專利名稱：亨廷頓病相關蛋白polyQ的體外聚集模型的建立方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基因工程領域，尤其涉及一種亨廷頓病相關蛋白polyQ的體外聚 集模型的建立方法。
背景技術：
亨廷頓病(Huntington’ s Disease, HD)是一種常染色體顯性遺傳性神經退行性 疾病，主要發(fā)生在中老年人群，患者的行為能力和認知水平障礙。亨廷頓病是由HD基因突 變，即HD基因第一外顯子中編碼多聚谷氨酰胺的CAG重復序列異常擴增，其表達產物一亨 廷頓蛋白(himtingtin，Htt)氨基端的多聚谷氨酰胺(簡稱“PolyQ”)異常延伸，PolyQ長 度超出一定閾值，Q >35(即Q的數(shù)量>35)，表達產物(Htt蛋白)發(fā)生異常聚集，從而對 神經元產生毒性而發(fā)病。正常的Htt蛋白彌散分布在神經元胞質內。在HD患者和HD動物 模型的腦組織(或神經元)內，突變的Htt蛋白聚集成淀粉樣斑塊或形成包涵體。PolyQ 長度與患者發(fā)病年齡相關。PolyQ在正常人群中短于35個，而在HD患者中突變Htt的谷 MMi^iSInil 36 ( =Davies Sff, TurmaineM, Cuzens, HA, at al. Formation of neuronal intranuclear inclusionsunderlies the neurological dysfunction in mice transgenic for the HDmutat ion [J], Cell, 1997,90 537-548) 在 HD 成年患者中約為 40 50個，老年患者中則>55個。已有資料表明，亨廷頓病的發(fā)生與亨廷頓蛋白(Htt)內 的多聚谷氨酰胺(PolyQ)的長度、多肽的構象變化(形成β片層)、形成的多聚體及其在神 經元內形成的淀粉樣斑塊沉淀有關。以PolyQ為靶點，構建PolyQ聚集的體外模型篩選和鑒定具有抗polyQ聚集的蛋 白(多肽)及小分子化合物，對獲得可防止和干預亨廷頓疾病的藥物具有重要意義。據(jù)文獻報告，硫代黃素TCThioflavin Τ,ThT)是一種陽離子苯并噻唑熒光染料，能 夠和淀粉樣蛋白結合并產生增強的熒光。已有學者檢測到在組織切片中的ThT可與淀粉樣 蛋白結合、并產生的熒光強度會增強。在體外實驗中，用混合的有機溶劑六氟異丙醇(HFIP) 和三氟乙酸(TFA)可溶解人工合成的polyQ的聚集體，使其成為polyQ單體，為在體外研究 polyQ多肽的構象及其聚集提供了一個新的途徑。Chen等(2002)報道通過Thioflavin T 方法在體外檢測polyQ的聚集，與經高效液相色譜(HPLC)定量檢測的聚集結果一致，說明 Thioflavin T 在體外檢測 polyQ 的聚集是可行的(參見Chen S,Berthelier V,HamiIton JB, at al. Amyloid-like features of polyglutamineaggregates and their assembly kinetics. Biochemistry, 2002,41 :7391_7399)。應當指出的是，在體外研究 polyQ 的聚集， 要人工合成polyQ。這不僅成本較高，不能滿足進行高通量篩選的需求。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)在人工合成polyQ所具有的缺點，提供一種用基因工程 方法獲得polyQ，探索體外聚集的亨廷頓病相關蛋白POLYQ的體外聚集模型的建立方法。本發(fā)明的亨廷頓病相關蛋白polyQ的體外聚集模型的建立方法，包括如下順序的
