ARE protein,is involved in regulating plant salt tolerance and ABA sensitivity. Plant Cell Tiss Organ Cult 2013, 113:199 - 215"中 公開過，公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0096] 下述實(shí)施例中的 pCAMBIA3301 載體在文獻(xiàn)"Xiaoli Sun, Feifei Wang, Hua Cai,Chaoyue Zhao, Wei Ji,Yanming Zhu.Functional characterization of an Arabidopsis prolyl aminopeptidase AtPAPl in response to salt and drought stresses. Plant Cell Tiss Organ Cult(2013) 114:325 - 338"中公開過，公眾可從東北 農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0097] 下述實(shí)施例中的大腸桿菌感受態(tài)Trans5 a Chemically Competent cell是全式金 公司公司的產(chǎn)品。
[0098] 下述實(shí)施例中的轉(zhuǎn)錄因子pGBKT7-AtDREBlA在文獻(xiàn)"LuoX，CuiN，ZhuY，et al.Over-expressionofGsZFPl,anABA-responsiveC2H2-typezincfingerprotein lackingaQALGGHmotif,reducesABAsensitivityanddecreasesstomatasize[J]. Journalofplant地ysiology,2012,169(12):1192-1202."中公開過，公眾可W從東北農(nóng) 業(yè)大學(xué)獲得。
[0099] 下述實(shí)施例中的野生型擬南芥（哥倫比亞生態(tài)型co^O)在文獻(xiàn)"LuoX，Sun X,LiuB,etal.EctopicexpressionofaWRKYhomologfromGlycinesojaalters floweringtimeinAr油idopsis[J].PloSone,2013,8(8):e73295."中公開過，，公眾可W 從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0100] 實(shí)施例1、大豆轉(zhuǎn)錄因子GSERF6基因的克隆 陽101] 1、植物材料的處理
[0102] 挑選飽滿的野生大豆G07256種子于濃H2SO4中處理lOminW去除泥膜，倒凈濃 H2SO4,用無菌水沖洗3~4遍后放置于濕潤的濾紙上，25°C暗培養(yǎng)3天催芽，待芽長到約1~2cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到盛有霍格蘭培養(yǎng)液的鉢中，用太空棉固定，使芽浸入培養(yǎng)液中，并將其放 置于人工氣候箱中培養(yǎng)。待幼苗長至3周齡，取其根部3cm放入EP管中，置于-80°C保存。 陽103] 2、RNA提取
[0104]采用RNAprep pure試劑盒燈RANSGEN BIOTECH)提取上述3周齡野生大豆幼苗的 根的總RNA。 陽105] 3、cDNA的獲得
[0106] W上述總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。 陽107] 4、PCR擴(kuò)增
[0108] W上述cDNA為模板，采用Primer-KS和Primer-KAS引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。引物序列如下：
[0109] Primer-KS:5, -GATGGCTAACGCTGCTGAAGT-3,（序列3);
[0110]Primer-KAS:5, -TTCGTCAAATGTACAATGTACTCATC-3'（序列 4)。
[0111] PCR擴(kuò)增體系巧0 y 1) :cDNA 4 y 1，10XPS buffer(Mg2+)10 y 1， dNTP Mixture (2. 5mM) 4 y 1,Primer-F 1 y 1,Primer-R lyl, Prime Star DNA Polymerase (TaKaRa) 0. 5 y 1，（1地2〇29. 5 y 1。 陽11引PCR擴(kuò)增條件：98°C8min;98°C10s，60°C10s，72°Clminl0s，30 個(gè)循環(huán)； 72°ClOmin;4°C終止反應(yīng)。
