一種高純度重組人腦利鈉肽的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領域，特別設及一種高純度重組人腦利鋼膚的制備方法，本 發(fā)明進一步設及用于制備重組人腦利鋼膚的易于高效表達的融合標簽蛋白。
【背景技術】
[0002] 腦利鋼膚化rainnatriureticP巧tide,BNP)又稱B型利鋼膚度-type natriureticpeptide,BNP)，是繼屯、鋼膚（ANP)后利鋼膚系統(tǒng)的又一成員，于1988年首先 在豬腦中被發(fā)現(xiàn)，隨后的研究發(fā)現(xiàn)腦利鋼膚主要在屯、室屯、肌中合成并分泌，可W促進排鋼、 排尿，舒張血管，具有較強的抗血管平滑肌細胞及內皮細胞的增殖作用，并能對抗腎素一血 管緊張素一醒固酬系統(tǒng)（RAA巧的縮血管作用，對人體水和電解質的平衡，屯、血管、內分泌 系統(tǒng)的調節(jié)起著重要作用。
[0003] 人腦利鋼膚是由32個氨基酸組成的多膚片段，分子量約為3. 4kDa，在屯、肌細胞 內首先合成其激素原前體，經裂解去除一個26氨基酸的信號膚，化含108氨基酸的激素前 體proBNP形式分泌至細胞內，并裂解成為無活性的N末端（NT-BN巧和有活性的BNP(含 32個氨基酸的C端片段）。2001年8月美國SCI0S公司生產的基因重組人腦利鋼膚 (recombinanthumanBNP，rhBNP)-Nesiritide上市，成為新一代靜脈注射用治療失代償性 屯、力衰竭的藥物。2005年，中國成都諾迪康生物制藥有限公司研制的治療用生物制品1類 新藥，重組人腦利鋼膚上市，商品名：新活素。用于患有休息或者輕微活動時呼吸困難的急 性失代償性屯、力衰竭患者靜脈治療，按紐約核屯、協(xié)會（NYHA)分級大于II級。
[0004] 腦利鋼膚的制備主要有化學合成法和基因工程法，其中化學合成腦利鋼膚成本 高、價格昂貴，產業(yè)化困難。用基因重組技術生產的人腦利鋼膚是解決運個問題的有效途 徑。常規(guī)大腸桿菌表達外源蛋白常會導致目標蛋白在胞內積累而限制其表達量。大都在胞 內積累，易形成包涵體。包涵體復性過程復雜，技術難度大，得率低，生產成本高，往往不能 應用于工業(yè)化生產。另外，多膚因其分子小，直接表達存在困難，一般需要采用融合表達技 術。目前研究采用的融合表達分為自身串聯(lián)融合表達和與其它載體蛋白融合表達兩種。如 果融合標簽選擇不當，仍不能實現(xiàn)可溶表達，且表達量不高。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于制備重組人腦利鋼膚的易于高效表達的融合標 簽蛋白，該融合標簽蛋白包括來源于大腸桿菌化sB或其片段，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2 所示，其核巧酸序列如SEQIDNO. 3所示。該融合標簽蛋白還包括：轉錄終止抗終止因子 (NusA)，或者大腸桿菌硫氧還蛋白AarxA)，或者二硫鍵氧化還原酶值sbA、化bC)，或者谷 脫甘膚S-轉移酶（GST)。所述融合標簽蛋白能促進重組人腦利鋼膚的可溶高效表達，且不 影響重組人腦利鋼膚的生物活性。
[0006] 包含重組人腦利鋼膚的融合蛋白，上述融合標簽蛋白通過包含酶切位點的接頭融 合至所述人腦利鋼膚的N端，重組人腦利鋼膚的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.4所 示，其核巧酸序列如SEQIDNO. 5所示。
[0007] 所述接頭還包含柔性連接膚-(GG巧n-、組氨酸標簽或其組合，所述柔性連接膚的 氨基酸序列為-HHHH皿GGS孤孤K-。
[0008] 本發(fā)明還提供一種優(yōu)化重組人腦利鋼膚的核酸分子，該核酸分子的核巧酸序列如 沈QIDNO. 1所示。
[0009] 本發(fā)明還提供一種用于表達重組人腦利鋼膚的融合蛋白的載體，所述表達載體為 pET系列載體，優(yōu)選祀T-28a-c(+)，或者祀T29a，或者祀T-30a-c(+)，或者祀T39b(+)，或者 pET-40b(+)，或者祀T-41a(+)，或者祀T-43.la(+)。
[0010] 本發(fā)明還提供一種宿主菌，該宿主菌其能夠表達包含上述融合標簽和重組人腦利 鋼膚的融合蛋白。該宿主菌為細菌或真菌，優(yōu)選地為大腸桿菌，該大腸桿菌為化21 0E3)，或 者化21 0E3)PlysS，或者TB1，較好的是大腸桿菌為化21 0E3)。
[0011] 重組人腦利鋼膚的制備方法，包括如下步驟：
[0012] 1)上述的融合標簽蛋白通過包含酶切位點的接頭融合至核巧酸序列如SEQID NO:1所示的人腦利鋼膚的N端，得到融合蛋白核酸序列；
[0013] 2)將步驟1)所獲得的核酸序列克隆至表達載體構建重組載體；
[0014] 3)培養(yǎng)能夠表達權利要求3所述的融合蛋白的宿主菌，將步驟2)所述的重組載體 用化學轉染法轉化至宿主菌.