3步驟(1)構建 GST-polyQ (Q36-Q55)融合蛋白表達載體所述 GST-polyQ (Q36-Q55) 融合蛋白是在PolyQ多肽序列的N端加有GST標簽，polyQ長度為Q36-Q55，所述 GST-polyQ (Q36-Q55)融合蛋白表達載體是包含有編碼GST-polyQ (Q36-Q55)融合蛋白的核 苷酸序列的表達載體；(2)所述GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白表達載體在表達菌BL21star中表達 GST-polyQ (Q36-Q55)融合蛋白；(3)將上一步所得表達產物通過親和層析純化獲得GST-polyQ (Q36-Q55)融合蛋 白；(4)將GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白用蛋白酶酶切去除GST標簽，獲得polyQ多 肽，冷凍干燥；(5)制備polyQ多肽溶液向polyQ多肽凍干粉中加入六氟異丙醇(HFIP)和三氟 乙酸(TFA)的混合液，溶解polyQ多肽，然后用氮氣吹干有機溶劑，再加入pH值為3的三氟 乙酸(TFA)溶液或二甲基亞砜(DMSO)使polyQ多肽重新溶解，獲得polyQ多肽溶液；(6)將polyQ多肽溶液在pH6. 5-7. 8的磷酸鹽緩沖液(PBS)中或三羥甲基氨基甲 烷鹽酸鹽緩沖液(Tris-HCl)中進行聚集反應，使用硫代黃素T檢測其聚集過程。本發(fā)明方法的原理是polyQ多肽是一種有高度聚集傾向的多肽，PolyQ多肽在 大腸桿菌細胞內表達后即發(fā)生聚集、沉淀，在重組菌細胞內形成包含體。本發(fā)明在PolyQ 多肽序列的氨基端加上GST標簽有助于PolyQ蛋白處于可溶狀態(tài)，并易于進行表達后的分 離純化?？刹捎玫鞍酌该盖星谐浖兓腉ST-polyQ融合蛋白上的GST標簽，再在體外用 Thioflavin T熒光方法檢測polyQ在體外的聚集。這是在體外篩選和鑒定可抑制polyQ聚 集的活性物質的一種優(yōu)選的方法。所述GST-polyQ (Q36-Q55)融合蛋白的氨基酸序列如下GST-Gln-Gln-Gln. . . Gin, Gln 的重復數(shù)量是 36-55。其中GST為谷胱甘肽-S轉移酶。編碼所述GST-polyQ (Q36-Q55)融合蛋白的核苷酸序列如下ATGGGCAGC. . . GGATCCAGTCCTTCCAGCAGCAG. . . CAG, CAG 的重復數(shù)量是 36-55。因為 谷胱甘肽-S轉移酶的核苷酸序列是已知序列，所以在此用省略的表示方法。構建GST-polyQ (Q36-Q55)融合蛋白表達載體優(yōu)選如下方法以包含 有編碼EGFP-polyQ (Q36-Q55)蛋白的核苷酸序列的大腸桿菌重組質粒pET28a/ EGFP-polyQ(Q36-Q55)為模板，以上游引物 F :5，-atgggatccagtccttccagcagcag-3， 和下游引物R :5’ -ctcgaattccggtggttactgttgctg-3’為引物，利用PCR方法擴增 polyQ (Q36-Q55)基因片段，切膠純化基因片段，并進行BamHI和EcoRI雙酶切后，接至經同 樣雙酶切的PGEX-5X-1載體中，轉化大腸桿菌，獲得GST-polyQ (Q36-Q55)融合蛋白表達載 體。所述酶切去除GST標簽的蛋白酶選用胰酶、凝血酶或PreScission酶(一種由人 鼻病毒14型的3C蛋白酶和GST組成的融合蛋白，購自GE Healthcare Life Sciences公 司)。所述polyQ的長度為Q42(Q的重復數(shù)量為42)時，GST-polyQ(Q42)融合蛋白表達載體優(yōu)選PGEX-5X/Q42質粒，其構建方法如下以包含有編碼EGFP-polyQ(Q42)蛋 白的核苷酸序列的大腸桿菌重組質粒pET28a/EGFP-polyQ(Q42)為模板，以上游引物F: 5，-atgggatccagtccttccagcagcag-3，和下游弓丨物 R :5，-ctcgaattccggtggttactgttgctg-3’為引物，利用PCR方法擴增polyQ(Q42)基因片段，切膠純化基因片段，并進行BamHI和 EcoRI雙酶切后，接至經同樣雙酶切的PGEX-5X-1載體中，轉化大腸桿菌，獲得pGEX_5X/Q42 質粒。所述GST_polyQ(Q42)融合蛋白的氨基酸序列為SEQ NO. 3所示序列，如下GST-Gln-Gln-Gln. . · Gin, Gln 的重復數(shù)量是 42，其中GST為谷胱甘肽-S轉移酶。編碼GST-polyQ (Q42)融合蛋白的核苷酸序列為SEQ NO. 2所示序列，如下ATGGGCAGC. . . GGATCCAGTCCTTCCAGCAGCAG. . . CAG, CAG 的重復數(shù)量是 42。本發(fā)明的技術效果是實驗結果顯示，采用本發(fā)明方法得到的polyQ(Q36-Q55)能 在體外隨時間延長而發(fā)生聚集，并且用聚集抑制試劑剛果紅驗證了該模型的有效性。本發(fā) 明構建的模型可以用于抗亨廷頓病活性物質的篩選及動力學研究。與人工合成的PolyQ多 肽相比較，可大大降低其篩選成本。