[0113] 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到分子量略小于化b的條帶， 用瓊脂糖凝膠回收試劑盒燈RANSGENBIOTECH)回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；將其與pEASY-Blunt Simple載體燈RANSGENBIOTECH)連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為祀ASY-Blunt Simple-GsERF6,并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)胞后送交測(cè)序。
[0114] 測(cè)序結(jié)果表明：PCR擴(kuò)增得到大小為92化P的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中包含完整的長83化P 的0RF，將其命名為GSERF6基因，其編碼基因的核巧酸序列如序列表中序列1所示，GSERF6 基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
[0115] 實(shí)施例2、大豆轉(zhuǎn)錄因子GSERF6基因的表達(dá)特性分析
[0116] 一、野生大豆根中GsERTO基因在堿脅迫處理下的表達(dá)模式分析
[0117] 1、植物材料的處理
[0118] 挑選飽滿的野生大豆G07256種子于濃H2SO4中處理lOminW去除泥膜，倒凈濃 H2SO4,用無菌水沖洗3~4遍后放置于濕潤的濾紙上，25°C暗培養(yǎng)3天催芽，待芽長到約 1~2cm時(shí)，移出，用霍格蘭液體培養(yǎng)基進(jìn)行水培。待野生大豆幼苗長至3周齡，在50mM NaHC〇3(pH8.5)條件下對(duì)野生大豆幼苗進(jìn)行堿脅迫處理，分別在處理化、比、化、6h、化、 1化、24h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取3株長勢(shì)相同的野生大豆幼苗，剪取其根尖3cm作為待測(cè)組織樣 品，迅速放于液氮中冷凍，然后置于-80°C保存。
[0119]2、總RNA的提取和cDNA的獲得
[0120] 采用RNApreppure試劑盒（TRANSGENBIOTECH)分別提取上述步驟1獲得的不同 時(shí)間處理后的待測(cè)組織樣品的總RNA;W獲得總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。
[0121] 3、Real-time PCR
[0122] W上述cDNA為模板，采用Primer-qS和Primer-qAS引物，通過Real-time PCR對(duì) GsERTO基因進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)。引物序列如下所示：
[0123] Primer-qS:5' -CCATCGTAGCACGAGGGTTG-3,；
[0124] Pr imer-qAS :5，-GAAACTTCAGCAGCGTTAGCC-3，。 陽125] Real-time PCR反應(yīng)的條件：95°C2min一[95°C 15s一60°C30s] X40一95°C Imin一5 5°C Imin一95°C 30s。 陽1%] Real-time PCR采用比較CT法（AACT)計(jì)算基因表達(dá)量，W野生大豆GsGAPDH基 因?yàn)閮?nèi)參基因，W未經(jīng)處理的樣品作為對(duì)照。目標(biāo)基因表達(dá)差異通過經(jīng)過處理的樣本相對(duì) 于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)未經(jīng)處理的樣本的倍數(shù)來表示。每個(gè)樣品包括3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重 復(fù)，數(shù)據(jù)取3次生物學(xué)重復(fù)的平均值，如果有一個(gè)數(shù)值的偏差比較大則取兩個(gè)數(shù)據(jù)的平均 值。原始數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理。標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)經(jīng)T-test進(jìn)行差異顯著性分析。相對(duì) 表達(dá)量計(jì)算方法-2AACT= 2 (act啦里ACT刷胥）二2[仍細(xì)CT?art參細(xì)）仍^照iW細(xì)CT刷帥 內(nèi)參基因引物序列如下所示：
[0127] GsGAP畑S:5'-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3';
[0128] GsGAPDH AS：5' -GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3'〇
[0129] 結(jié)果如圖1所示：50mMNaHC〇3處理下GsERTO表達(dá)呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)再下降趨于 平穩(wěn)的趨勢(shì)，在根中脅迫處理化時(shí)達(dá)到最高值，說明GsERTO基因的表達(dá)受堿脅迫的誘導(dǎo)。
