植物白粉病抗性相關(guān)蛋白Pm-2F及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種植物白粉病抗性相關(guān)蛋白Pm-2F及其編 碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 甜瓜（化cumis melo L.)是一種在國內(nèi)外普遍栽培的水果型蔬菜作物，屬于葫蘆 科（化curbitaceae)，黃瓜屬（化cumis)，甜瓜種。甜瓜是我國高端農(nóng)業(yè)的優(yōu)勢作物，對農(nóng)民 增收與農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整有著重要意義。
[0003] 白粉病是一種嚴(yán)重危害甜瓜生產(chǎn)的世界性病害，從苗期至收獲期均可發(fā)生。白粉 病主要危害甜瓜的葉片，也侵染葉柄和莖蔓，可導(dǎo)致植株光合能力下降，引起早衰甚至死 亡，嚴(yán)重影響甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。近年來，隨著生產(chǎn)的規(guī)?；蜕唐坊潭鹊奶岣撸追鄄?迅速蔓延，已成為國內(nèi)外甜瓜等瓜類作物綠色生產(chǎn)的主要障礙。
[0004] 引起甜瓜白粉病的病原菌主要有單囊殼白粉菌（Podos地aera xanthii)和二抱白 粉菌（Golovinomyces cichoracearum)，其中 W單囊殼白粉菌（Podos曲aera xan1:hii)占主 導(dǎo)。甜瓜白粉病菌生理小種多，分化快，僅單囊殼白粉菌（Podos地aera xanthii)常見生理 小種就多達(dá)7個，包括0、l、2US、2F、3、4和5，其中單囊殼白粉菌（Podos地aeraxanthii)2F 生理小種是國內(nèi)大部分地區(qū)的優(yōu)勢生理小種，因此開展對單囊殼白粉菌（Podos地aera xanthii) 2F生理小種的抗病基因研究將是解決甜瓜白粉病的首要突破口。
[0005] 植物抗病基因的克隆是深入研究植物與病原物的分子互作機理，有效防治植物重 要病害的基礎(chǔ)和前提。植物抗病基因的克隆主要基于圖位克?。╩ap-based cloning)和轉(zhuǎn) 座子標(biāo)簽（transposon tagging)兩種策略，通過圖位克隆得到目標(biāo)基因并找到引起表型變 化的關(guān)鍵位點是目前功能基因研究的熱點。圖位克隆技術(shù)是根據(jù)目標(biāo)基因在染色體上的 位置進(jìn)行基因克隆的一種方法，其基本原理是根據(jù)功能基因在基因組中都有相對穩(wěn)定的基 因座，在利用分子標(biāo)記技術(shù)對目的基因進(jìn)行精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，用與目的基因緊密連鎖的 分子標(biāo)記篩選DNA文庫（包括YAC、BAC、TAC、PAC或Cosmid文庫），鑒定出與標(biāo)記有關(guān)的 克隆，繼之W亞克隆和染色體步移（C虹omosome wa化ing)形式獲得含有目的基因的克隆片 段，其核屯、任務(wù)是染色體步移，如果能找到與目標(biāo)基因很近的標(biāo)記，W至于二者之間的距離 小于基因組文庫中克隆的平均插入片段大小，就可W直接篩選到含有目標(biāo)基因的克隆，最 終得到目的基因。目前，運用圖位克隆技術(shù)已分離到了大量的植物抗病基因，但迄今為止， 未見甜瓜白粉病抗病基因被成功分離克隆的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何提高植物白粉病抗性。
[0007] 為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了一種植物白粉病抗性相關(guān)的蛋白。
[000引本發(fā)明所提供的植物白粉病抗性相關(guān)的蛋白，名稱為Pm-2F，來源于甜瓜（化cumis melo L.)，是如下al)或a2)或曰3)的蛋白質(zhì)：
[0009] al)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；
[0010] a2)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白 質(zhì)；
[0011] a3)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加得到的與植物白粉病抗性相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[0012] 其中，序列表序列2由1084個氨基酸殘基組成。
[0013] 為了使al)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或 簇基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0014] 表1.標(biāo)簽的序列
[0015]
腳)1引上述a：3)中的Pm-2F，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為 不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0017] 上述曰3)中的Pm-2F可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。
[0018] 上述曰3)中的Pm-2F的編碼基因可通過將序列表序列1所示的DNA序列中缺失一 個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5' 端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0019] 編碼所述Pm-2F的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0020] 所述編碼Pm-2F的核酸分子可為如下化1)或化2)或化3)或化4)所示的DNA分 子：
[002。 化1)核巧酸序列是序列表序列1所示的DNA分子；
[002引 化2)編碼區(qū)如序列表序列1所示的DNA分子；
[0023] 化3)與化1)或化2)限定的核巧酸序列具有75%或75%W上同一性，且編碼所述 Pm-2F的DNA分子；
[0024] 化4)在嚴(yán)格條件下與化1)或化2)限定的核巧酸序列雜交，且編碼所述Pm-2F的 DNA分子。