圖1是本發(fā)明實施例中大腸桿菌表達載體pGEX-5X-l的酶切位點示意圖。圖2是本發(fā)明實施例中大腸桿菌BL/Q42總蛋白的SDS-PAGE的電泳結果。圖2中， 泳道1 =Marker ；泳道2-泳道3 分別為BL/Q42和對照菌株BL/GST表達的總蛋白。圖3是本發(fā)明實施例中純化后的GST-Q42蛋白SDS-PAGE電泳結果圖。圖4是利用讀板器檢測不同濃度Q42蛋白的聚集情況圖。圖5是利用讀板器檢測剛果紅對Q42蛋白聚集的影響結果圖。圖6利用熒光分光光度計檢測剛果紅對Q42蛋白聚集的影響結果圖。
具體實施例方式實施例一本實施例以polyQ的長度為Q42為例。一、實驗材料與方法1.實驗材料大腸桿菌菌株BL21 Star,質粒pET28a為深圳市基因工程重點實驗室保存，購自 ROCHE公司。質粒pEGFP-Cl購自美國Clontech公司。GST融合表達載體pGEX_5X_l購白 Amersham Biosciences公司。大腸桿菌重組質粒pET28a/EGFP_Q42由本實驗室構建并保存。大腸桿菌重組質粒pET28a/EGFP_Q42的構建方法如下以質粒pEGFP_Cl 為模板，以上游引物F :5，-catatggtgagcaagggcgagga-3，和下游引物R: 5，-agatctgagtccggacttgt-3，為引物，利用PCR方法擴增EGFP基因片段。PCR擴增條 件94°C預變性5min ；94°C變性30s，60°C退火lmin，72°C延伸45s，35個循環(huán)；72°C再延伸 IOmin后中止反應，切膠純化基因片段。合成Q42基因片段(上海生工公司)。
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將EGFP基因片段進行NdeI和BglII雙酶切，Q42基因片段進行BglII和XhoI雙 酶切后，連接至經NdeI和XhoI雙酶切的pET28a載體中，然后轉化大腸桿菌，獲得pET28a/ EGFP-Q42質粒。編碼EGFP-polyQ(Q42)融合蛋白的核苷酸序列為SEQ NO. 1所示序列。2.實驗方法2. lGST-polyQ(Q42)融合蛋白表達載體的構建以大腸桿菌重組質粒pET28a/EGFP_Q42為模板，以上游引物F 5，-atgggatccagtccttccagcagcag-3，和下游弓丨物 R :5，-ctcgaattccggtggttactgttgctg-3 ，為引物，利用PCR方法擴增Q42基因片段。PCR擴增條件94°C預變性5min ；94°C變性30s， 60°C退火lmin，72°C延伸30s，35個循環(huán)；72°C再延伸IOmin后中止反應。切膠純化基因片段，并進行BamHI和EcoRI雙酶切后，連接至經同樣雙酶切的 PGEX-5X-1載體中(參見圖1)，然后轉化大腸桿菌，獲得pGEX-5X/Q42質粒。PGEX-5X-1載體可在大腸桿菌中被異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達目的多 肽。目的基因的表達由Ptac啟動子控制，載體可編碼帶GST標簽的融合蛋白。將上述pGEX-5X/Q42及pGEX_5X_l質粒轉化感受態(tài)細菌BL21Star，分別獲得BL/ Q42 和 BL/GST 菌株。2. 2GST-polyQ(Q42)蛋白在大腸桿菌中表達的SDS-PAGE分析挑取上述BL/Q42和BL/GST菌株的單克隆，接種至含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中， 于37°C，200rpm進行過夜培養(yǎng)。次日進行擴大培養(yǎng)。