0的其他序列不變得到 的載體，重組載體pCAMBIA 2300-GSERF6表達(dá)GsERF6蛋白。
[0055] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了上述GsERTO蛋白或上述GsERTO蛋白相關(guān) 的生物材料的用途。
[0056] 本發(fā)明提供了上述GsERTO蛋白或上述GsERTO蛋白相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物抗 逆性中的應(yīng)用。
[0057] 本發(fā)明還提供了上述GsERTO蛋白或上述GsERTO蛋白相關(guān)的生物材料在作為轉(zhuǎn)錄 激活因子中的應(yīng)用。
[0058] 本發(fā)明還提供了上述GsERTO蛋白或上述GsERTO蛋白相關(guān)的生物材料在培育抗逆 性轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0059] 上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物抗逆性為提高植物抗逆性。
[0060] 上述應(yīng)用中，所述抗逆性為抗堿脅迫。
[0061] 上述應(yīng)用中，所述植物可為單子葉植物和/或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體 可為豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可為大豆、百脈根、首猜 或水黃皮；所述十字花科植物可為擬南芥或油菜；所述菊科植物可為向日葵；所述擬南芥 可為擬南芥（哥倫比亞生態(tài)型co^O)。
[0062] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明最后提供了一種培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的 方法。
[0063] 本發(fā)明提供的一種培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括將上述GsERTO蛋白 的編碼基因?qū)胧荏w植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物抗逆性高于所述受 體植物。
[0064] 上述方法中，所述GSERF6蛋白的編碼基因的核巧酸序列是SEQ ID No. 1所示的 DM分子。 陽(yáng)0化]上述方法中，所述抗逆性為抗堿脅迫。
[0066] 所述抗堿脅迫具體為抗NaHC〇3脅迫，體現(xiàn)為在NaHCO3脅迫的條件下：轉(zhuǎn)基因植物 的萌發(fā)率和/或存活率高于受體植物、轉(zhuǎn)基因植物的根長(zhǎng)長(zhǎng)于受體植物、轉(zhuǎn)基因植物的葉 綠素含量高于受體植物和/或轉(zhuǎn)基因植物的丙二醒（MDA)含量低于受體植物。
[0067] 上述方法中，所述受體植物可為單子葉植物和/或雙子葉植物；所述雙子葉植物 具體可為豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可為大豆、百脈根、 首猜或水黃皮；所述十字花科植物可為擬南芥或油菜；所述菊科植物可為向日葵；所述擬 南芥可為擬南芥（哥倫比亞生態(tài)型co^O)。 W側(cè)在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，GsERF6蛋白的編碼基因（即SEQ ID No. 1的核巧酸） 通過(guò)含有GSERF6蛋白的編碼基因的表達(dá)盒的重組載體pCAMBIA 2300-GSERF6導(dǎo)入農(nóng)桿菌 LBA4404中。所述重組載體pCAMBIA 2300-GSERF6為用沈Q ID No. 1所示的DNA分子插入 pCAMBIA 2300載體的Smal和甜al酶切位點(diǎn)之間，保持pCAMBIA 2300的其他序列不變得到 的載體，重組載體pCAMBIA 2300-GSERF6表達(dá)GsERF6蛋白。
[0069] 上述方法中，所述GsERTO基因可先進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo)入受體植物中，W達(dá)到更 好的表達(dá)效果：
[0070] 1)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，W使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)受體植物所 偏愛(ài)的密碼子，在保持本發(fā)明所述GsERTO基因的氨基酸序列的同時(shí)改變其密碼子W符合 植物偏愛(ài)性；優(yōu)化過(guò)程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，W最好地實(shí) 現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中GC含量可為35 %、多于45 %、多于50 %或多于約 60% ；
[00川。修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，W使翻譯有效起始；例如，利用在植物中 已知的有效的序列進(jìn)行修飾；
[0072] 3)與各種植物表達(dá)的啟動(dòng)子連接，W利于其在植物中的表達(dá)；所述啟動(dòng)子可包括 組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動(dòng)子；啟動(dòng)子的 選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和空間需要而變化，而且也取決于祀物種；例如組織或器官的特異性 表達(dá)啟動(dòng)子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時(shí)期而定；盡管證明了來(lái)源于雙子葉植物的許多 啟動(dòng)子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動(dòng)子用于 雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動(dòng)子用于單子葉植物中的表達(dá)；
[0073] 4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可W提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率；例如來(lái)源于 CaMV的tml，來(lái)源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可W與本發(fā) 明基因進(jìn)行連接；
[0074] 5)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列（例如來(lái)源于A化1和bronzel)和病毒前導(dǎo)序 列（例如來(lái)源于TMV，MCMV和AMV)。
[00巧]上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述GsERTO基因轉(zhuǎn)化目的植物 得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可W在該物種中繁殖該基因， 也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述 轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。
