eck優(yōu)越型試紙（Roche)每天檢查血清血糖。 在5周高血糖后，采用甲苯噻嗪和氯胺酮對兔子進(jìn)行麻醉。采用消毒的、一次性6-_鉆取 活組織切刀（punch biopsies)制造5個(gè)傷口（一只耳朵上三個(gè)傷口，另一只耳朵上兩個(gè)傷 口）。每個(gè)傷口按以下五個(gè)隨機(jī)處理組中的一個(gè)進(jìn)行處理：
[0190] 1不處理
[0191] 2 僅 E.xceilagcn?支架（25 μ 1);
[0192] 3 Excelltigcn?，及ΙχΙΟ6個(gè)野生型MSC(來自重懸在中的細(xì)胞小球 (pellet)的 25 μ 1 溶液）
[0193] 4 ExceUagen?，及 ?χ?〇6個(gè) SDC2 陽性（"SDC2+"）型 MSC(來自重懸在 Excellagen? 中的細(xì)胞小球的25 μ 1溶液）及
[0194] 5 Exeenagen?:，及 ?χ?〇6個(gè) SDC2 陰性（"SDC2-"）型 MSC(來自重懸在 Excellagcn.1? 中的細(xì)胞小球的25 μ 1溶液）。
[0195] 在進(jìn)行處理后，用聚氨酯敷料（OpSite ;Smith&Nephew)覆蓋傷口，縫合耳朵，并用 粘合性敷料（Operfix ;Promedicare, Clonee, Ireland)覆蓋，直到第7天。為了進(jìn)行無偏見 的評價(jià)，該研究處理是隨機(jī)的和盲的。7天后，通過靜脈內(nèi)注射戊巴比妥鈉（2mL)處死兔子。
[0196] 結(jié)果分析
[0197] 處理一周后，不同處理組的傷口愈合情況呈現(xiàn)顯著差異。在兔子處死當(dāng)天對每個(gè) 傷口進(jìn)行跟蹤。在處死當(dāng)天制造一個(gè)新傷口，計(jì)算1周期間傷口面積減少百分比。
[0198] 傷口閉合百分比評價(jià)
[0199] 在處死當(dāng)天，每個(gè)傷口跟蹤檢查6次。采用Cell B軟件（Olympus)測定每個(gè)圖像 的面積，計(jì)算平均面積。計(jì)算每個(gè)處理組1周期間傷口面積減少百分比。
[0200] 傷口閉合百分比
[0201] 傷口閉合百分比分析表明，與未處理傷口相比，:Ex_eel.lagen雜加速了傷口愈合速 度。采用ExcclIagcnS支架中的1〇〇萬個(gè)SDC2+細(xì)胞處理傷口，結(jié)果表明，與未處理組相比， 在1周時(shí)出現(xiàn)最高、最顯著的傷口閉合百分比。當(dāng)與SDC2+細(xì)胞混合時(shí)，Excellagen?的傷 口閉合效果顯著增強(qiáng)。
[0202] 所有傷口部分均進(jìn)行進(jìn)一步處理，用于組織學(xué)分析和體視學(xué)分析。
[0203] 組織學(xué)分析
[0204] 沿中線切開傷口，并在10 %福爾馬林中固定24小時(shí)。采用組織處理器（ASP300 ; Meyer Instruments, Houston, TX)處理組織，并包埋在石錯(cuò)中。采用標(biāo)準(zhǔn)方案，用蘇木精、曙 紅和馬松三色對切片（5mm)進(jìn)行染色。
[0205] 從組織染色可以觀察到，Excellagen?處理的傷口愈合情況良好，在傷口部位形成 了新的組織。SDC2+細(xì)胞和Excclhigc:r^itii合處理顯示出最有效的傷口愈合?；旌蟂DC2+細(xì) 胞增強(qiáng)了 ExcdlagetiK的愈合潛力。與未處理組相比，SDC2+處理的傷口在傷口部位形成了 新的組織，在傷口床底部形成了膠原。
[0206] 經(jīng)SDC2+細(xì)胞處理的傷口的傷口床中的新生血管
[0207] 眾所周知，除改善皮膚傷口愈合之外，MSC還可促進(jìn)血管形成。在采用SDC2+細(xì)胞 處理的傷口中也觀察到類似的作用。在這些傷口中，可以觀察到在傷口床內(nèi)形成了新的血 管。因此，在SDC2+處理的傷口中觀察到顯著的傷口愈合，傷口閉合百分比增加，這可能與 更有效的新生血管形成有關(guān)。
[0208] 總結(jié)