加入終濃度為ImM的IPTG，誘導大腸 桿菌表達外源蛋白。l_4h后，將菌液離心，收集菌體。并用磷酸緩沖液重懸菌體后，加入 等體積的2X蛋白上樣緩沖液。將上述樣品經沸水浴煮5min后，離心。吸取上清液進行 SDS-PAGE 電泳。2. 3GST-polyQ(Q42)融合蛋白的分離純化分別挑取BL/Q42和BL/GST單克隆，接種到含有氨芐青霉素抗生素的LB培養(yǎng)基 里，37°C，培養(yǎng)。然后按體積1 100轉接入2L培養(yǎng)基。大約1-2個小時后細菌生長到對 數(shù)期，即OD6tltl值約為0. 6 0. 8時，加入終濃度為ImM的IPTG，34°C，180rpm誘導外源蛋白 的表達。將細菌培養(yǎng)液離心，并收集菌體。利用PBS(pH7. 4)緩沖液洗滌菌體兩次。利用超 聲波破菌，處理10分鐘。菌裂解液經離心，取上清液備用。pGEX-5X-l載體表達的GST-polyQ (Q42)融合蛋白N端含GST標簽，可利 用Glutathione Sepharose 4FF親和層析純化GST-polyQ (Q42)融合蛋白。將收集的 GST-polyQ(Q42)融合蛋白溶液進行SDS-PAGE，檢測蛋白的分離純化效果，并進行蛋白質定 量分析。2. 4polyQ(Q42)融合蛋白樣品的制備取GST-polyQ(Q42)融合蛋白，加入胰蛋白酶。37°C溫育8_16h，切下GST標簽。將 消化液放入沸水溫浴8-20min，使胰酶失活。再將消化后的polyQ (Q42)多肽樣品凍干。向上述polyQ (Q42)多肽凍干粉中加入HFIP和TFA混合液。處理時間為2_8h。用 氮氣吹干有機溶劑。再加入PH3的TFA溶液或DMSO使polyQ(Q42)多肽再溶解。2. 5polyQ(Q42)多肽體外聚集實驗取出polyQ(Q42)多肽溶液，將其稀釋到PBS(pH6. 5-7. 8)中，或Tris-HCl的緩沖液中。加入ThT，在37°C孵育。利用熒光讀板器(EX :444nm，EM為488nm)或熒光光度儀(EX 450nm，EM為470-620nm)掃描。通過熒光強度，分析檢測對照(GST蛋白酶切后的產物)或 Q42多肽的聚集。以時間為橫坐標，熒光強度為縱坐標，繪制Q42聚集的曲線。并選用合適 濃度的polyQ(Q42)，加入聚集抑制試劑剛果紅，驗證此模型的有效性。二、結果與分析1. GST-polyQ(Q42)蛋白在大腸桿菌中表達的SDS-PAGE鑒定為了檢測外源GST-polyQ (Q42)蛋白在重組菌中的表達，挑取BL/Q42及對照BL/ GST菌株并培養(yǎng)。加入終濃度ImM的IPTG，誘導外源蛋白質在大腸桿菌中表達。4h后收集 菌體，裂解細菌，將其進行SDS-PAGE電泳。從圖2可以看出，與對照菌(BL/GST)裂解液的 電泳圖譜比較，BL/Q42菌株有一分子量比GST稍大且較濃的特異條帶，與相應的蛋白分子 量理論值十分接近。表明IPTG可誘導BL/42菌株表達目的多肽。2. GST-polyQ (Q42)蛋白的親和層析純化利用固定的谷胱甘肽(GSH)和融合蛋白中帶有的GST標簽發(fā)生特異的親和反應純 化目的GST-polyQ(Q42)蛋白。將目的峰進行SDS-PAGE分析，從圖3可見特異性條帶，而大 腸桿菌表達的其它蛋白條帶消失。上述結果證明本發(fā)明獲得純化的GST-polyQ(Q42)融合 蛋白。其純度均為90%以上。3.可溶性PolyQ多肽的獲得為了獲得可溶性PolyQ多肽，向GST-polyQ(Q42)蛋白液中，按Trypsin GST-polyQ (m/m)為1 200加入消化液Trypsin，消化GST-polyQ融合蛋白中的GST。將消 化液放入沸水浴中8-20min，使胰蛋白酶失活。冷凍干燥。使用HFIP和TFA混合溶液(2mg/ ml)溶解凍干粉，室溫震蕩溶解2-8h。通過大量氮氣吹干有機溶劑。用TFA溶液(pH3. 0) 或DMSO (本實施例以TFA溶液為例)溶解polyQ (Q42)多肽。4. ThT法檢測polyQ的體外聚集硫代黃素T (Thioflavin T)能夠和淀粉樣蛋白結合，并能在450nm的激發(fā)光下產 生熒光?？衫眠@一性質來檢測PolyQ在體外的聚集過程。