3] 一種羰基還原酶AcCR與葡萄糖脫氫酶⑶Η共表達(dá)的重組基因工程菌，是將上述含 有羰基還原酶AcCR基因和葡萄糖脫氫酶GDH基因的重組載體轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)系統(tǒng)或真核 表達(dá)系統(tǒng)中得到；
[0034] 所述的原核表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)選為大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)pLysS;
[0035] 上述羰基還原酶AcCR與葡萄糖脫氫酶⑶Η共表達(dá)的重組基因工程菌在催化不對(duì) 稱還原潛手性羰基化合物制備手性醇及其衍生物中的應(yīng)用；
[0036] 一種微生物細(xì)胞催化劑，包含上述羰基還原酶AcCR與葡萄糖脫氫酶⑶Η共表達(dá)的 重組基因工程菌；
[0037] 所述的微生物細(xì)胞催化劑的制備方法，包含如下步驟：
[0038] 將上述羰基還原酶AcCR與葡萄糖脫氫酶⑶Η共表達(dá)的重組基因工程菌培養(yǎng)至 0D_= 1. 0~1. 2,然后在20~22°C的條件下，加入終濃度為0· 4~0· 5mmol/L的IPTG進(jìn) 行誘導(dǎo)15~18h后，離心收集菌體，得到微生物細(xì)胞催化劑；
[0039] 所述的微生物細(xì)胞催化劑可以用于催化羰基化合物生成相應(yīng)的單一對(duì)映體的手 性醇；
[0040] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0041](1)本發(fā)明提供了一種來(lái)源于醋酸桿菌XZY003的羰基還原酶AcCR，該羰基還原酶 為膜蛋白，可催化13種羰基化合物生成相應(yīng)的單一對(duì)映體的手性醇。
[0042] (2)本發(fā)明針對(duì)于目前微生物細(xì)胞催化羰基化合物生成相應(yīng)的單一對(duì)映體的手 性醇存在的問(wèn)題，采用來(lái)源于醋酸桿菌XZY003的羰基還原酶AcCR與葡萄糖脫氫酶GDH共 表達(dá)的方式，制備微生物細(xì)胞催化劑，既實(shí)現(xiàn)了利用羰基還原酶進(jìn)行生物催化轉(zhuǎn)化的生物 反應(yīng)過(guò)程，又實(shí)現(xiàn)了輔酶的原位再生，該方法采用全細(xì)胞催化，具有高效的輔酶再生循環(huán)系 統(tǒng)，從而提高重組的基因工程菌的催化效率，不需要添加昂貴的輔酶，極大地降低了生產(chǎn)成 本，且得到產(chǎn)物的光學(xué)純度高，反應(yīng)過(guò)程高效，且條件溫和。
【附圖說(shuō)明】
[0043] 圖1是重組共表達(dá)載體pETDuet-gaccr-gdh的構(gòu)建過(guò)程圖。
[0044] 圖2是重組大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS(pETDuet-gaccr-gdh)催化羰基化合物不對(duì) 稱還原反應(yīng)的過(guò)程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0046] 醋酸桿菌菌株XZYO〇3(Acetobactersp.XZYO〇3,保藏號(hào)：CCTCCΜ2〇9〇61) 已在中國(guó)專利"醋酸桿菌及應(yīng)用其生產(chǎn)對(duì)映體純（R)_有機(jī)硅醇的方法"（【申請(qǐng)?zhí)枴?200910146261. 3)中公開(kāi)；
[0047] 培養(yǎng)該菌株的培養(yǎng)基為葡萄糖8. 3g/L，果糖2. 5g/L，大豆蛋白胨83. 9g/L，初 始ρΗ5·7〇 具體見(jiàn)參考文南犬（Optimizationofcultureconditionstoproducehigh yieldsofactiveAcetobacterspCCTCCM209061cellsforanti-Prelogreduction ofprochiralketones)
[0048] 實(shí)施例1羰基還原酶AcCR基因accr的獲得
[0049] 醋酸桿菌XZY003在溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為lOOrpm的條件下震蕩培養(yǎng)24h;然后菌體 離心（4°C，9000rpm) 5min，收集菌體，用質(zhì)量百分比為0. 85 %的生理鹽水洗滌3次，以除掉 殘留的培養(yǎng)基，然后用上海捷瑞生物工程有限公司的細(xì)菌基因組提取試劑盒提取醋酸桿菌 XZY003的基因組DNA，具體方法參見(jiàn)試劑盒提供的方法。以提取的醋酸桿菌XZY003的基因 組DNA為模板，設(shè)計(jì)引物 1 (5' ~TCCCCCGGGAATGGCACGTGTAGCAGGCAAGGTT~3,)和引物 2 (5'-CC GGAATTCCTCATTGTGCTGTTGACCTCCCATCCAT~3,)為擴(kuò)增上下游引物，其中酶切位點(diǎn)分別為Ava I和EcoRI(下劃線）；PCR擴(kuò)增得到目的片段羰基還原酶AcCR基因accr。其中，PCR擴(kuò)增 所用的酶試劑盒為東洋紡的K0D酶；PCR反應(yīng)體系（25yL)為：K0DFXbuffer12. 5yL; 2禮（1犯135 41^引物10.75 41^引物 20.75 41^模板0嫩141^(1(1!120 5 41^丨0?反應(yīng)條件 為：941€2111丨11;98°(：158,60 1€308,681€408,30個(gè)循環(huán)；681€7111丨11 ;將？〇?擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回 收（采用上海捷瑞生物工程有限公司的膠回收試劑盒）并測(cè)序分析，得到一段長(zhǎng)度為762bp 的序列見(jiàn)SEQIDNO. 2,為羰基還原酶AcCR基因accr，該序列編碼253個(gè)氨基酸，見(jiàn)SEQID Ν0· 1〇
[0050] 實(shí)施例2葡萄糖脫氫酶基因gdh的獲得
