(r)-羰基還原酶在近平滑假絲酵母中原位表達(dá)重組菌及用其高效制備(r)-苯基乙二醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 利用設(shè)計(jì)的近平滑假絲酵母的表達(dá)質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)（功-羰基還原酶的表達(dá)，高效制備 (功-苯基乙二醇的方法，本發(fā)明涉及基因工程手段構(gòu)建（功-羰基還原酶在近平滑假絲酵 母中的原位表達(dá)重組菌，及用其高效制備（功-苯基乙二醇的方法，屬于生物催化不對(duì)稱轉(zhuǎn) 化技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性醇是合成許多高價(jià)值手性化合物的前體物質(zhì)，在制藥工業(yè)、精細(xì)化工產(chǎn)業(yè)和 信息工業(yè)中均應(yīng)用廣泛。光學(xué)純（功-苯基乙二醇不僅是液晶材料中不可缺少的重要手性 添加劑，而且已成為制備具有光學(xué)活性的醫(yī)藥、農(nóng)藥和功能材料的重要中間體，開(kāi)展制備高 光學(xué)純度的（功-苯基乙二醇的研宄極有意義。
[0003]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備（功-苯基乙二醇的原位表達(dá)重組菌，其分類命名為近平滑假 絲酵母菌/(功-羰基還原酶pCP-rcr，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保 藏中心，保藏編號(hào)：CCTCC NO :M2015106。
2. 利用權(quán)利要求1所述的原位表達(dá)重組菌不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備（功-苯基乙二醇的方法， 其特征是將U)-羰基還原酶在近平滑假絲酵母中原位表達(dá)后，利用培養(yǎng)后的重組菌株 pCP-rcr，以2-羥基苯乙酮為底物，催化不對(duì)稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)：在2 mL 0.1 mol/L pH 6. 5的磷酸緩沖液中，加入重組細(xì)胞濃度0.1 g/mL，2-羥基苯乙酮底物濃度 為6 g/L，反應(yīng)溫度30°C，反應(yīng)時(shí)間13 h。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是重組菌株pCP-rcr的 培養(yǎng) 生長(zhǎng)培養(yǎng)基YPD以g/L計(jì)：胰蛋白胨20,酵母提取物10,葡萄糖20,以去離子水配制； 固體培養(yǎng)基添加15g/L瓊脂粉； 發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)：酵母提取物5,葡萄糖40,（NH4)2HPO4 13, KH2PO4 7, ZnSO4 · 7H20 0· 3, NaCl 0· 1，ρΗ7· 0,以去離子水配制； 培養(yǎng)條件：挑取重組菌株pCP-rcr的單菌落接種于5 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，于30°C、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h;取I mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50 mL發(fā)酵培養(yǎng) 基中，于30°C、200 r/min振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)48 h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是重組菌株pCP-rcr的 構(gòu)建： 將目的基因 rcr插入近平滑假絲酵母原位表達(dá)質(zhì)粒pCP中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCP- rcr，重 組質(zhì)粒pCP-rc/^化近平滑假絲酵母感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)含有40 μ g/mL諾爾斯菌素的YPD 平板篩選目的重組菌株C pCP-rcr。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是重組質(zhì)粒pCP- rcr的構(gòu)建： 目的基因 rcr及表達(dá)質(zhì)粒pCP分別用I酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析并 過(guò)柱純化，純化后的酶切產(chǎn)物rcr及表達(dá)質(zhì)粒pCP采用連接酶進(jìn)行連接，于16°C培養(yǎng)箱中連 接12-16 h ;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化凡cWi JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布到含有100 μ g/mL氨芐青霉 素的LB平板上，LB平板：蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10 g/L和瓊脂20 g/L ;37°C 倒置培養(yǎng)過(guò)夜； 挑取4個(gè)克隆，轉(zhuǎn)接入裝有5 mL的含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中， LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L和NaCl 10 g/L ;37°C培養(yǎng)12 h，利用北京博 大泰克生物基因技術(shù)有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit提 取質(zhì)粒；重組質(zhì)粒采用酶切方法進(jìn)行驗(yàn)證：10XQuickCut Buffer 2 yL，質(zhì)粒DNA 5 yL, fee I 0· 5 μ L，J/7/7 I 0· 5 μ L，ddH20 將體系補(bǔ)足 20 μ L，獲得陽(yáng)性質(zhì)粒 pCP-rcr。