[002引其中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也 可W是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0026] 其中，序列表序列1由3255個核巧酸組成，序列表序列1的核巧酸編碼序列表序 列2所示的氨基酸序列。
[0027] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可W很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點突變的方 法，對本發(fā)明的編碼Pm-2F的核巧酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分 離得到的編碼Pm-2F的核巧酸序列80%或者更高同一性的核巧酸，只要編碼Pm-2F且與植 物白粉病抗性相關(guān)，均是衍生于本發(fā)明的核巧酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[002引運里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本 發(fā)明的編碼序列表的序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核巧酸序列具有75%或更 高，或80%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核巧酸序列。同 一性可W用肉眼或計算機軟件進(jìn)行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性 可W用百分比（％ )表示，其可W用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
[0029] 含有所述編碼所述Pm-2F的核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因 細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0030] 所述表達(dá)盒可為表達(dá)盒A;所述表達(dá)盒A包括啟動子、編碼所述Pm-2F的核酸分子 和終止子。所述啟動子可為CaMV35S啟動子；所述終止子可為N0S終止子。
[0031] 所述重組載體可為將所述Pm-2F的編碼基因（即序列表序列1所示的DNA分子） 通過含有所述Pm-2F的編碼基因的表達(dá)盒插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體具 體可為將所述Pm-2F的編碼基因（即序列表序列1所示的DNA分子）插入載體PCHF3的多 克隆位點得到的重組質(zhì)粒，即用序列表序列1所示的DNA分子插入載體PCHF3的SacI和 BamHI識別位點之間得到的重組載體pCHF3-Pm-2F。
[0032] 所述重組微生物可通過將所述重組載體導(dǎo)入出發(fā)微生物得到。
[0033] 所述出發(fā)微生物可為酵母、細(xì)菌、藻類或真菌。所述細(xì)菌可為革蘭氏陽性細(xì)菌或革 蘭氏陰性細(xì)菌。所述革蘭氏陰性細(xì)菌可為根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)。所 述根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)具體可為根癌農(nóng)桿菌EHA105。
[0034] 所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系均不包括繁殖材料。所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所 述Pm-2F的編碼基因轉(zhuǎn)化受體植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因 植物，可W在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其 它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。
[003引所述Pm-2F，或，所述編碼所述Pm-2F的核酸分子，或，含有所述編碼所述Pm-2F的 核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，在調(diào)控植物白粉病抗性中的應(yīng) 用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[003引所述Pm-2F，或，所述編碼所述Pm-2F的核酸分子，或，含有所述編碼所述Pm-2F的 核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，在培育植物白粉病抗性的轉(zhuǎn)基 因植物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0037] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0038] 本發(fā)明所提供的一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將編碼所述Pm-2F的核酸分子 導(dǎo)入受體植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比白粉病抗 性增強。
[0039] 上述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法中，所述編碼Pm-2F的核酸分子可為如下化1)或化2) 或化3)或化4)所示的DNA分子：
[0040] 化1)核巧酸序列是序列表序列1所示的DNA分子；
[00川 化2)編碼區(qū)如序列表序列1所示的DM分子；
[0042] 化3)與化1)或化2)限定的核巧酸序列具有75%或75%W上同一性，且編碼所述 Pm-2F的DNA分子；
[0043] 化4)在嚴(yán)格條件下與化1)或化2)限定的核巧酸序列雜交，且編碼所述Pm-2F的 DNA分子。
[0044] 其中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也 可W是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0045] 其中，序列表序列1由