[0209] MSC混合Excellagen?保持了良好的代謝活性，反映出Excellagen?·基質(zhì)對細(xì)胞活 力沒有不良影響。細(xì)胞在整個(gè)Excdlagen_、g_某質(zhì)h密集存在，適當(dāng)分布，沒有形成任何細(xì) 胞塊。在目前的研究中，與單獨(dú)采川Exceilagea?處理的對照相比，采用SDC2+細(xì)胞混合 Bxe紐ag_i)處理傷口時(shí)，傷口閉合百分比增加。SDC2+細(xì)胞顯著增強(qiáng)了Bxcgllag_鬚的傷口 愈合潛力。據(jù)報(bào)道，MSC還可以促進(jìn)血管形成。在目前的研究中，在SDC2+細(xì)胞處理組的傷 口床中觀察到血管形成增加。因此，SDC2+處理傷口提高了傷口閉合百分比，形成了更突出 (prominent)的新生血管，顯示出顯著的傷口愈合益處。因此，基質(zhì)中本發(fā)明的SDC2+細(xì)胞 改善了傷口愈合潛力，縮短了愈合時(shí)間。
[0210] 實(shí)例8 -癌癥細(xì)朐訐務(wù)
[0211] 細(xì)胞迀移是體外細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)研究的關(guān)鍵參數(shù)。必須對細(xì)胞群在不同條件下的動 態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測。采用基于阻抗的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀（RTCA, xCELLigence, Roche)，我們可以 對下述特性進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測：增殖、迀移和細(xì)胞粘附。這些特性均涉及癌癥演變。我們采用這 種方法來確定癌細(xì)胞向條件培養(yǎng)基迀移的能力。這種模型被作為癌癥治療效果的預(yù)測一一 模型內(nèi)迀移減少表明具有抗癌特性。
[0212] 在我們的研究中，采用16-孔CIM板，利用前面提到的xCELLigence裝置實(shí)時(shí)讀 數(shù)，確定細(xì)胞迀移。為了開展這些研究，采用來自乳癌（MDA-MB-231、MDA-MB-486、MCF-10A)、 前列腺癌（DU145)、胰腺癌（SU-86-86)和結(jié)腸癌（HCT116)的各種癌細(xì)胞系。
[0213] 結(jié)果總結(jié)在表1中：
[0214] 表1 :癌細(xì)朐訐務(wù)
[0216] 圖例：
[0217] 丨=與條件培養(yǎng)基相比，迀移增加；
[0218] I =與條件培養(yǎng)基相比，細(xì)胞迀移減少；
[0219] _=與條件培養(yǎng)基相比無變化。
[0220] 乳癌細(xì)朐系
[0221] ?重組 SDC2 (500ng/ml rSDC2 (η = 5)和 100ng/ml (η = 2))抑制 MDA-MB-231 細(xì)胞 的迀移。采用Ad. SDC2(3ul)-CM(η = 3)時(shí)，也得到類似的迀移結(jié)果。
[0222] · MDA-MB-486 細(xì)胞朝 Ad. SDC2-CM(3ul ;n = 1)的迀移減少。
[0223] · Ad. SDC2 (3ul)未改變 MCF-10A 細(xì)胞（η = 1)的迀移。
[0224] 前列腺癌細(xì)朐系
[0225] ?與僅采用條件培養(yǎng)基相比，向無血清MSC-CM中加入500ng/ml rSDC2,在一個(gè)實(shí) 驗(yàn)中，降低了 DU145細(xì)胞的迀移，在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，未發(fā)生任何變化。Ad. SDC2(3ul)降低了 DU145細(xì)胞（η = 1)的迀移。這些結(jié)果表明，SDC2的EC域抑制了這種前列腺癌細(xì)胞系的迀 移。
[0226] 腠腺癌細(xì)朐系
[0227] · SU-86-86細(xì)胞的迀移能力發(fā)生變化；在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，朝rSDC2-CM(100ng/ml、 500ng/ml 和 1000ng/ml ;n = 1)的迀移增加，另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，朝 rSDC2-CM(100ng/ml、500ng/ ml和1000ng/ml ;n = 1)的迀移降低。
