一種含三氮唑基的他克林-香豆素衍生物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種含三氮唑基的他克林-香豆素衍生物及其應(yīng)用，具體涉及一種含 三氮唑基的他克林-香豆素衍生物及其在抗阿茨海默癥藥物中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿茨海默癥(Alzheimer's disease, AD)是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系 統(tǒng)退行性疾病。臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙以及 人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征，65歲以前發(fā)病者，稱早老性癡呆;65歲以后發(fā)病 者稱老年性癡呆，是一種多因素導(dǎo)致的疾病，確切病因至今仍無結(jié)論性的闡明，家族史、女 性、頭部外傷、低教育水平、甲狀腺病、母育齡過高或過低、病毒感染等因素與該病發(fā)病有 關(guān)，作為一種常見的老年疾病，嚴(yán)重威脅著老年人的健康。
[0003] 該病起病緩慢或隱匿，病人及家人常說不清何時(shí)起病，多見于70歲以上（男性平均 73歲，女性為75歲）老人，少數(shù)病人在軀體疾病、骨折或精神受到刺激后癥狀迅速明朗化，女 性較男性多（女：男為3:1)。主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能下降、精神癥狀和行為障礙、日常生活能力 的逐漸下降。據(jù)統(tǒng)計(jì)目前中國患者超過560萬，并隨著人口老齡化進(jìn)程呈快速增長的態(tài)勢。 AD不僅嚴(yán)重危害老年人的健康，而且還給患者家屬帶來沉重的精神負(fù)擔(dān)，為社會帶來巨大 的健康危機(jī)，更對經(jīng)濟(jì)造成巨大的影響，因而引起人們的普遍關(guān)注。
[0004] 目前公認(rèn)的幾大致病機(jī)理包括β-樣淀粉蛋白（Αβ)胞外自聚集形成毒性低聚物， tau蛋白過磷酸化在胞內(nèi)聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，膽堿能神經(jīng)損傷導(dǎo)致膽堿能傳導(dǎo)障礙，腦 內(nèi)金屬離子濃度過高引起氧化應(yīng)激并可誘導(dǎo)Αβ聚合形成毒性復(fù)合物。而抗AD藥物開發(fā)也主 要基于以上幾種致病機(jī)理，包括Αβ聚集抑制劑、tau蛋白過磷酸化抑制劑、膽堿酯酶抑制劑、 金屬離子螯合劑、單胺氧化酶抑制劑，以及基于多個(gè)病因的多靶點(diǎn)藥物。
[0005] 目前臨床使用的最有效治療藥物為乙酰膽堿酯酶抑制劑（AChEIs)，包括 galanthamine (REMINYL)，rivastigmine (EXELON)，donepezil (ARICEPT)。但上述抑制劑 存在不同程度的缺陷，由于只針對單個(gè)病因，不能逆轉(zhuǎn)或治愈疾病，同時(shí)存在肝臟毒性大、 生物利用度低等問題，因此開發(fā)新型的多靶點(diǎn)藥物用于治療阿茨海默癥非常必要和緊迫。
[0006] 中國專利"抗阿茨海默癥藥物L(fēng)u-AE-58054的制備方法"，申請?zhí)?01410420968.X 公開了一種制備Lu-AE-58054的新方法，原料便宜、收率較高、適合工業(yè)化生產(chǎn)，但還是存在 肝臟毒性大的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一類對乙酰膽堿酯酶、β-樣淀粉蛋白聚合以及單胺氧化酶具 有高抑制作用的他克林-香豆素衍生物，用于治療阿茨海默癥，以及提供該類化合物的制備 方法和用途。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下： 一種含三氮唑基的他克林-香豆素衍生物，結(jié)構(gòu)式如下式I所示，包括式I化合物及其藥 學(xué)上適用的鹽：
其中Y為:,Θ，CH2; Ζ 為CH2，°CO(CH2)q，這里q為整數(shù)1，2, 3, 4; m為整數(shù)1，2; η為整數(shù)0，1，2; R為氫、甲基、苯基、甲氧基。
