一種重組活性肽及其同步制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域，特別設(shè)及一種重組活性膚及其同步制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物活性膚一般蘊(yùn)藏于母體蛋白序列內(nèi)，并不具備生物活性，但通過體內(nèi)或體外 蛋白酶或食品加工處理被釋放后即可在體內(nèi)行使生理功能。目前，功能活性膚主要是通過 酶法水解蛋白原料進(jìn)行制備。目前已有不少酶解法制備降血壓膚和抗氧化膚的專利報道。 相對生物提取法、化學(xué)降解法和化學(xué)合成法，酶解法具有產(chǎn)品安全性高、生產(chǎn)條件溫和，對 蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值破壞小等優(yōu)勢。但是，目前國內(nèi)市場上出現(xiàn)的相關(guān)活性膚產(chǎn)品基本上是W 活性較低的復(fù)合膚產(chǎn)品形式出現(xiàn)，如大豆膚、玉米膚、膠原蛋白膚等，功能專一性不強(qiáng)，且產(chǎn) 品活性有待進(jìn)一步的提高。
[0003] 目前已有大量"通過常規(guī)分離手段純化高純活性膚"的專利報道，盡管研究者們鑒 定出的某些膚段顯示出極強(qiáng)的生理活性，如IPP、VPP、IKW、LHP等降血壓膚和YHY、PHH、YKY、 YPPAK、皿HPVC等抗氧化膚，但由于蘊(yùn)藏于母體蛋白序列中的有效活性膚段比例低，導(dǎo)致酶 解后期的低產(chǎn)率和高分離成本，除了極少數(shù)活性膚段（IPP、VPP等）有產(chǎn)品問世外，大多數(shù) 高活性功能膚并沒有得到有效開發(fā)利用。
[0004] 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用DNA重組技術(shù)，將表達(dá)活性膚的基因克隆到某些 微生物或動物體內(nèi)，通過生物體直接表達(dá)出所需膚類，可大大增加其產(chǎn)量和純度。目前，有 關(guān)"利用基因工程菌制備活性膚"的專利報道已呈逐年增多的趨勢。盡管利用基因工程技 術(shù)制備高活性短膚已取得了技術(shù)上的突破，但活性膚多聚體的基因設(shè)計、表達(dá)效率及下游 分離工藝有待進(jìn)一步的完善。
[0005] 近年來，細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究表明人體內(nèi)除了具有升壓物質(zhì)及系統(tǒng) 夕b尚具有許多內(nèi)源性減壓物質(zhì)及系統(tǒng)，W維持血壓的相對穩(wěn)定。有研究證實降血壓膚與抗 氧化膚在體內(nèi)具有不同的作用祀點、不同的干預(yù)系統(tǒng)及不同的作用機(jī)制，但對高血壓及相 關(guān)屯、血管疾病的預(yù)防與控制具有積極效應(yīng)。許多研究發(fā)現(xiàn)，多種功效因子聯(lián)合作用比單一 組分具有更好的效果，即呈現(xiàn)協(xié)同作用，其作用可能源于具有不同作用機(jī)制的功效因子之 間存在明顯的互補(bǔ)作用或相互修復(fù)作用。因此，如果將降血壓膚和抗氧化膚聯(lián)合應(yīng)用于屯、 血管疾病的預(yù)防與控制，將會起到良好的效果。已有不少研究報道了通過酶解法同步制備 降血壓膚與抗氧化膚的相關(guān)報道。但是，目前尚無"利用基因工程菌同步制備降血壓膚和抗 氧化膚"的報道。
