)光體"以及"標(biāo)記 分子"或"ECL標(biāo)記分子"。前者是沒有生物偶聯(lián)基團(tuán)的金屬配合物，而后者則指的是具有生 物偶聯(lián)基團(tuán)的金屬配合物。生物偶聯(lián)基團(tuán)是一類功能化的或能進(jìn)行反應(yīng)的反應(yīng)性基團(tuán)，它 可以在溫和的條件下，如處于室溫的生理緩沖溶液中，和其它化學(xué)、生物化學(xué)和生物物質(zhì)發(fā) 生反應(yīng)，形成高度穩(wěn)定的共價(jià)鍵。
[0047] 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，被稱作"標(biāo)記物"，"標(biāo)記物分子"，"釕(II)標(biāo)記物"和"ECL標(biāo)記 物"的物質(zhì)可與其它物質(zhì)形成共價(jià)鍵，這些其它物質(zhì)諸如，具有生物活性的被測(cè)物或其類似 物，基于親和性的被測(cè)物的識(shí)別性配對(duì)物或