[0228] 結(jié)腸癌細(xì)朐系
[0229] · HCT116細(xì)胞在測試的所有濃度（100-1000ng/ml)均表現(xiàn)出朝rSDC2-CM的迀移 降低。
[0230] 結(jié)論
[0231] 總體來說，這些結(jié)果表明了不同癌細(xì)胞朝培養(yǎng)基中SDC2的行為發(fā)生變化。一般說 來，SDC2降低癌癥的迀移能力，表明在模型中具有抗癌效果，特別是MDA-MB-231細(xì)胞（乳 癌）。
[0232] 在初步測試中，SDC2抗體表現(xiàn)出類似的乳癌迀移抑制能力，表明具有抗癌活性，初 步試驗(yàn)還需要通過此領(lǐng)域的后續(xù)擴(kuò)大工作項(xiàng)目進(jìn)行證實(shí)。
[0233] 實(shí)例9 -免痔抑制
[0234] 采用實(shí)例8中使用的rSDC2,我們研究了 SDC2在免疫抑制模型中的活性。我們發(fā) 現(xiàn)，SDC2蛋白抑制了 TNFa和IL1 β引起的NFkB活化。這表明了 SDC2蛋白本身具有免疫 抑制活性。
[0235] 將kB熒光素酶質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的A549細(xì)胞用SDC2重組蛋白預(yù)處理1小時(shí)。向培 養(yǎng)基中加入10ng/mL TNF-a /IL-1 β，24小時(shí)后開展熒光素酶試驗(yàn)。結(jié)果見圖5。*林=相 對0ng/mL S2,ρ〈0·0001。
[0236] 將Α549細(xì)胞用kB熒光素酶質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)，并用重組SDC2處理24小時(shí)。結(jié)果見圖 6。在上圖面中：向培養(yǎng)基中加入細(xì)胞因子，24小時(shí)后開展焚光素酶分析。在下圖面中：在加 入細(xì)胞因子處理24小時(shí)之前，更換培養(yǎng)基。* = p〈0. 01，相對0ng/mL S2 ;*** = p〈0. 0001， 相對 〇ng/mL S2 汁++ = ρ〈0· 0001，相對 100ng/mL S2。
[0237] 將A549kBL細(xì)胞采用1 μ L/mL或3 μ L/mL Ad. Null或Ad. SDC2轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在開展熒 光素酶試驗(yàn)之前用細(xì)胞因子處理24小時(shí)。結(jié)果見圖7。*** = p〈0. 001，相對0ng/mL S2。
[0238] 這些結(jié)果表明了 SDC2蛋白的免疫抑制效果。
[0239] 實(shí)例 10-SDC2 的 d53 調(diào)節(jié)
[0240] 為了確定p53在SDC2蛋白信號傳導(dǎo)中的作用，我們利用p53激動劑（nutlin_3a) 在藥理學(xué)上擾亂MSC內(nèi)的p53通路，以幫助描述SDC2響應(yīng)。Nutlin-3a誘導(dǎo)明顯的p53響 應(yīng)并抑制生長。
[0241] 方法
[0242] 細(xì)胞培養(yǎng)和處理
[0243] 將MSC按每孔105個(gè)細(xì)胞的密度平板接種于6-孔板（Nunc)上的完全培養(yǎng)基 (a-MEM，10%FBS)內(nèi)，讓其粘附過夜。然后，將培養(yǎng)基換為含Nutlin-3a或含DMS0作為載 體對照的無血清培養(yǎng)基。誘導(dǎo)24小時(shí)后，收獲細(xì)胞用于RNA和蛋白操作，收集無血清上清 液開展ELISA檢測。
[0244] 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)
[0245] 利用商業(yè)上可獲取的ELISA試驗(yàn)（⑶SABI0)測定從hMSC收集的上清液中人多配 體蛋白聚糖-2的水平。按照生產(chǎn)商的說明開展試驗(yàn)。利用SDC2的純化標(biāo)準(zhǔn)品制作校正曲 線。按照生產(chǎn)商的說明，通過S形邏輯回歸法完成曲線擬合。
