,Sigma,45520)的 1/2MS 培養(yǎng)基上篩選,得到 代轉(zhuǎn) GsERF6 擬南 芥幼苗。如此重復(fù),直至得到T3代轉(zhuǎn)GsERra擬南芥純合體株系。
[0207] 提取Ts代轉(zhuǎn)GSERF6擬南芥幼苗的基因組RNA,進(jìn)行RT-PCR鑒定。具體步驟如下: 陽20引提取上述Ts代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥植株的總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA ;WcDNA為模板, 分別義用Primer-qS和Primer-qAS引物對(duì)、Actin2S和Actin2AS引物對(duì),通過RT-PCR對(duì) GsERTO基因進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè),得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。引物序列如下所示: 陽209] Primer-qS :5, -CCATCGTAGCACGAGGGTTG-3,;
[0210] Primer-qAS:5, -GAAACTTCAGCAGCGTTAGCC-3,; 陽211] Actin2S:5, -TTACCCGATGGGCAAGTC-3,;
[0212] Actin2AS :5, -GCTCATACGGTCAGCGATAC-3,。 陽21引 PCR擴(kuò)增體系:5yL 2XEasy Taq DM Polymerase,0. 8yL上下游引物(lOyM), 1 y L稀釋100倍的cDNA,無菌dd&O補(bǔ)足體積(總體積10 y L)。
[0214]PCR擴(kuò)增條件: 陽21引GsERF6:94°ClOmin一[94°C30s一60°C30s一72°C90s]X30一72°ClOmin一4°C 終止反應(yīng); 陽216] Actin2:94°ClOmin一[94°C30s一60°C30s一72°C90s]X28一72°C10m in-4°C終止反應(yīng)。
[0217] 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)結(jié)果如圖6所示:野生型擬南芥 植株的RT-PCR無擴(kuò)增產(chǎn)物,而了3代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥純合株系#7、T3代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥純 合株系#19和T3代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥純合株系#22都可W擴(kuò)增出目的條帶,表明外源基因 GsERTO基因不但已順利整合到擬南芥的基因組上,而且能夠在轉(zhuǎn)基因擬南芥中正常轉(zhuǎn)錄表 達(dá)。選取Ts代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥純合株系#7和T3代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥純合株系#19用于下 一步的表型分析。
[0218]S、轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥植株在堿脅迫下的表型分析
[0219] 1、轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥在堿處理下的萌發(fā)期表型及萌發(fā)率 陽220] 選取飽滿的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)、T3代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥純合株系 #7和了3代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥純合株系#19的種子,用5%次氯酸鋼消毒液消毒lOmin后,于 4°C春化3d,一部分種子播種于正常培養(yǎng)基,觀察表型并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率;一部分種子分別播種 于含有6mM、7mM和8mM NaHC〇3的1/2MS固體培養(yǎng)基上,每天觀察表型并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。所有 實(shí)驗(yàn)技術(shù)重復(fù)和生物學(xué)重復(fù)各3次。每次實(shí)驗(yàn)每個(gè)株系90株。 陽221] 結(jié)果如圖7所示:在正常條件下(即無任何脅迫未處理,control),T3代轉(zhuǎn)GSERF6 擬南芥純合株系#7和Ts代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥純合株系#19與野生型擬南芥種子的萌發(fā)狀 態(tài)無顯著差異,說明導(dǎo)入的GsERra基因并未對(duì)擬南芥萌發(fā)期的生長(zhǎng)、發(fā)育造成影響;在6mM NaHC〇3、7mMNaHC〇3和8mMNaHCO3脅迫下,T3代轉(zhuǎn)GsERra擬南芥純合株系#7和T3代轉(zhuǎn) GsERTO擬南芥純合株系#19與野生型擬南芥的萌發(fā)都受到抑制,但了3代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥 純合株系#7和了3代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥純合株系#19的生長(zhǎng)受抑制的程度明顯比野生型小, 且了3代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥純合株系#7和T3代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥純合株系#19的萌發(fā)率明顯 高于野生型植株。 陽222] 2、轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥在堿處理下的幼苗期表型及根長(zhǎng) 陽223] 選取飽滿的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)、Ts代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥純合株系#7 和T3代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥純合株系#19種子,用5%次氯酸鋼消毒液消毒lOmin后,于4°C春化3d,播種于1/2MS固體培養(yǎng)基上。1周后,挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的轉(zhuǎn)GsERF6擬南芥和野生型 擬南芥幼苗水平擺放于6mMNaHC〇3脅迫培養(yǎng)基的平皿中,豎直生長(zhǎng),觀察各處理組和非處 理組的擬南芥長(zhǎng)勢(shì)和根長(zhǎng),所有實(shí)驗(yàn)技術(shù)重復(fù)和生物學(xué)重復(fù)各3次。每次實(shí)驗(yàn)每個(gè)株系15 株。
