N0:3 的氨基酸 19-201
[0116] (成熟蛋白）
[0117] 現(xiàn)在，將對照附圖，在下述實例中描述本發(fā)明，其中：
[0118] 圖1表明了用ELISA檢測Ad. SDC2表達MSC的上清液中脫落SDC2的情況；
[0119] 圖2表明Ad. SDC2過度表達導致SDC2蛋白過度表達，所述過度表達在72小時期 間增加；
[0120] 圖3表明，與親代MSC相比，Ad.SDC2MSC( "S2"）的免疫抑制活性明顯提高；
[0121] 圖4表明了含SDC2的細胞培養(yǎng)上清液（"S2"）對T細胞增殖的影響的分析；
[0122] 圖5表明了 SDC2蛋白抑制了 TNF α和IL1 β對NFkB的活化；
[0123] 圖6表明了響應(yīng)重組SDC2及TNF α和IL1 β引起的活化得到的NFkB誘導；
[0124] 圖7表明了響應(yīng)TNF α和IL1 β活化后SDC2過度表達的NFkB誘導；
[0125] 圖8表明了 MSC的nutlin-3a處理導致SDC2脫落劑量依賴性增加。
[0126] 圖9表明了化療增強了 SDC2從人MSC上的脫落；
[0127] 圖10表明SDC-2C-末端刪除片段（1-6)的過度表達降低了 NF_kB響應(yīng)IL-1 β和 TNF-α的活性；及
[0128] 圖11表明了 SDC-2的腺病毒表達降低了響應(yīng)IL-1 β、TNF a和IL-1 β /TNF a的 NF-kB活性和IL6/IL8分泌。
[0129] 實例1 - SDC2表汰增強提供免痔抑制件
[0130] 方法
[0131] MSC的轉(zhuǎn)導
[0132] 將MSC按每孔105個細胞的密度平板接種于6-孔板（Nunc)完全培養(yǎng)基（a -MEM， 10% FBS)內(nèi)，讓其粘附過夜。細胞不進行轉(zhuǎn)導作為陰性對照，或采用1 μ 1腺病毒（
[0133] 蛋白質(zhì)印跡分析
[0134] 通過胰蛋白酶消化收獲細胞，并在含50禮1^8?!17.4、10%甘油、0.5%即40、 150mM NaCl和完全迷你型蛋白酶（抑制劑（Roche)的細胞裂解緩沖液中裂解。讓細胞裂 解液進行10% SDS-PAGE ;每個軌道加載50 μ g蛋白質(zhì)。將抗人多配體蛋白聚糖-2Ab(R&D systems)按1:500稀釋在TBS 0.1% Tween，3% BSA溶液中，進行蛋白質(zhì)檢測。將與辣根 過氧化物酶結(jié)合的二級抗大鼠 IgG抗體（Santa Cruz)按1:1000稀釋度加入。然后，利用 ECL蛋白質(zhì)印跡化學發(fā)光試劑（Pierce)和Flourochem成像系統(tǒng)，進行檢測。
[0135] 酶聯(lián)免疫吸附試驗
[0136] 利用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定收集的上清液中人多配體蛋白聚糖_2的水平。采用 商業(yè)上可獲取的ELISA試驗來測定SDC2的水平（⑶SABI0)。按照生產(chǎn)商的說明開展試驗。 利用純化的SDC2標準品的制作校正曲線。按照生產(chǎn)商的說明，通過S形（sigmoidal)邏輯 回歸法完成曲線擬合。
[0137] 人外周血單核細胞的分離
[0138] 為了分離外周血單核細胞（PBMC)，收集抗凝血樣（7_8ml)，分層放到液體密度梯 度培養(yǎng)基（GE Healthcare)上，在室溫以400xg離心分離30分鐘。吸出頂層并舍棄，小心 移取對應(yīng)的密度中間層（沉棕黃層），轉(zhuǎn)移到新的50ml管內(nèi)，收獲PBMC。加入20ml PBS洗 滌PBMC 2次，以400xg離心分離10分鐘。然后，以200xg低速離心分離10分鐘，以脫除血 小板。將PBMC在T細胞培養(yǎng)基（RPMI-1640, Gibco)中重懸，該T細胞培養(yǎng)基在洛斯維?帕 克紀念研究所（RPMI)培養(yǎng)基中含10% FBS、5OyM0巰基乙醇、1% NEAA、1% L-谷氨酰胺。 取出10 μ 1等份的這種懸浮液，并采用血球計測定細胞數(shù)。
[0139] 人Τ細胞增殖試驗