[0009] 上述結(jié)構(gòu)通式中： 當(dāng)Υ為6_:，Ζ為CH2時(shí)， R為氫、甲基、苯基、甲氧基;m = 1，2;n = 1; 當(dāng)Υ為G續(xù)，Ζ為0C0(CH2)q時(shí)， R為氫、甲基、苯基、甲氧基;m = 1，2;n = l;q = 1-4; 當(dāng)Y為CH2，Z為CH2時(shí)， R為氣、甲基、苯基、甲氧基;m = 1，2;n = 1，2，3; 當(dāng)Y為 CH2，Z為0C0(CH2)<^， R為氫、甲基、苯基、甲氧基;m = 1，2;n = 1，2，3;q = 1-4。
[0010] 上述結(jié)構(gòu)通式可由以下幾種路線合成制得： (1)由化合物IA和IB在Cu(I)催化下發(fā)生click反應(yīng)制得，如下反應(yīng)式所示：
反應(yīng)采用一價(jià)銅鹽作為催化劑，包括碘化亞銅、硫酸銅與抗壞血酸鈉原位生成的Cu (I)，通常在乙腈、二氯甲烷、正丁醇、乙酸乙酯等溶劑以及上述混合溶劑中進(jìn)行，反應(yīng)溫度 在-10~60°C，一般在室溫條件下反應(yīng)12~24小時(shí)，所得產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)方法如柱層析、重結(jié)晶提 純可得到純產(chǎn)物。
[0011] 其中化合物IA中X為00時(shí)，可由下式制得，
他克林或含取代基的他克林la可由商品化的鄰氨基苯甲腈和環(huán)己酮參照文獻(xiàn)合成得 到（Eur. J. Med. 2013, 64, 540)，?；噭﹍b-般采用氯乙酰氯或溴乙酰溴（上式中X為 氯或溴），生成Ic反應(yīng)所用堿采用三乙胺、二異丙基乙基胺、吡啶、4-二氨基吡啶等，反應(yīng)溶 劑采用二氯甲烷、四氫呋喃等，反應(yīng)一般在-20_100°C進(jìn)行，通常在加熱條件下反應(yīng)2-12小 時(shí)，所得產(chǎn)物再經(jīng)疊氮化鈉取代制得IA，反應(yīng)所用溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜 等，產(chǎn)物可經(jīng)適當(dāng)方法如柱層析、重結(jié)晶提純可得到純產(chǎn)物。
[0012] 化合物IA中X為CH2時(shí)，可由下式制得，
9_氯他克林或含取代基的9-氯他克林1C可參照文獻(xiàn)由商品化的鄰氨基苯甲酸和環(huán)己 酮在三氯氧磷中反應(yīng)得到(Bioorg. Med. Chem. 2013，21，4559)，疊氮試劑Id由鹵代胺 與疊氮化鈉反應(yīng)制得(Angew. Chem. Int. Ed. 2012，51，11073)。制備If的反應(yīng)一般采 用高沸點(diǎn)惰性溶劑如正戊醇、苯酚、甲苯、氯苯、二甲苯等，反應(yīng)在60_150°C之間進(jìn)行，所得 產(chǎn)物可經(jīng)柱層析等方法提純得到。
[0013] 化合物IB可由下式制得
如反應(yīng)式所示，香豆素衍生物IF與帶有離去基團(tuán)的端缺衍生物If在堿催化作用下制得 IB，反應(yīng)所用堿包括碳酸鉀、碳酸銫等，所用溶劑包括丙酮、二氯甲烷、四氫呋喃等，所得產(chǎn) 物可經(jīng)柱層析等方法提純得到純品。
[0014] (2)由化合物1C和ID在惰性溶劑中發(fā)生取代反應(yīng)制得，如下反應(yīng)式所示。
[0015]反應(yīng)采用惰性溶劑如正戊醇、苯酚、甲苯、氯苯、二甲苯等，在60-150°C之間進(jìn)行， 所得產(chǎn)物經(jīng)柱層析等方法提純得到純品，其中化合物1C參照文獻(xiàn)由商品化的鄰氨基苯甲酸 和環(huán)己酮在三氯氧磷中反應(yīng)得到(Bioorg. Med. Chem. 2013，21，4559)。
[0016] 化合物ID可有下式制得
反應(yīng)采用一價(jià)銅鹽作為催化劑，包括碘化亞銅、硫酸銅與抗壞血酸鈉原位生成的Cu (I)，反應(yīng)通常在乙腈、二氯甲烷、正丁醇、乙酸乙酯等溶劑以及上述混合溶劑中進(jìn)行，反應(yīng) 溫度在25-60°C，一般在室溫條件下反應(yīng)12-24小時(shí)，所得產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)方法如柱層析、重結(jié)晶 提純可得到純產(chǎn)物。
[0017] (3)由化合物IE和IF在發(fā)生取代反應(yīng)制得，如下反應(yīng)式所示。
[0018] 所用堿包括但不限于KK〇3, cS2c〇3,所用溶劑包括丙酮、四氫呋喃、二氯甲烷、乙 酸乙酯，反應(yīng)溫度為25-60°C，所得產(chǎn)物經(jīng)柱層析、重結(jié)晶等方法提純得到純品。
[0019]其中化合物IE可由下式制得
