表達載體pETDuet-gaccr，以備構(gòu)建共表達載 體pETDuet-gaccr-gdh(圖 1);
[0059] 將實施例2得到的帶有BglII，XhoI酶切位點的葡萄糖脫氫酶⑶Η基因gdh片 段和重組表達載體pETDuet-gaccr分別進行雙酶切，所用內(nèi)切酶為Fermentas的快切酶FastDigestFastDigest 所用的酶切體系及條件參見實施例3 ;將酶切 產(chǎn)物進行回收，回收產(chǎn)物進行連接，連接體系及條件參見實施例3 ;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿 菌DH5α，轉(zhuǎn)化步驟如上所述；提取測序正確的重組載體pETDuet-gaccr-gdh，將其轉(zhuǎn)化表 達宿主BL21 (DE3)pLysS(購自廣州齊云生物技術(shù)有限公司）中，得到的菌株即為所要構(gòu)建 的重組大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS(pETDuet-gaccr-gdh)。
[0060] 實施例5重組大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS (pETDuet-gaccr-gdh)在不對稱還原潛手 性羰基化合物制備光學活性醇中的應(yīng)用
[0061] (1)將實施例 4 獲得的重組表達菌株BL21 (DE3)pLysS(pETDuet-gaccr-gdh) 在37°C，200rpm的條件下培養(yǎng)至菌液濃度0D6QQ= 1. 2,然后降溫至20°C，加入終濃度為 0. 4mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)15~18h后，4°C，9000rpm離心5min收集菌體，得到微生物細 胞催化劑（濕菌體）；
[0062](2)在10mL的具塞三角瓶中分別加入4mL檸檬酸鹽緩沖液（100mM，pH5. 5)，緩沖 液中含有終濃度為50mM葡萄糖和終濃度為15mg/mL微生物細胞催化劑，置于氣浴恒溫振蕩 器中（30°C)孵育10min，加入終濃度為5mM的溶解于DMS0中的羰基化合物，開啟反應(yīng)，定時 取樣，用100μL(2X50μL)乙酸乙酯（含內(nèi)標物5mM正十二烷）萃取殘留產(chǎn)物和產(chǎn)物，用 旋渦混合儀振蕩萃取5min，離心（1200〇rpm)5min后，取上清供氣相色譜（GC)檢測。重組菌 BL21 (DE3)pLysS(pETDuet-gaccr-gdh)應(yīng)用于不對稱催化轉(zhuǎn)化潛手性羰基化合物的催化效 果見附件表1和圖2。
[0063] 表1重組大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS (pETDuet-gaccr-gdh)的催化效果
[0064]
[0065] L0066」 對比買施例
[0067] (1)以醋酸桿菌XZY003基因組為模板，設(shè)計引物7 (5'-CATGCCATGGATATGGCACGTGT AGCAGGCAAGGTT-3'）和
[0068] 引物 8 :5' ~CCGCTCGAGTCATTGTGCTGTTGACCTCCCATCCAT~3,，其中酶切位點分別為 NcoI和Xho1(下劃線）；PCR擴增得到目的片段羰基還原酶AcCR基因accr;將PCR擴增 產(chǎn)物進行回收，并與載體pET22b+分別進行雙酶切（NcoI和XhoI)，酶切后的產(chǎn)物回收并 進行連接；具體方法參見實施例1 ;
[0069] (2)以醋酸桿菌XZY003基因組為模板，設(shè)計引物9 (5'-CATGCCATGGCGATGGCACGTGT AGCAGGCAAGGTT-3'）和引物 10 (5' ~CCGGAATTCGGTCATTGTGCTGTTGACCTCCCATCCAT~3,);其中 酶切位點分別為NcoI和EcoRI;將PCR擴增產(chǎn)物進行回收，并與載體pET30b+分別進行 雙酶切（NcoI和EcoRI)，酶切后的產(chǎn)物回收并進行連接；具體方法參見實施例1 ;
[0070] (3)以醋酸桿菌XZY003基因組為模板，設(shè)計引物11 (5'-TGCACTGCAGATGGCACGTGT AGCAGGCAAGGTT-3'）和引物 4 (5, ~GCGTCGACTCATTGTGCTGTTGACCTCCCATCCAT~3,)，其中酶切 位點分別為PstI和SalI;將PCR擴增產(chǎn)物進行回收，并與載體pETDuet-Ι分別進行雙酶 切（PstI和SalI)，酶切后的產(chǎn)物回收并進行連接；具體方法參見實施例1 ;
[0071](4)將步驟（1)、⑵和（3)得到的連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化步驟 如下：將10μL連接產(chǎn)物與100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞混合，冰浴30min，42°C熱激 90s，冰浴2min，加入890μLLB培養(yǎng)基，37°C，200rpm，搖床培養(yǎng)lh后，取100μL培養(yǎng)液， 涂布氨芐抗性平板（含1〇〇μg/mL氨芐青霉素鈉）或卡納抗性平板（含50μg/mL卡那霉 素），37°C，過夜培養(yǎng)，挑取陽性轉(zhuǎn)化子進行測序檢測驗證，保存陽性轉(zhuǎn)化子，然后抽提質(zhì)粒， 獲得重組載體pET22b+_accr、pET30b+_accr和pETDuet_accr〇