[0140] 采用0· 1 % BSA/PBS洗滌人PBMC，并按濃度2χ107個細胞/ml在預熱（37°C )的 ΙΟμΜ Vybrant羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯（CFSE)/PBS染色溶液（Invitrogen)中 染色。將細胞在37°C、避光的條件下培養(yǎng)6分鐘，加入5體積冰冷的含10% FBS的培養(yǎng)基， 使反應(yīng)停止。用培養(yǎng)基洗滌PBMC 3次，以脫除未結(jié)合的CFSE的所有痕跡。將10萬個CFSE 染色的PBMC在96-孔圓底板中用T細胞培養(yǎng)基中的抗人CD3/抗人CD28可溶性多克隆抗 體進行刺激。然后，向經(jīng)過刺激的PBMC中按各種比例（1:10、1:50、1:100、1:200和1:400) 加入MSC。亦培養(yǎng)不進行刺激的PBMC作為對照。4天后，收獲PBMC，之后移除上清液，將細 胞在100 μ 1含2% FBS的autoMACS清洗液中進行洗滌。然后，采用抗-人⑶4+-APC進行 復染色。利用FACSCanto分析PBMC的CFSE熒光。分析所有增殖，并與沒有MSC共培養(yǎng)的 刺激的PBMC進行對比。
[0141] 結(jié)果
[0142] 采用SDC2 ELISA可檢測出Ad. SDC2討度表汰MSC h清液中的脫落SDC2
[0143] 采用Ad. EGFP或Ad. SDC2轉(zhuǎn)導24小時后，吸出培養(yǎng)基，并代之以無血清培養(yǎng)基，并 在24、48和72h后收集。此上清液用于SDC2ELISA，包括新鮮無血清培養(yǎng)基作為對照。
[0144] 多配體蛋白聚糖在稱為脫落的過程中，通常在質(zhì)膜附近發(fā)生調(diào)節(jié)裂解。多配體蛋 白聚糖胞外域的釋放不僅會下調(diào)信號轉(zhuǎn)導，而且將膜結(jié)合受體轉(zhuǎn)化為可溶效應(yīng)子/或拮抗 劑（Manon-Jensen etal.，2010)〇
[0145] 通過采用人特異性SDC2ELISA技術(shù)，我們能夠?qū)uMSC脫落的SDC2蛋白進行檢 測和定量。我們測定Ad. EGFP和Ad. SDC2表達MSC培養(yǎng)基中脫落的SDC2蛋白的水平。在 48小時后檢測Ad. EGFP細胞培養(yǎng)基中的SDC2 (346. 4pg/ml)，72小時后，這一數(shù)值增加到 689. 2pg/ml。48小時時，SDC2過表達細胞顯示培養(yǎng)基中脫落SDC2的水平增加（456pg/ml)， 在72小時時，其水平大約是Ad. EGFP的2倍（1412. 7pg/ml)(參見圖1)。
[0146] 參考圖1，轉(zhuǎn)導后24小時，將完全培養(yǎng)基換為無血清培養(yǎng)基（1ml/孔）。48小時 和72小時后收集無血清上清液。采用商業(yè)上可獲取的SDC2ELISA試劑盒來檢測上清液中 存在的脫落SDC2。與Ad. EGFP表達細胞相比，Ad. SDC2上清液中的脫落SDC2的量增加（~ 2倍）。
[0147] 接下來，檢測SDC2的蛋白表達，以確保無血清培養(yǎng)基不會影響過度表達。
[0148] Ad. SDC2討度表汰導致高水平的SDC2蛋白表汰
[0149] HuMSC按1 X 105個細胞/孔的密度接種在6孔板上&讓其粘附24小時。然后，采 用Ad. EGFP或Ad. S2 (1 X 1012vp/ml)轉(zhuǎn)導HuMSC。轉(zhuǎn)導24小時后，將完全培養(yǎng)基換為無血 清培養(yǎng)基。24、48和72小時后收獲蛋白裂解液。對這些裂解液進行SDC2蛋白質(zhì)印跡分析 (R&D)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SDC2蛋白表達顯著增加。我們觀察到，與核心蛋白（~25kDa)及其二聚 形式（~48kDa)的分子量對應(yīng)的SDC2條帶增加（參見圖2)。
[0150] 免痔抑制潛力隨SDC2討度表汰增加而增加
[0151] 已經(jīng)證明，在Ad. SDC2轉(zhuǎn)導后，SDC2蛋白表達增加，此外，從細胞表面脫落的可溶 形式的SDC2也增加。我們對SDC2過度表達對huMSC免疫抑制潛力的影響（如果有任何影 響的話）進行了研究。
[0152] 利用T細胞增殖試驗，對親代細胞、Ad. EGFP細胞和Ad. SDC2hMSC細胞的免疫抑制 潛力進行了評價。利用CFSE表達的流式細胞分析，測定了 PBMC的T細胞（CD4+)部分的增 殖。CFSE是一種用于評價細胞增殖的熒光細胞染料，每次細胞分裂之后，其熒光隨子細胞逐 漸減半。由于存在MSC，受刺激T細胞的免疫抑制導致增殖抑制。在Ad. SDC2過度表達MSC 的存在下，增殖明顯降低。結(jié)果以3代百分比增殖顯示。在1:200MSC:PBMC比率時，與經(jīng) 刺激的T細胞陽性對照相比，Ad. SDC2MSC表現(xiàn)出顯著的T細胞免疫抑制潛力（使用1:10、 1:50和1:100比率時，得到類似的結(jié)果）。與親代MSC相比，Ad. EGFP細胞顯示出可以比得 上的T細胞免疫抑制水平（參見圖3)。