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是rcr基因的獲得 以近平滑假絲酵母基因組rcr為PCR反應(yīng)模板，利用含有5^席卩幻7/7/β艮制性酶切位 點(diǎn)的引物RCR_1和RCR_2 : RCR_1 :5' -ctacaactat tccgcgggag ctcatgtcaa ttccatca-3'，劃線為 I， RCR_2 :5' -cactcggtac cctagtggtg gtggtggtgg tgtggattaa aa_3'，劃線為命/? I， PCR 反應(yīng)體系：CldH2O 33.5 yL，DNA 聚合酶 0.5 yL，RCR_l I yL，RCR_2 I yL， 5. buffer 10 μ L, dNTP 4 yL ； PCR 條件為：98°C 熱變性 10 s;98°C 10 s，52°C 15 s，72°C 70s; 經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)后，最后72°C再延伸10 min，獲得rcr基因，rcr基因全長(zhǎng)為1011 bp。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是原位表達(dá)質(zhì)粒pCP的構(gòu)建： 質(zhì)粒PCP是由pUC57為起始模板構(gòu)建而來(lái)，包含以下幾個(gè)元件：?jiǎn)?dòng)子基因姻Z辦 和JCT7/7,終止子基因和邵同時(shí)作為下游同源臂，以及表達(dá)盒上游同源臂基因 W3p和抗性基因說(shuō)71 ; 質(zhì)粒PCP構(gòu)建引物設(shè)計(jì)： URA3p_l: 5' -ccggaattcg tattgcaaac aaacg-3'，劃線為 I， URA3p_2: 5' -cgcatccatt cagatcttgt atgaagacgg ca_3'，劃線為兔1·/ II， MAL2p_l: 5' -gtcttcatac aagatctgaa tggatgcggg-3'，劃線為兔1·/ II， MAL2p_2: 5' -attgacatga gctcccgcgg aatagttgta gta-3?, Sac I, ACTlt_l: 5' -caccactagg gtaccgagtg aaattct-3'，劃線為命/? I， ACTlt_2: 5' -gtcttcctgc agattttatg atggaat-3'，劃線為 I， ACTlp_l: 5? -aaaatctgca ggaagaccgt ccaac-3'，劃線為I， ACTlp_2: 5' -tttaagctta tctgcggccg caccgttatc gataactaaa_3'，劃線為 Abi I， SAT1_1: 5' -cgataacggt gcggccgcat gaaaatttcg gtga-3'，劃線為 Abi I， SAT1_2: 5' -gattaaatat tcggatcctt aggcgtcatc ct_3'，劃線為 ifeMl I， URA3t_l: 5' -gatgacgcct aaggatccga atatttaatc at-3'，劃線為 ifeMl I， URA3t_2: 5' -atcccaagct taacgatcaa gagaaa-3'，劃線為 III， 表達(dá)質(zhì)粒pCP全長(zhǎng)4. 5 Kb，采用重疊延伸和酶切連接的方法構(gòu)建： 將序列經(jīng)TA克隆，連接到載體pMD19-T上，得到T- 質(zhì)粒；使用引物SAT1_1 和URA3t_2，以和araJi片段為模板，經(jīng)過(guò)重疊延伸PCR擴(kuò)增得到 將質(zhì)粒及片段分別用限制性內(nèi)切酶Abi I和//ifld III進(jìn)行雙酶 切，經(jīng)膠回收后，將51<3(7-?/'<315^片段連接到1'- <3<^7/7質(zhì)粒上，得到1'-4511質(zhì)粒； 將T-ASU質(zhì)粒及pUC57質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶/?? I和"ial III進(jìn)行雙酶切，經(jīng)膠回 收后，將片段連接到pUC57質(zhì)粒上，得到pUC57_ASU質(zhì)粒； 使用引物URA3p_l和MAL2p_2,以和片段為模板，經(jīng)過(guò)重疊延伸PCR擴(kuò)增 '得級(jí) ura3p_mal2p\ 將辦片段及pUC57-ASU質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶feoR I和5^1進(jìn)行雙酶 切，經(jīng)膠回收后，將辦片段連接到pUC57-ASU質(zhì)粒上，得到pUC57-UMASU質(zhì)粒； 將片段及pUC57-UMASU質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶命/? I和I進(jìn)行雙酶切， 經(jīng)膠回收后，將片段連接到pUC57-UMASU質(zhì)粒上，得到表達(dá)質(zhì)粒pCP。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是用于獲取基因 rcr所需要提取基因組的菌種 為近平滑假絲酵母（C paraAsiAxsis) CCTCC NO :M203011。
【專利摘要】(R)-羰基還原酶在近平滑假絲酵母中原位表達(dá)重組菌及用其高效制備(R)-苯基乙二醇的方法，屬于生物催化不對(duì)稱轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一株近平滑假絲酵母重組菌Candida parapsilosis pCP-rcr，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO：M2015106；本發(fā)明構(gòu)建了外源蛋白在近平滑假絲酵母中的表達(dá)質(zhì)粒pCP，將(R)-羰基還原酶克隆到該質(zhì)粒中，獲得重組質(zhì)粒pCP-rcr，電擊轉(zhuǎn)化入近平滑假絲酵母獲得重組菌株Candida parapsilosis pCP-rcr。該重組菌催化2-羥基苯乙酮，通過(guò)優(yōu)化生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件，產(chǎn)物(R)-苯基乙二醇光學(xué)純度達(dá)到99.9%，產(chǎn)率為99.6%，生物轉(zhuǎn)化的時(shí)間由48 h縮短到13 h，為高效、低成本制備(R)-苯基乙二醇提供了有效途徑。CCTCC NO：M 201510620150312
【IPC分類】C12N9-04, C12R1-72, C12N1-19, C12P7-22, C12N15-53, C12N15-81
【公開(kāi)號(hào)】CN104830704
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510206914
【發(fā)明人】張榮珍, 徐巖
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年4月28日