反應(yīng)采用一價(jià)銅鹽作為催化劑，包括碘化亞銅、硫酸銅與抗壞血酸鈉原位生成的Cu (I)，反應(yīng)通常在乙腈、二氯甲烷、正丁醇、乙酸乙酯等溶劑以及上述混合溶劑中進(jìn)行，反應(yīng) 溫度在25-60°C，一般在室溫條件下反應(yīng)12-24小時(shí)，所得產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)方法如柱層析、重結(jié)晶 提純可得到純產(chǎn)物。其中IA的制備與制備方法(1)中描述相同。
[0020]膽堿酯酶抑制活性測試方法： 乙酰膽堿酯酶酶源采用電鰩凍干粉，丁酰膽堿酯酶采用馬血清凍干粉，實(shí)驗(yàn)前用磷酸 二氫鉀緩沖液(？!1 = 7.4)稀釋至0.21]/1^，用比色法測定4〇^和仙〇^的抑制活性。反應(yīng)總 容量為250 yL，內(nèi)含碘化硫代乙酰膽堿或碘化硫代丁酰膽堿25 yL (1 mmol/L)，PH = 7.4 的磷酸二氫鉀緩沖液25 yL，化合物溶液25 yL，顯色劑二（3-羧基-4-硝基）苯基二硫化物 (即Ellman's試劑，DTNB) 125 yL (1 mmol/L)，最后加入稀釋的酶溶液，在37°C保溫5分鐘 后于405 nm用paradigm微孔板檢測儀測定吸光度，設(shè)定測試時(shí)間50分鐘，每5分鐘讀取一次 吸光度數(shù)據(jù)。所有樣品均平行測三次，以未加化合物的測定組吸光度作為100%，未加化合物 和酶的測定組為反應(yīng)需扣除的背景吸光度，測定的化合物組吸光度與未加化合物組相比 較，降低的百分率即為酶抑制率。每個(gè)化合物先以幾個(gè)濃度進(jìn)行初篩，按初篩結(jié)果選擇化合 物的6至8個(gè)濃度測定其酶抑制率，并以該化合物摩爾濃度的負(fù)對數(shù)與酶抑制率進(jìn)行線性回 歸，求得50%抑制時(shí)的摩爾濃度即為該化合物的IC 5〇值。
[0021 ] β-淀粉樣蛋白的自聚集抑制活性測試方法： 淀粉樣蛋白（Afo-42)凍干粉溶解于六氟異丙醇，室溫靜置16個(gè)小時(shí)進(jìn)行解聚，再在室 溫下用氮?dú)饬鞔党惐?，得解聚的Αβ?42用DMS0溶解配制成濃度為200 μΜ溶液。用熒 光法測定化合物的Αβ自聚集抑制活性。反應(yīng)總?cè)萘繛?0 yL，內(nèi)含樣品的DMS0溶液5 yL(濃 度為200 μΜ)，解聚的Afo-42DMS0溶液5 yL(濃度為200 μΜ)，在37°C保溫72 h后加入硫黃素 T 的磷酸二氫鉀緩沖液(PH = 7.4)溶液40 yL (濃度為200 μΜ)，在paradigm微孔板檢測儀上 讀取熒光值。激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長下為435 nm。所有樣品均平行測三次，以未加化 合物的測定組吸光度作為100%，測定的化合物組熒光值與未加化合物組相比較，降低的百 分率即為在20 μΜ濃度下Αβ自聚集抑制率。
[0022]單胺氧化酶(ΜΑ0)抑制活性測試方法： 1八0抑制活性用吸光度法測定，先配置測試溶液，在9.5 11^的?85緩沖液(？!1 = 7.4)中 加入200 yL Amplex red試劑（20 mM)，200 yL底物（100 mM, ΜΑ0-Α:酪胺，ΜΑ0-Β:芐 胺），200 yL的辣根酶（200 U/mL)，混合均勻。另取98 yL稀釋的MA0-A(0.3 yg/mL)，MA〇-B (2.5 yg/mL)溶液，加入2 yL待測樣品溶液在25°C孵化30分鐘后加入測試溶液100 yL，在 37°C保溫5分鐘后于570 nm用paradigm微孔板檢測儀測定吸光度，設(shè)定測試時(shí)間60分鐘，每 5分鐘讀取一次吸光度數(shù)據(jù)。所有樣品均平行測三次，以未加化合物的測定組吸光度作為 100%，未加化合物和ΜΑ0酶的測定組為反應(yīng)需扣除的背景吸光度，測定的化合物組吸光度與 未加化合物組相比較，降低的百分率即為酶抑制率。每個(gè)化合物先以幾個(gè)濃度進(jìn)行初篩，按 初篩結(jié)果選擇化合物的6至8個(gè)濃度測定其酶抑制率，并以該化合物摩爾濃度的負(fù)對數(shù)與酶 抑制率進(jìn)行線性回歸，求得50%抑制時(shí)的摩爾濃度即為該化合物的I C5〇值。
[0023]依照上述方法測試所得部分化合物的活性結(jié)果列表如下：
表1:膽喊醋酶抑制IC5Q及Αβ自聚集抑制率
從表1可見，其中部分化合物(化合物11-16)對乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶都具有較 好的抑制活性，同