[0015] 4)誘導轉化后的宿主菌表達重組人腦利鋼膚；
[0016]5)純化重組人腦利鋼膚。
[0017] 步驟3)所述的表達是將步驟3)所述的融合蛋白被分泌到宿主菌的周質空間或者 在宿主細胞的胞內表達。
[0018] 步驟5)所述的純化是從所述宿主菌的培養(yǎng)物中回收權利要求3所述的融合蛋白， 對回收的融合蛋白進行酶切，并從酶切產物中回收重組人腦利鋼膚。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是：
[0020] 通過接頭將融合標簽融合至人腦利鋼膚N端形成融合蛋白，進行融合表達，利用 純化手段將產物完全分離，實現(xiàn)了腦利鋼膚的可溶、高效表達。
[0021] 通過接頭序列-HHHH皿GGS孤孤K-實現(xiàn)融合表達，其包含柔性連接膚-(GG巧n-，使 得融合標簽未對目的蛋白結構發(fā)生影響，產物具有生物活性；包含組氨酸標簽，利于純化， 提高收率；包含腸激酶位點-孤孤K-，使得融合標簽被有效去除，最終獲得的重組人腦利鋼 膚的N端序列與天然序列完全一致。
[0022] 對編碼人腦利鋼膚的核巧酸序列進行優(yōu)化，同時選擇的融合標簽為可W在宿主細 胞，尤其是大腸桿菌中實現(xiàn)高效表達的化sB或其片段，使得重組人腦利鋼膚高效、可溶表 達。
[0023] 利用本發(fā)明的方法制備重組人腦利鋼膚融合蛋白為可溶表達，表達量大于菌體總 蛋白的20 %。最終重組人腦利鋼膚得率為lOOmg純品/L發(fā)酵液，純度大于96 %，生物活性 與陽性對照藥物一致，內毒素小于祀U/mg。制備的重組人腦利鋼膚，用于治療急性失代償屯、 力衰竭。
[0024] 本發(fā)明利用大腸桿菌化sB作為融合標簽，可高效促進hBNP可溶表達，避免了包涵 體復性，降低生產成本，能夠滿足工業(yè)化生產的需求。
[0025] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，W下結合附圖及實施例，對 本發(fā)明進一步詳細說明。應當理解，此處說描述的具體實施例僅用W解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明構建的表達質粒祀T30-a(+)-hBNP的結構圖；
[0027] 圖2為本發(fā)明構建的祀T30-a(+)-hBNP/BL21 〇)E3)工程菌搖瓶誘導篩選結果；
[0028] 圖3為RP-HPLC檢測結果，純度大于98%;
[0029] 圖4為rhBNPN端氨基酸序列檢測結果；
[0030] 圖5-1、5-2為rhBNP高分辨率質譜分子量檢測結果；
[0031] 圖6-1、6-2、6-3為rhBNP二硫鍵鑒定結果；
[0032] 圖7為rhBNP生物活性測定結果。
【具體實施方式】
[0033] 實施例1重組人腦利鋼膚融合蛋白工程菌構建
[0034] 1、祀T30-a(+)-hBNP/BL2UDE3)工程菌構建
[0035] 人腦利鋼膚成熟蛋白序列（GenBank登錄號：NP_002512. 1)為32個氨基酸，人腦 利鋼膚基因序列如SEQIDNO. 1所示。
[0036] 標簽蛋白選取來源于大腸桿菌化sB全序列（GenBank登錄號：BAA15575. 2);所述 融合標簽蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示，其核巧酸序列如SEQIDNO. 3所示。
[0037] 設計街頭序列為-HHHH皿GGS孤孤K-、對應的核酸序列為CACCATCATCATCATCATGGT GGTTCTGACGACGACGACAAG作為接頭，通過接頭將上述化sB標簽蛋白C端與人腦利鋼膚成熟 蛋白序列N端連接，所獲融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 4所不，該融合蛋白的核酸序 列如沈QIDNO. 5所示。
[0038] 將設計的融合蛋白核酸序列（SEQIDNO. 5)委托南京金斯瑞生物科技有限公司 進行全基因合成，并通過Ndel/Notl位點亞克隆至表達載體，其載體選自商業(yè)化（即市 售，下同）載體祀T-28a-c(+)，或者祀T29a，或者祀T-30a-c(+)，或者祀T39b(+)，或者 pET-4化(+)，或者祀T-41a(+)，或者祀T-43.la(+)，載體的宿主細胞為細菌或真菌，所述宿 主細胞為大腸桿菌，選自商業(yè)化菌株化21 0E3)，或者化21 0E3)PlysS，或者TB1。本實施例 采用大腸桿菌表達載體祀T30-a(+)，構建獲得表達載體祀T30-a(+)-hBNP，構建示意圖如 圖1所示。
[0039]將構建的表達載體用化學轉染法，轉入大腸桿菌表達宿主菌化21值E3)，利用 LB+kan固體平板篩選，獲得重組表達工程菌祀T30-a(+)-hBNP/BL21 〇)E3)。
[0040] 2、工程菌誘導篩選
[0041] 隨機挑取上述祀T30-a(+) -hBNP/BL21 〇)E3)工程菌接種至10mlLB培養(yǎng)基 (lOOug/mlkan)，100ml錐形瓶培養(yǎng)，37°C22化pm搖床培養(yǎng)過夜。第二天取過夜培養(yǎng)的母液 按1 %比例轉接于40mlLB液體培養(yǎng)基（lOOug/mlkan)，在250ml錐形瓶中，37°C，220;