[0246] 結(jié)果
[0247] MSC的Nutlin_3a處理導(dǎo)致SDC2脫落出現(xiàn)劑量依賴件增加
[0248] 采用恥七1丨11-33(5、10、2011]\1)或0150載體對照（5、2011]\1)處理24小時(shí)后，收集15〇 上清液，在1500rpm離心分離5分鐘，開展SDC2 ELISA試驗(yàn)，包括采用無條件無血清培養(yǎng)基 作為附加對照。
[0249] 圖8表明，MSC的Nut 1 in_3a處理導(dǎo)致SDC2脫落存在劑量依賴性增加。采用 Nutlin-3a或DMS0作為載體對照在無血清培養(yǎng)基中處理MSC 24小時(shí)。收集無血清上清液， 采用商業(yè)可提供的SDC2 ELISA試劑盒檢測上清液中存在的脫落SDC2。與DMS0對照相比， Nutlin-3a處理的細(xì)胞表現(xiàn)出SDC2脫落增加。
[0250] 圖8是三個(gè)不同人MSC供體的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。脫落SDC2的量從20 μ M DMS0 對照的250pg/ml上升到Nutlin-3a 20 μΜ劑量的平均差不多1000pg/ml。
[0251] 因此，該實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)p53活性的化合物（Nutilin_3a)也增加了 SDC2脫落。
[0252] 實(shí)例 11
[0253] 化療增加人MSC的SDC2脫落
[0254] 我們測試了不同化療抑制劑，特別是紫杉酚、喜樹堿、依托泊苷和BPDE(苯并（a) 芘二醇環(huán)氧化物）對人MSC SDC2脫落的影響。
[0255] 在血清饑餓法處理24小時(shí)之前，采用化療處理MSC 24小時(shí)。收獲細(xì)胞上清液，采 用ELISA分析脫落SDC2蛋白表達(dá)的相對倍數(shù)變化。
[0256] 圖9表明了這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，表明化療增強(qiáng)了人MSC的SDC2脫落。
[0257] 實(shí)例 12
[0258] 鑒別負(fù)責(zé)NF-0調(diào)節(jié)的SDC-2域
[0259] 為了確定負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)NF_kB信號傳導(dǎo)的是SDC-2的哪個(gè)片段或域，我們采用山基 序控制的熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)。我們采用空載體對照腺病毒（p3xFLAG-CMV-14)或表達(dá) SDC2的12個(gè)片段（1. 4至12. 4)的載體，對這些細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，確定它們對NF-kB轉(zhuǎn)錄活性 的影響。
[0260] 圖10表明，SDC-2C-端刪除片段（1-6)的過度表達(dá)降低了響應(yīng)IL-1 β或TNF- α 的NF-kB活性。采用空載體（p3xFLAG-CMV-14)或表達(dá)片段1. 4-12. 4的載體對NF-KB-熒光 素酶表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24小時(shí)后，采用細(xì)胞因子IL-Ιβ (10ng/ml)、TNF-a (l〇ng/ml)處 理細(xì)胞24小時(shí)，然后，開展熒光素酶試驗(yàn)。
[0261] 這些片段在圖10中以數(shù)字1至12表示。這些片段對應(yīng)下述SDC-2肽片段：1，1-79 ; 2,1-87 ;3,卜100 ;4,1-144 ;5,1-169 ;6,卜201 ;7,19-79 ;8,19-87 ;9,19-100 ;10,19-144 ; 11，19-169 ;12,19-201。
[0262] 促炎性細(xì)胞因子，如TNF- a