[0130] 二、野生大豆不同組織中GsERTO基因的相對(duì)表達(dá)量 陽131] 1、植物材料的處理
[0132] 挑選飽滿的野生大豆G07256種子于濃H2SO4中處理lOminW去除泥膜，倒凈濃 H2SO4,用無菌水沖洗3~4遍后放置于濕潤的濾紙上，25°C暗培養(yǎng)3天催芽，待芽長到約1~ 2cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到盛有30%草炭±、70%普通±的育苗盆中，將其放置于人工氣候箱中培 養(yǎng)。待幼苗長至3周齡，取野生大豆不同組織（包括幼葉、老葉、莖、花、種芙、下胚軸、根）， 迅速放入液氮中冷凍，置于-80°C保存待用。 陽13引 2、總RNA的提取和cDNA的獲得
[0134]采用RNApreppure試劑盒（TRANSGENBIOTECH)分別提取上述野生大豆不同組織 (包括幼葉、老葉、莖、花、種芙、下胚軸、根）的總RNA;從當(dāng)RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。 陽135] 3、Real-timePCR
[0136] W上述 cDNA 為模板，義用 Primer-qS 和 Primer-qAS 引物，通過 Real-time PCR 對(duì) GsERF6基因進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)。引物序列如下所示：
[0137]Primer-qS:5' -CCATCGTAGCACGAGGGTTG-3,； 陽1；38]Primer-qAS :5, -GAAACTTCAGCAGCGTTAGCC-3,。 陽139]Real-time PCR反應(yīng)的條件：95°C2min 一 [95°C 15s 一 60°C30s] X40 一 95°C Imin 一 5 5°C Imin 一 95°C 30s。
[0140] Real-timePCR采用比較CT法（AACT)計(jì)算基因表達(dá)量，W野生大豆GsGAPDH基 因?yàn)閮?nèi)參基因，W未經(jīng)處理的樣品作為對(duì)照。目標(biāo)基因表達(dá)差異通過經(jīng)過處理的樣本相對(duì) 于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)未經(jīng)處理的樣本的倍數(shù)來表示。每個(gè)樣品包括3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重 復(fù)，數(shù)據(jù)取3次生物學(xué)重復(fù)的平均值，如果有一個(gè)數(shù)值的偏差比較大則取兩個(gè)數(shù)據(jù)的平均 值。原始數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理。標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)經(jīng)T-test進(jìn)行差異顯著性分析。相對(duì) 表達(dá)量計(jì)算方法-2AACT= 2 (ACT啦里ACT刷胥）二2 [仍類iw細(xì)CTitart參細(xì)）仍刷胥iW細(xì)CT刷帥 內(nèi)參基因引物序列如下所示：
[0141] GsGAP畑S:5'-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3';
[0142] GsGAPDHAS：5' -GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3' 〇
[0143] 結(jié)果如圖2所示：GsERTO基因在野生大豆各個(gè)組織中均有表達(dá)且在下胚軸及根中 表達(dá)量相對(duì)較高，表明GsERTO基因可能參與野生大豆整個(gè)生長發(fā)育過程，尤其是根的生長 發(fā)育或根部的營養(yǎng)物質(zhì)及離子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程。
[0144] S、GUS染色法分析GSERF6基因在擬南芥中的組織表達(dá)部位
[0145] 1、植物材料的處理
[0146] 挑選飽滿的野生大豆G07256種子于濃H2SO4中處理lOminW去除泥膜，倒凈濃 H2SO4,用無菌水沖洗3~4遍后放置于濕潤的濾紙上，25°C暗培養(yǎng)3天催芽，待芽長到約1~2cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到盛有霍格蘭培養(yǎng)液的鉢中，用太空棉固定，使芽浸入培養(yǎng)液中，并將其放 置于人工氣候箱中培養(yǎng)。待幼苗長至3周齡，取其根部3cm放入EP管中，置于-8(TC保存。 陽147] 2、基因組DNA的提取 陽148] 按照TRANSGEN公司EASYPure Plant Genomic DNA kit試劑盒說明書步驟提取上 述野生大豆