[0076] 擴(kuò)增編碼上述GsERTO蛋白的核酸分子全長(zhǎng)或其片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0077] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種野生大豆耐堿轉(zhuǎn)錄因子基因GSERF6,對(duì)其進(jìn)行組織定位分析， 發(fā)現(xiàn)其在根中的表達(dá)量明顯高于其他組織。將其瞬時(shí)表達(dá)于洋蔥表皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其主要表 達(dá)在細(xì)胞核中，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該蛋白具有自激活活性，可能通過(guò)調(diào)控其他基因的表達(dá)水 平或者轉(zhuǎn)錄活性使植株對(duì)堿脅迫產(chǎn)生抗性。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，將GsERTO基因超表達(dá)于擬 南芥中，可增強(qiáng)擬南芥在萌發(fā)期、幼苗期和成苗期對(duì)堿脅迫的耐性，說(shuō)明該蛋白可W為培育 具有耐堿性的轉(zhuǎn)基因植物的研究奠定基礎(chǔ)。
[0078] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0079] 圖1為野生大豆根中GsERF6基因在50mMNaHO)3(pH8.W處理下的表達(dá)模式。
[0080] 圖2為野生大豆不同組織中GsERF6基因的相對(duì)表達(dá)量。
[0081] 圖3為GSERF6基因在擬南芥中的組織定位分析。
[0082] 圖4為GsERF6基因的亞細(xì)胞定位分析。
[0083] 圖5為酵母細(xì)胞中GSERF6基因的轉(zhuǎn)錄激活活性分析。
[0084] 圖6為轉(zhuǎn)GsERF6基因擬南芥植株分子鑒定。其中，#7、#19和#22均為T(mén)s代轉(zhuǎn) GSERF6基因擬南芥，WT為野生型擬南芥。 陽(yáng)0化]圖7為轉(zhuǎn)GsERF6基因擬南芥植株在6mMNa肥〇3、7mMNaHC〇3和8mMNaHC〇3處理 下的萌發(fā)期表型及萌發(fā)率的統(tǒng)計(jì)分析。其中，#7和#19均為T(mén)s代轉(zhuǎn)GsERF6基因擬南芥，WT 為野生型擬南芥。
[0086] 圖8為轉(zhuǎn)GSERF6基因擬南芥植株在6mM NaHC〇3處理下的幼苗期表型。圖8A為 野生型及轉(zhuǎn)GsERTO基因擬南芥植株在堿脅迫處理下的表型分析結(jié)果；圖8B為野生型及 轉(zhuǎn)GsERTO基因擬南芥植株在堿脅迫處理下的根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。其中，#7和#19均為T(mén)3代轉(zhuǎn) GSERF6基因擬南芥，WT為野生型擬南芥。
[0087] 圖9為轉(zhuǎn)GSERF6基因擬南芥植株在lOOmM Na肥〇3處理下的成苗期表型分析、葉 綠素含量及丙二醒含量測(cè)定結(jié)果。圖9A為轉(zhuǎn)GSERF6基因擬南芥植株在lOOmM NaHC〇3處 理下的成苗期表型分析結(jié)果；圖9B為轉(zhuǎn)GsERTO基因擬南芥植株在lOOmM NaHC〇3處理下的 葉綠素含量測(cè)定結(jié)果；圖9C為轉(zhuǎn)GsERTO基因擬南芥植株在lOOmM NaHC〇3處理下的丙二醒 含量測(cè)定結(jié)果。其中，#7和#19均為T(mén)s代轉(zhuǎn)GSERF6基因擬南芥，WT為野生型擬南芥。
【具體實(shí)施方式】
[0088] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0089] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0090] 下述實(shí)施例中的野生大豆G07256在文獻(xiàn)"Mingzhe Sun, Xiaoli Sun, Yang Zhao, Hua Cai, Chaoyue Zhao, Wei Ji, Huizi DuanMu, Yang Yu, Yanming Zhu. Ectopic expression of GsPPCKSand SCM民P in Medicago sativa enhances plant alkaline stress tolerance and methionine content. PLOS ONE 2014,9(2) :e89578"中公開(kāi)過(guò)，公 眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0091] 下述實(shí)施例中的pCAMBIA2300 載體在文獻(xiàn)"AilinLiu，Yang化，Xiangbo Duan,Xiaoli Sun,Huizi Duanmu, Yanming Zhu. GsSKP21,a Glycine soja S-phase kinase-associated protein，mediates the regulation of plant alkaline tolerance and ABA sensitivity. Plant Mol Biol (20巧）87: 111-124"中公開(kāi)過(guò)，公眾可從東北農(nóng) 業(yè)大學(xué)獲得。
[0092] 下述實(shí)施例中的農(nóng)桿菌LBA4404 在文獻(xiàn)"AilinLiu，Yang化，Xiangbo Duan,Xiaoli Sun,Huizi Duanmu, Yanming Zhu. GsSKP21,a Glycine so ja S-phase kinase-associated protein，mediates the regulation of plant alkaline tolerance and ABA sensitivity. Plant Mol Biol (20巧）87: 111-124"中公開(kāi)過(guò)，公眾可從東北農(nóng) 業(yè)大學(xué)獲得。
[0093] 下述實(shí)施例中的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)AH109在"孫曉麗；段小 紅；才華；李勇；柏錫；紀(jì)巍；季佐軍；朱延明。利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與AtbZIPl相互作 用的蛋白質(zhì)。中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2010,26(U) 1050-1058"中公開(kāi)過(guò)，公眾可 從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0094]下述實(shí)施例中的 PGBKT7 載體在文獻(xiàn)"Xiao Luo, Na Cui，Yanming Zhu, Lei Cao,Hong Zhai,Hua Cai,Wei Ji,Xuedong Wang, Dan Zhu,Yong Li,Xi Bai Over-expression of GsZFPl,an ABA-responsive C2H2-type zinc finger protein lacking a QALGGH motif, reduces ABA sensitivity and decreases stomata size. Journal of Plant Physiology 169(12) ;1192-1202"中公開(kāi)過(guò)，公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 獲得。
[00 巧]下述實(shí)施例中的 pBSK-35S-eGFP 載體在文獻(xiàn)"Xiaoli Sun，Wei Ji，Xiaodong Ding, Xi Bai, Hua Cai, Shanshan Yang, Xue Qian, Mingzhe Sun, Yanming Zhu. GsVAMP72, a novel Glycine so ja 民一SN