[0051] 葡萄糖脫氫酶的基因來(lái)源于枯草芽孢桿菌Bacillussubtilisl68(購(gòu)自廣東微生 物菌種保藏中心），培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件按菌種保藏中心提供的方法，枯草芽孢桿菌基因 組DNA的提取按上海捷瑞生物工程有限公司的細(xì)菌基因組提取試劑盒提取。以枯草芽孢桿 菌Bacillussubtilisl68 的基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)引物 5 (5'-GAAGATCTCATGTATCCGGATT TAAAAGGAAAAGTCGTCG-3'）和引物 6 (5, -CCGCTCGAGTTAACCGCGGCCTGCCTGGAAT-3,)分別為上 下游引物，其中，酶切位點(diǎn)分別為BglII，Xho1(下劃線）；PCR擴(kuò)增得到目的片段葡萄糖 脫氫酶⑶Η基因gdh。PCR反應(yīng)體系（25μL)為：KODFXbuffer12. 5μL;2mMdNTP5μL; 引物 50. 75μL;引物 60. 75μL;模板DNA1μL;ddH20 5μL;PCR反應(yīng)條件為：94°C2min; 98°(：158,601€308,681€408,30個(gè)循環(huán) ；681€71^11;將？〇?的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收（采用上海 捷瑞生物工程有限公司的膠回收試劑盒），進(jìn)行測(cè)序分析，得到一段長(zhǎng)度為786bp的序列， 為葡萄糖脫氫酶⑶Η基因gdh。
[0052] 實(shí)施例3重組載體pGEX-accr的構(gòu)建
[0053] (1)將實(shí)施例1中得到的羰基還原酶AcCR基因accr片段（回收產(chǎn)物）和質(zhì)粒 PGEX-2T(購(gòu)自廣州齊云生物技術(shù)有限公司）分別進(jìn)行雙酶切；其中，基因片段酶切體系體 系（30μυ為：ddH20 15yL;buffer3yL;基因片段 10yL;AvaI+EcoR I各lyL;質(zhì)粒 PGEX-2T酶切體系（20μL)為：ddH20 6 ~14μL;buffer2μL;載體2~10μL;AvaI+EcoR I各1μL;酶切條件為：37°C酶切30min;
[0054] (2)將步驟（1)酶切后的產(chǎn)物分別進(jìn)行回收，回收方法及步驟參見(jiàn)上海捷瑞生物 工程有限公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒。將回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接體系（20μL)為：載體 5yL;基因片段 10yL;10XT4buffer2yL;T4DNAligaselyL;ddH20 2yL;連接條件 為：22°C連接 30min;
[0055](3)將步驟⑵得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化步驟如下：將10 μL連 接產(chǎn)物與100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30min，42°C熱激90s，冰浴2min，加 入890μLLB培養(yǎng)基，37°C，200rpm，搖床培養(yǎng)lh后，取100μL培養(yǎng)液，涂布氨芐抗性平板 (含100 μg/mL氨芐青霉素鈉），37°C，過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)驗(yàn)證，保存 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，然后抽提質(zhì)粒，獲得重組載體pGEX-accr。
[0056] (4)將步驟（3)得到的重組載體轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主BL21 (DE3)pLysS(購(gòu)自廣州齊云生 物技術(shù)有限公司）中，得到菌株BL21 (DE3)pLysS(pGEX-accr)，然后液體培養(yǎng)該菌株0D_ = 1. 2,在20°C的條件下，加入終濃度為0. 4mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)15~18h，然后收集菌體， 進(jìn)行SDS-PAGE確定重組AcCR成功表達(dá)，測(cè)定酶活為304. 9U/g-dw，獲得可溶性表達(dá)的羰基 還原酶AcCR。
[0057] 實(shí)施例 4 重組大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS(pETDuet-gaccr_gdh)的構(gòu)建
[0058] 以實(shí)施例3中得到的重組質(zhì)粒pGEX-accr為模板，設(shè)計(jì)引物3 (5'-TGCACTGCAGATGT CCCCTATACTAGGTTATTGGG-3'）和引物 4 (5, ~GCGTCGACTCATTGTGCTGTTGACCTCCCATCCAT~3,)， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到帶有GST標(biāo)簽基因的羰基還原酶AcCR基因gaccr，其中，PCR反應(yīng)體 系和條件參見(jiàn)實(shí)施例1 ;將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與共表達(dá)質(zhì)粒PETDuet-Ι(購(gòu)自上海捷瑞生 物技術(shù)有限公司）分別進(jìn)行雙酶切，所用酶為Fermentas的快切酶FastDigest FastDigest⑧Stf/I，所用的酶切體系和條件參見(jiàn)實(shí)施例3 ;將酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物 進(jìn)行連接，連接體系和條件參見(jiàn)實(shí)施例3 ;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，轉(zhuǎn)化步驟如下： 將10μL連接產(chǎn)物與100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30min，42°C熱激90s， 冰浴2min，加入890μLLB培養(yǎng)基，37°C，200rpm，搖床培養(yǎng)lh后，取100μL培養(yǎng)液，涂布氨 芐抗性平板（含100μg/mL氨芐青霉素鈉），37°C，過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn) 證，保存陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，然后抽提質(zhì)粒，獲得重組