[0006]目前，缺乏一種高體內(nèi)活性、低成本的重組活性膚及其同步制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種高體內(nèi)活性、低成本的重組活性膚及其同步制備方法。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種重組活性膚，所述重組活性膚是由活性膚單體疊加 或定向串聯(lián)而成的，所述活性膚單體包括降血壓膚單體和抗氧化膚單體，其氨基酸序列如 序列表 SEQ ID NO ;1。
[0009] 本發(fā)明的一種編碼所述的重組活性膚的核巧酸序列如序列表SEQ ID NO ;2。
[0010] 進(jìn)一步地，所述的抗氧化膚單體有 DT皿、YPIL、FLEPDY、YLEPFR、YLEPDY、YDEPEW、 HYRPFW、Y EPDY 和 IWAPFY ;所述降血壓膚單體有 MRW、WIR、IRA、AMK、MKR、RGY、VAW、DGL、 IPP、IKP、IKPFR、IKPVA、AKF、IW、VAF、VSV、IQY 和 IVY。
[0011] 進(jìn)一步地，所述活性膚單體部分膚段的N末端為胃蛋白酶酶切位點；所述活性膚 單體部分膚段的C末端為胃蛋白酶或膜蛋白酶或膜凝乳蛋白酶酶切位點；所述重組降血壓 膚和抗氧化膚中部分活性膚單體之間由帶有胃蛋白酶或膜蛋白酶或膜凝乳蛋白酶酶切位 點的連接片段串聯(lián)而成。
[0012] 本發(fā)明同步制備所述的重組活性膚的方法，包括如下步驟：
[001引 （1)人工合成序列表SEQ ID NO ;2所示的基因；
[0014] (2)構(gòu)建能高效表達(dá)與純化重組降血壓膚和抗氧化膚的表達(dá)載體；
[0015] (3)用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌構(gòu)建基因工程菌；
[0016] (4)利用所述工程菌表達(dá)重組活性膚；
[0017] (5)利用標(biāo)簽純化及標(biāo)簽去除技術(shù)獲取重組活性膚；
[001引 （6)采用胃蛋白酶和/或膜蛋白酶和/或膜凝乳蛋白酶酶解制得降血壓膚和抗氧 化膚。
[0019] 進(jìn)一步地，在步驟（2)中，所述表達(dá)載體為祀T28a，宿主菌為大腸桿菌E.coli 化2UDE3)。
[0020] 進(jìn)一步地，在步驟（2)中，采用DNA重組技術(shù)，將序列表SEQ ID NO ;2所示的基因 插入祀T28a的Hindlll和化〇1位點中，并分別在基因的上游的化〇1和BamHI位點W及 和Hindlll位點克隆入類彈性蛋白純化標(biāo)簽化Ps基因和卻M0融合標(biāo)簽基因，獲得重 組表達(dá)載體祀T28a-ESA3。
[002。 更進(jìn)一步地，在步驟（3)中，并轉(zhuǎn)化E. coli化21 0E3)，獲得工程菌；
[0022] 在步驟（4)中，利用IPTG誘導(dǎo)工程菌表達(dá)ELPS-SUM0-A3,收集菌體，超聲破碎細(xì) 胞，收集超聲上清或包涵體沉淀；
[0023] 在步驟巧）中，對于可溶表達(dá)的如序列表SEQ ID NO ;1所示的目標(biāo)蛋白直接進(jìn)行 標(biāo)簽技術(shù)純化，而對包涵體表達(dá)的目標(biāo)蛋白先進(jìn)行變性與復(fù)性再進(jìn)行標(biāo)簽技術(shù)純化；通過 ELPs標(biāo)簽純化技術(shù)純化融合蛋白W及采用SUMO蛋白酶裂解及加鹽離屯、去除二聯(lián)體融合標(biāo) 簽ELPs-SUMO,獲得重組活性膚；
[0024] 在步驟化）中，采用胃蛋白酶、膜蛋白酶和膜凝乳蛋白酶酶解重組活性膚，超濾得 小膚混合體，再脫鹽去雜，冷凍干燥樣品，質(zhì)檢制得活性膚。
[0025] 本發(fā)明所述的重組活性膚在制備治療高血壓藥中的應(yīng)用。