[0153] 參考圖3,采用刺激T細胞共培養(yǎng)，對親代細胞、Ad. EGFP細胞和Ad. SDC2細胞的免 疫抑制潛力進行評價，并采用流式細胞術(shù)進行定量。結(jié)果表明，Ad. SDC2細胞顯著提高了免 疫抑制性，與刺激T細胞陽性對照相比，能夠抑制T細胞增殖。Ad. EGFP群保持了與親代MSC 相當?shù)拿庖咭种茲摿?，但是，與親代及與Ad. EGFP MSC相比，Ad. SDC2群（標記為"S2"）顯 示出明顯增強的免疫抑制潛力（采用未配對T檢驗確定，=P < 0. 05, P < 0. 001)。
[0154] 因此，與親代huMSC相比，huMSC中SDC2過度表達導致免疫抑制效果得到增強。
[0155] 實例2 -過度表達SDC2的細胞（MSC) h清液抑制T細朐增葙
[0156] 我們對過度表達SDC2的一群MSC的上清液的免疫抑制活性進行了試驗。
[0157] 參考圖4,結(jié)果表明，與來自兩個對照：（1)親代MSC( "親代")，及（2)⑶3/⑶28刺 激的T細胞（"T細胞St"）的培養(yǎng)基相比，來自本發(fā)明細胞，即S2-過度表達的MSC("S2"） 的培養(yǎng)基，足以抑制CD3/CD28誘導的T細胞增殖。因此，該上清液具有免疫抑制性。
[0158] 實例 3
[0159] 作為治療產(chǎn)品效力試驗的SDC2試驗方案
[0160] 我們開發(fā)了基于SDC2試驗的產(chǎn)品效力測試方案。
[0161] 該方案包括：
[0162] 1.檢測潛在產(chǎn)品中的SDC2水平
[0163] 2.與合格治療產(chǎn)品最低預定水平進行對比
[0164] a.等于或高于最低預定水平=合格（測試結(jié)束）
[0165] b.低于最低預定水平=不合格
[0166] 3.與不合格治療產(chǎn)品的最高水平進行對比
[0167] a.低于最高水平=舍棄（測試結(jié)束）
[0168] b.處于合格治療產(chǎn)品的最低預定水平和不合格治療產(chǎn)品的最高水平之間=進行 處理，以提高SDC2水平，然后重復試驗
[0169] 實例 4
[0170] 作為治療產(chǎn)品效力試驗的SDC2試驗
[0171] 我們將實例3的方案在人細胞制備物的一特定試驗中實施。
[0172] 該方案采用下述預定水平：
[0173] 1.我們對潛在產(chǎn)品中的SDC2水平進行了試驗
[0174] 2. SDC2水平等于或高于1400pg/ml的制備物被認為適合進行進一步處理作為潛 在治療產(chǎn)品；制備物低于該水平被認為不合格
[0175] 3. SDC2水平低于500pg/ml的制備物一開始被標注為不適合進一步處理
[0176] 4. 500至1400pg/ml之間的制備物被鑒定為適合采用SDC2活化劑進行處理，以提 高其SDC2水平
[0177] 5.然后，我們還注意到，即使SDC2水平低于500pg/ml的制備物也可以采用SDC2 活化劑進行處理，以提高其SDC2水平
[0178] 6. SDC2水平升高到1400pg/ml以上的經(jīng)處理細胞被認為適合進行進一步處理作 為潛在治療產(chǎn)品。
[0179] 實例5-活化d53以增加內(nèi)源SDC2
[0180] 我們對各種HDAC抑制劑對一開始根據(jù)SDC2表達分離，然后在培養(yǎng)中保持的人細 胞群上SDC2表達的影響進行了測試。
[0181] 在24小時時，斯普利特麻一辛（Splitomicin)、丙戊酸和2-吡咯烷酮-正-丁酸 (PBA)的SDC2RNA水平均增加，其中斯普利特麻一辛的刺激最大。
[0182] 類似地，我們對環(huán)境毒素苯并[a]芘-7, 8-二醇-9, 10-環(huán)氧化物（BTOE)進行了 測試，發(fā)現(xiàn)600nM BPDE使SDC2分泌增加了近3倍。
[0183] 實例6 -供體細朐群的SDC2水平
[0184] 對3個人MSC供體（供體細胞制備物）的SDC2分泌水平進行了測試。結(jié)果表明， 其中兩個供體被鑒定為良好執(zhí)行者（標記為供體109和110)，具有高水平的SDC2,而第三 個供體被鑒定為差執(zhí)行者（供體111)，具有低水平的SDC2,并且未能通過實例4的SDC2試 驗。
[0185] 實例 7
[0186] 局部施用SDC2+、SDC2-和PA-SSC在糖尿病傷口愈合方而的對比
[0187] 我們利用ExcdlageiA ( -種纖維狀牛I型膠原高純度配制勻漿）對各種干細胞 群在傷口愈合模型方面的活性進行了對比。
[0188] 體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ?br>[0189] 采用雄性新西蘭白兔（3-3. 5kg)開展研究。通過耳緣靜脈給予Alloxan (150mg/ kg)，在這些兔子中誘發(fā)糖尿病。利用Accuch