[0224] 結(jié)果如圖8所示:在正常條件下(即無任何脅迫未處理,control),T3代轉(zhuǎn)GSERF6 擬南芥純合株系#7和#19與野生型擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育并沒有顯著差異,表明導(dǎo)入的GSERF6基因并未在幼苗期對(duì)擬南芥的生長(zhǎng)、發(fā)育造成影響;在NaHC〇3脅迫處理?xiàng)l件下,轉(zhuǎn)GSERF6 擬南芥與野生型擬南芥的生長(zhǎng)都受到了抑制,但在6mMNaHC〇3處理下,野生型生長(zhǎng)抑制更 明顯,轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥的根長(zhǎng)顯著長(zhǎng)于野生型。因此超量表達(dá)GsERTO基因提高了擬南芥 在幼苗期對(duì)堿脅迫的耐性。 陽2巧]3、轉(zhuǎn)GsERF6擬南芥在lOOmMNa肥化處理下的成苗期表型及葉綠素和丙二醒含量 的測(cè)定 陽226] 選取飽滿的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)、Ts代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥純合株系 #7、和了3代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥純合株系19#種子,4°C春化3d后,播種于營(yíng)養(yǎng)鉢中(營(yíng)養(yǎng)±, 君子蘭±,賠石按1 :1 :1混合),置于溫室中培養(yǎng)(22°C,光照16h/d)。3周后,對(duì)于堿處理 的苗每2~3d誘灌一次lOOmM NaHC〇3溶液。15d后觀察各處理組和非處理組的擬南芥長(zhǎng) 勢(shì),并測(cè)定處理組和非處理組葉綠素含量及丙二醒含量(檢測(cè)方法參見文獻(xiàn)"植物生理實(shí) 驗(yàn)/郝再彬等主編哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社,2004. 9")。所有實(shí)驗(yàn)技術(shù)重復(fù)和生物學(xué)重復(fù)各 3次。每次實(shí)驗(yàn)每個(gè)株系40株。
[0227]lOOmMNa肥〇3處理下轉(zhuǎn)GSERF6擬南芥與野生型擬南芥的長(zhǎng)勢(shì)情況如圖9A所示: 在正常條件下(即無任何脅迫未處理,處理前),了3代轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥純合株系#7和T3代 轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥純合株系#19與野生型擬南芥的成苗生長(zhǎng)發(fā)育情況并沒有顯著差異,表明 導(dǎo)入的GSERF6基因并未在成苗期對(duì)擬南芥的生長(zhǎng)、發(fā)育造成影響;對(duì)于誘灌l(xiāng)OOmMNaHC〇3 溶液的成苗,野生型大部分葉片發(fā)黃、萎黨、卷曲最終死亡,但轉(zhuǎn)GsERTO擬南芥葉片發(fā)生輕 度萎黨,基本都完全存活并開始生殖生長(zhǎng),且轉(zhuǎn)GsERra擬南芥的存活率明顯高于野生型。 陽22引 lOOmMNa肥〇3處理下轉(zhuǎn)GSERF6擬南芥與野生型擬南芥的葉綠素含量及丙二醒含 量測(cè)定結(jié)果如圖9B和圖9C所示:由圖9B可見在誘灌l(xiāng)OOmMNaHC〇3溶液情況下,野生型葉 片失綠程度要大于轉(zhuǎn)基因擬南芥,通過測(cè)定葉綠素含量可知,在脅迫處理下野生型與轉(zhuǎn)基 因植株葉綠素含量都有所下降,但野生型的降低幅度明顯比轉(zhuǎn)基因株系要大,說明野生型 植株的光合系統(tǒng)受到的傷害程度更大;丙二醒(MDA)是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物之一, 其含量可W反映植物遭受傷害的程度,如圖9C所示,堿脅迫處理后,野生型與轉(zhuǎn)基因植株 的MDA含量均有所上升,說明所有植株均受到不同程度堿脅迫的傷害,但是與野生型相比, 轉(zhuǎn)GSERF6的擬南芥MDA含量上升的幅度顯著低于野生型,說明其膜脂氧化程度較低,受到 脅迫的傷害較輕。成苗期堿脅迫實(shí)驗(yàn)說明GsERTO基因可W正向調(diào)節(jié)擬南芥的耐堿性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 蛋白質(zhì),是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì): a) 氣基酸序列是SEQIDNo. 2所不的蛋白質(zhì); b) 在SEQIDNo. 2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì); c) 將SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。2. 