本發(fā)明在實驗中，將polyQ溶 液稀釋到PBS (pH6. 5-7. 8)或Tris-HCl中(本實施例以PBS為例)，獲得終濃度為20 μ Μ、 40 μ M的Q42溶液，在37°C孵育。利用熒光讀板器檢測熒光，EX :444nm, EM為488nm。檢測 GST/Q42蛋白的聚集情況。以熒光強度為縱坐標，以時間為橫坐標繪制Q42蛋白隨時間改變 而聚集的曲線，見圖4。實驗結果顯示Q42蛋白隨孵育時間的增加，其與Thioflavin T結合產生的熒光強 度逐漸增加，說明Q42蛋白在PBS溶液中隨孵育時間的增加在發(fā)生聚集。并且隨著Q42蛋 白濃度的升高，熒光強度也隨之增強。而GST的熒光未發(fā)生變化。在20μΜ的Q42蛋白中 加入聚集抑制試劑剛果紅，以熒光強度為縱坐標，以時間為橫坐標繪制聚集曲線，見圖5。并 在12小時時用熒光分光光度計進行光譜掃描，Ex為450nm，Em為470-620nm，見圖6。由結 果可知，剛果紅可以明顯降低Q42蛋白的聚集程度，驗證了該模型的有效性。三、結論體外聚集模型的可行性GST-polyQ融合蛋白可以使polyQ處于可溶狀態(tài)，用于體外研究，當切除GST標簽 后，polyQ就會發(fā)生聚集。Thioflavin T(ThT)是一種陽離子苯并噻唑熒光染料，能夠和淀粉樣蛋白結合并產生增強的熒光。Hamuro等(2007)利用胰酶(Trypsin)切除GST-polyQ 融合蛋白的GST標簽，用Thioflavin T熒光方法檢測polyQ在體外的聚集，從而對polyQ聚 集抑制多Jft (QBPl)進行優(yōu)化參見Hamuro G, Zhang TJ, Tucker C et al, Optimization of a polyglutamine aggregationinhibitor peptide (QBPl) using a thioflavin T fuorescence assay, AssayDrug Dev Technol，2007，5 (5) :629_636。Chen 等(2002)報道 通過Thioflavin T方法在體外檢測polyQ的聚集，與經HPLC定量檢測的聚集結果一致，說 明Thioflavin T在體外檢測polyQ的聚集是可行的。但是，很多蛋白序列中存在大量胰 酶酶切位點，研究此類蛋白在體外對polyQ的抗聚集作用，就不能利用Hamuro的方法在酶 解GST-polyQ的同時加入此類蛋白來檢測其抗聚集作用。Chen的方法則需要人工合成的 polyQ多肽，價格昂貴，不能滿足大量實驗的需求。 本實驗結合了 Hamuro和Chen的方法，成功構建了 polyQ的體外聚集模型首先構 建GST-polyQ融合蛋白表達載體，通過親和層析純化獲得GST-polyQ融合蛋白，再用胰酶酶 解GST標簽。冷凍干燥后，用HFIP和TFA混合液溶解polyQ(Q42)使其形成單體。獲得的 polyQ多肽單體在PBS (pH7. 4)中進行聚集反應，使用ThiofIavinT檢測其聚集過程。實驗 結果顯示，Q42單體能在體外隨時間延長而發(fā)生聚集。并且用聚集抑制試劑剛果紅驗證了 該模型的有效性。
權利要求
一種亨廷頓病相關蛋白polyQ的體外聚集模型的建立方法，其特征在于包括如下順序的步驟(1)構建GST polyQ(Q36 Q55)融合蛋白表達載體所述GST polyQ(Q36 Q55)融合蛋白是在polyQ多肽序列的N端加有GST標簽，polyQ長度為Q36 Q55，所述GST polyQ(Q36 Q55)融合蛋白表達載體是包含有編碼GST polyQ(Q36 Q55)融合蛋白的核苷酸序列的表達載體；(2)所述GST polyQ(Q36 Q55)融合蛋白表達載體在表達菌BL21star中表達GST polyQ(Q36 Q55)融合蛋白；(3)將上一步所得表達產物通過親和層析純化獲得GST polyQ(Q36 Q55)融合蛋白；(4)將GST polyQ(Q36 Q55)融合蛋白用蛋白酶酶切去除GST標簽，獲得polyQ多肽，冷凍干燥；(5)制備polyQ多肽溶液向polyQ多肽凍干粉中加入六氟異丙醇和三氟乙酸混合液，溶解polyQ多肽，然后用氮氣吹干有機溶劑，再加入pH值為3的三氟乙酸或二甲基亞砜，使polyQ多肽重新溶解，獲得polyQ多肽溶液；(6)將polyQ多肽溶液在pH6.5 7.8的磷酸鹽緩沖液中或三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液中進行聚集反應，使用硫代黃素T檢測其聚集過程。