[0072] (5)將步驟⑷得到的重組載體轉(zhuǎn)化表達宿主BL21 (DE3)pLysS(購自廣州 齊云生物技術(shù)有限公司）中，得到菌株BL21 (DE3)pLysS(pET22b+-accrr)、BL21 (DE3) pLysS(pET30b+_accr)和BL21(DE3)pLysS(pETDuet_accr)。然后參照實施例 3 對上述菌株 進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集菌體并用緩沖液重懸菌體，進行SDS-PAE，發(fā)現(xiàn)AcCR在以上三種重組菌 中均有表達，但均沒有檢測到酶活，將菌體在冰浴中超聲破碎至溶液澄清，收集上清和沉淀 分別進行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)表達的AcCR均在沉淀中，上述三種菌株誘導(dǎo)表達的AcCR是沒有活 性的包涵體，都沒有實現(xiàn)AcCR的可溶性表達。
[0073] 以上結(jié)果說明，本發(fā)明提供的來源于醋酸桿菌XZY003的羰基還原酶AcCR屬于一 種膜蛋白很難實現(xiàn)可溶性表達，外加GST標簽，使其實現(xiàn)了可溶性表達。
[0074] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種羰基還原酶AcCR，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。2. 編碼權(quán)利要求1所述的羰基還原酶AcCR的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ IDNO. 2 所示。3. 權(quán)利要求1所述的羰基還原酶AcCR在制備手性醇及其衍生物中的應(yīng)用。4. 一種含有羰基還原酶AcCR基因的重組載體，其特征在于：是通過將GST標簽、權(quán)利 要求2中所述的核苷酸序列與載體連接得到的。5. -種含有羰基還原酶AcCR基因和葡萄糖脫氫酶⑶Η基因的重組載體，其特征在于： 是通過將GST標簽、權(quán)利要求2中所述的核苷酸序列和編碼葡萄糖脫氫酶GDH的基因的核 苷酸序列與載體連接得到的。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的含有羰基還原酶AcCR基因和葡萄糖脫氫酶GDH基因的重組 載體，其特征在于： 所述的載體為pETDuet-l〇7. 權(quán)利要求5或6所述的含有羰基還原酶AcCR基因和葡萄糖脫氫酶⑶Η基因的重組 載體的制備方法，包含如下步驟： (1)以醋酸桿菌菌株ΧΖΥ003的基因組DNA為模板，根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列 設(shè)計引物，PCR擴增得到羰基還原酶AcCR基因；將擴增產(chǎn)物與載體pGEX-2T連接，得到重組 載體pGEX-accr ; (2)以重組載體pGEX-accr為模板，設(shè)計引物，PCR擴增得到帶有GST標簽的羰基還原 酶AcCR基因，并將其連接到共表達載體pETDuet-Ι上，得到重組表達載體pETDuet-gaccr ; (3) 以枯草芽孢桿菌Bacillussubtilisl68的基因組DNA為模板，設(shè)計引物，PCR擴增 得到葡萄糖脫氫酶⑶Η基因，并將其連接到步驟（2)制得的重組質(zhì)粒載體pETDuet-gaccr 上，得到含有羰基還原酶AcCR基因和葡萄糖脫氫酶⑶Η基因的重組載體。8. -種羰基還原酶AcCR與葡萄糖脫氫酶⑶Η共表達的重組基因工程菌，其特征在于： 是將權(quán)利要求5或6所述的含有羰基還原酶AcCR基因和葡萄糖脫氫酶GDH基因的重組載 體轉(zhuǎn)化到原核表達系統(tǒng)或真核表達系統(tǒng)中得到。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的羰基還原酶AcCR與葡萄糖脫氫酶⑶Η共表達的重組基因工 程菌，其特征在于： 所述的原核表達系統(tǒng)為大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)pLysS。10. 權(quán)利要求8或9所述的羰基還原酶AcCR與葡萄糖脫氫酶⑶Η共表達的重組基因工 程菌在催化不對稱還原潛手性羰基化合物制備手性醇及其衍生物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羰基還原酶AcCR及其編碼基因與應(yīng)用。所述的羰基還原酶AcCR，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。編碼上述羰基還原酶AcCR的基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。該羰基還原酶AcCR來源于醋酸桿菌XZY003，可催化13種羰基化合物生成相應(yīng)的單一對映體的手性醇。所述的羰基還原酶AcCR與葡萄糖脫氫酶GDH共表達于原核表達系統(tǒng)或真核表達系統(tǒng)中既實現(xiàn)了利用羰基還原酶進行生物催化轉(zhuǎn)化的生物反應(yīng)過程，又實現(xiàn)了輔酶的原位再生，極大地降低了生產(chǎn)成本，且得到產(chǎn)物的光學純度高，反應(yīng)過程高效，且條件溫和。
【IPC分類】C12P13/00, C12R1/19, C12N15/70, C12N15/65, C12P7/22, C12P9/00, C12N9/04, C12N1/21, C12P7/62, C12N15/53
【公開號】CN105349503
【申請?zhí)枴緾N201510864290
【發(fā)明人】婁文勇, 魏萍, 宗敏華
【申請人】華南理工大學
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年11月30日