與權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料,為下述Al)至A20)中的任一種: Al)編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的核酸分子; A2)含有Al)所述核酸分子的表達(dá)盒; A3)含有Al)所述核酸分子的重組載體; A4)含有A2)所述表達(dá)盒的重組載體; A5)含有Al)所述核酸分子的重組微生物; A6)含有A2)所述表達(dá)盒的重組微生物; A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物; A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物; A9)含有Al)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系; A10)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系; All)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系; A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系; A13)含有Al)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織; A14)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物組織; A15)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織; A16)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織; A17)含有Al)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官; A18)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物器官; A19)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官; A20)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的相關(guān)生物材料,其特征在于:A1)所述核酸分子為如下1)或 2)或3)所示的基因: 1) 其編碼序列是SEQIDNo. 1的cDNA分子或DNA分子; 2) 與1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且編碼權(quán)利要求1所述的蛋 白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子; 3) 在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交,且編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì) 的cDNA分子或基因組DNA分子。4. 權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2或3所述的相關(guān)生物材料在調(diào)控植物抗逆性 中的應(yīng)用; 或權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2或3所述的相關(guān)生物材料在作為轉(zhuǎn)錄激活因 子中的應(yīng)用; 或權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2或3所述的相關(guān)生物材料在培育抗逆性轉(zhuǎn)基 因植物中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用,其特征在于:所述抗逆性為抗堿脅迫。6. -種培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法,包括將權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的編碼 基因?qū)胧荏w植物中,得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟;所述轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性高于所述受體植 物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于:所述蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列是 SEQIDNo. 1 的DNA分子。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法,其特征在于:所述抗逆性為抗堿脅迫。9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的方法,其特征在于:所述受體植物為單子葉植物或 雙子葉植物。10. 擴(kuò)增編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的核酸分子全長(zhǎng)或其片段的引物對(duì)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與植物抗逆性相關(guān)蛋白GsERF6及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白,是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì):a)氨基酸序列是SEQ?ID?No.2所示的蛋白質(zhì);b)在SEQ?ID?No.2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì);c)將SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。通過實(shí)驗(yàn)證明:本發(fā)明提供的蛋白具有提高植物抗逆性的功能,該蛋白在植物育種方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C12N15/29, C12N5/10, C12N1/21, C12N15/82, A01H5/00, C12N15/11, C07K14/415
【公開號(hào)】CN105198976
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510676834
【發(fā)明人】朱延明, 于洋, 肖佳雷, 孫曉麗, 李強(qiáng), 劉艾林, 曹蕾, 段香波
【申請(qǐng)人】東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2015年10月15日