2.根據(jù)權利要求1所述的亨廷頓病相關蛋白polyQ的體外聚集模型的建立方 法，其特征在于所述GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白表達載體的構建方法如下以包 含有編碼EGFP-polyQ (Q36-Q55)蛋白的核苷酸序列的大腸桿菌重組質粒pET28a/ EGFP-polyQ (Q36-Q55)為模板，利用PCR方法擴增polyQ (Q36-Q55)基因片段，切膠純化基因 片段，并進行BamHI和EcoRI雙酶切后，接至經同樣雙酶切的pGEX_5X_l載體中，轉化大腸 桿菌，獲得GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白表達載體；在上述PCR擴增時采用的引物是，上游弓I物 F :5，-atgggatccagtccttccagcagcag-3，，下游弓丨物 R :5，-ctcgaattccggtggttactgttgctg-3，。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的亨廷頓病相關蛋白polyQ的體外聚集模型的建立方法， 其特征在于所述polyQ的長度為Q42。
4.根據(jù)權利要求3所述的亨廷頓病相關蛋白polyQ的體外聚集模型的建立方法，其特 征在于所述GST-polyQ (Q36-Q55)融合蛋白表達載體為pGEX_5X/Q42質粒。
5.根據(jù)權利要求4所述的亨廷頓病相關蛋白polyQ的體外聚集模型的建立方法，其 特征在于所述PGEX-5X/Q42質粒的構建方法如下以包含有編碼EGFP-polyQ(Q42)蛋白 的核苷酸序列的大腸桿菌重組質粒pET28a/EGFP-polyQ(Q42)為模板，利用PCR方法擴增 Q42基因片段，切膠純化基因片段，并進行BamHI和EcoRI雙酶切后，接至經同樣雙酶切的 PGEX-5X-1載體中，轉化大腸桿菌，獲得PGEX-5X/Q42質粒；在上述PCR擴增時采用的引物 是，上游弓I物 F :5，-atgggatccagtccttccagcagcag-3，，下游弓丨物 R :5，-ctcgaattccggtggttactgttgctg-3，。
6.根據(jù)權利要求1或2所述的亨廷頓病相關蛋白polyQ的體外聚集模型的建立方法， 其特征在于所述酶切去除GST標簽的蛋白酶選用胰酶、凝血酶或PreScission。
全文摘要
本發(fā)明為一種亨廷頓病相關蛋白polyQ的體外聚集模型的建立方法，包括如下步驟構建GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白表達載體；將該表達載體在表達菌中表達GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白；將表達產物通過親和層析純化獲得GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白；將GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白用蛋白酶酶切去除GST標簽，獲得polyQ多肽，冷凍干燥；制備polyQ多肽溶液；將polyQ多肽溶液在pH6.5-7.8的PBS中或Tris-HCl中進行聚集反應，使用Thioflavin T檢測其聚集過程。本發(fā)明構建的模型可以用于抗亨廷頓病活性物質的篩選及動力學研究。與人工合成的polyQ多肽相比較，可大大降低其篩選成本。
文檔編號C07K14/47GK101974553SQ20101052919
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月28日 優(yōu)先權日2010年10月28日
發(fā)明者劉國寶, 劉昀, 李冉輝, 鄒永東, 鄭易之 申請人:深圳大學