[0026] 有益效果；本發(fā)明成本低，獲得的重組多膚中的活性小膚能被胃蛋白酶、膜蛋白酶 及膜凝乳蛋白酶有效釋放，制得的活性膚混合體具有高體內(nèi)降壓活性及抗氧化活性。本發(fā) 明終產(chǎn)品小膚混合物協(xié)同降壓的同時能改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，多角度預(yù)防與維護(hù)屯、血管 健康；本發(fā)明重組菌可W通過微生物發(fā)酵進(jìn)行工業(yè)放大，具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明具有 如下優(yōu)點：
[0027](1)重組活性小膚混合物是指采用基因工程技術(shù)和生化分離技術(shù)研發(fā)生產(chǎn)的小 膚、長度為2個到10多個氨基酸，所述小膚混合物具有強(qiáng)效的體內(nèi)降血壓功能和抗氧化功 能，對屯、血管疾病具有積極的預(yù)防與控制效果。
[002引 （2)本發(fā)明提供了一種同步生產(chǎn)降血壓膚和抗氧化膚的新方法W及由此所產(chǎn)生的 由高活性降血壓膚和抗氧化膚所組成的小膚混合物。應(yīng)用DNA重組技術(shù)，通過基因工程菌 發(fā)酵法來制備。提供了可供酶解釋放的高活性降血壓膚和抗氧化膚串聯(lián)的方法，同時提供 了所設(shè)計活性膚前體多膚及能穩(wěn)定表達(dá)的優(yōu)化基因。還提供克隆有編碼重組多膚的寡核巧 酸序列的表達(dá)載體祀T28a-ESA3及其轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌。
[002引 做本發(fā)明方法能同步有效富集高活性降血壓膚和抗氧化膚，提高活性膚產(chǎn)率，提 高活性膚單位摩爾作用強(qiáng)度；本發(fā)明重組降血壓膚和抗氧化膚的酶解液無需純化或經(jīng)簡單 的膜過濾處理后即可直接應(yīng)用；本發(fā)明中的活性膚多聚體中的活性膚單體可W根據(jù)需要進(jìn) 行刪減，活性膚單體的順序也可W根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。
[0030] (4)本發(fā)明中應(yīng)用了降壓活性或抗氧化活性較高的膚段作為連接片段，例如本發(fā) 明中N末端為芳香族氨基酸（F/Y)、C末端為芳香族氨基酸W及C端倒數(shù)第S位氨基酸為 Pro的六膚，如FLEPDY、YLEPDY、YDEPEW，其C末端和N末端均易于被胃蛋白酶切割釋放；例 如本發(fā)明中N末端為脂肪族氨基酸W及C末端為堿性氨基酸的IER、VEK、IEK、I犯R，所述膚 的C末端易于膜蛋白酶的釋放，同時將下游緊鄰活性膚的N末端游離出來。
[0031] (5)本發(fā)明重組降血壓膚和抗氧化膚中的部分或全部活性膚單體能被胃蛋白酶、 膜蛋白酶、膜凝乳蛋白酶、膜酶中的一種或多種酶酶切釋放。本發(fā)明制得的終產(chǎn)品小膚混合 物中含有多膚氨基酸序列所能用胃腸消化酶酶解產(chǎn)生的任何膚段，優(yōu)先含有根據(jù)權(quán)利要求 3中所述活性膚單體W及具有顯著降壓活性和/或抗氧化活性的膚段。本發(fā)明的重要步驟 設(shè)及活性膚多聚體及其相應(yīng)基因的設(shè)計與優(yōu)化，重組降血壓膚和抗氧化膚表達(dá)載體及工程 菌的構(gòu)建，重組降血壓膚和抗氧化膚的表達(dá)及純化，W及重組降血壓膚和抗氧化膚中活性 降血壓膚和抗氧化膚的酶解釋放。
【附圖說明】
[0032] 圖1為本發(fā)明所構(gòu)建重組質(zhì)粒示意圖；
[0033] 圖2為本發(fā)明的重組質(zhì)粒PCR鑒定示意圖；
[0034] 圖3為本發(fā)明的重組質(zhì)粒的雙酶切鑒