專利名稱：重組抗菌肽rCrustinI的酵母發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組抗菌肽rCrustinl的酵母發(fā)酵生產(chǎn)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
中國(guó)是全球最大的水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，水產(chǎn)品總產(chǎn)量(捕撈+養(yǎng)殖)占全球35%，其中水產(chǎn)品養(yǎng)殖產(chǎn)量約占全球的70%，2005年水產(chǎn)品產(chǎn)量達(dá)5181萬(wàn)噸。其中海水產(chǎn)品2854萬(wàn)噸，占總產(chǎn)量的55%，捕撈約1022萬(wàn)噸，人工養(yǎng)殖產(chǎn)品約1888萬(wàn)噸。隨著全球?qū)λa(chǎn)品的消費(fèi)逐年增加，國(guó)內(nèi)消費(fèi)增長(zhǎng)勢(shì)頭迅猛，另一方面全球海洋捕撈資源衰退，供給逐步轉(zhuǎn)向以養(yǎng)殖水產(chǎn)品為主，中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在全球消費(fèi)中越來(lái)越重要。人工養(yǎng)殖比例逐年提高，1978年人工養(yǎng)殖比例占26%，2005年人工養(yǎng)殖比例達(dá)61%。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，由于 高密度養(yǎng)殖、養(yǎng)殖水域富營(yíng)養(yǎng)化、生態(tài)環(huán)境惡化等原因使得水產(chǎn)養(yǎng)殖品種頻頻發(fā)生各種疾病，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，已成為21世紀(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要制約因素。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，目前危害水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的病害已達(dá)400 500種，大多數(shù)病害是由病毒、細(xì)菌、真菌等微生物所引起的。而傳統(tǒng)的抗微生物藥物及飼料添加劑——抗生素，由于耐藥性病原菌的形成，以及食品安全性等公共衛(wèi)生上問題的提出，目前在世界各國(guó)養(yǎng)殖業(yè)中的使用都受到嚴(yán)格限制，如歐盟自2006年I月I日起，全面禁止食品動(dòng)物使用抗生素促生長(zhǎng)飼料添加劑，因此尋找安全的抗生素替代物、開發(fā)安全高效的新型抗微生物免疫增強(qiáng)劑或能增強(qiáng)養(yǎng)殖品種機(jī)體免疫力的飼料添加劑成為研究的熱點(diǎn)，也是我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)、飼料行業(yè)健康、持續(xù)發(fā)展首要解決的課題之一 O近年來(lái)，隨著對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的自身免疫機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體液中富含多種體液免疫因子如凝集素、防御素、抗菌肽及多種行使調(diào)控作用的蛋白因子等。養(yǎng)殖品種自身來(lái)源的體液免疫因子由于其特殊的作用機(jī)制，不存在食品安全問題與環(huán)境問題，并對(duì)養(yǎng)殖品種具有促生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫力的功能，還可通過基因工程技術(shù)大量發(fā)酵生產(chǎn)，不存在藥源問題，成為替代傳統(tǒng)抗生素作為綠色飼料添加劑及抗感染藥劑的理想選擇，是當(dāng)前飼料添加劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)?？咕腃rustins最早由Relf等在青蟹(Carcinus maenas)中分離鑒定,后續(xù)研究表明Crustins普遍存在于甲殼類(蟹、對(duì)蝦、龍蝦、螯蝦等)中，主要由甲殼類血淋巴細(xì)胞合成，分子量7 14kDa，等電點(diǎn)pi 7. O 8. 7。現(xiàn)有研究表明Crustins—般均有較好的抗菌活性。例如Relf等報(bào)道濱蟹Carcinin對(duì)龍奸致病菌A. viridans var homari、兩株海洋菌Planococcus spp.和一株耐鹽菌M. Iuteus均具有抗菌活性；Supungul P等(2008)報(bào)道重組斑節(jié)對(duì)蝦Crustin (D766060)對(duì)S. aureus、S. iniae有很強(qiáng)的抑菌活性而對(duì)A. viridans、M. Iuteus無(wú)效,但重組斑節(jié)對(duì)奸II型Crustins (EF654658)對(duì)G+菌和G-菌均有很強(qiáng)的抗菌活性，包括A. viridans var homari以及另兩種致病G-菌E. coli 363、V. harveyi ；Haug等(2006)報(bào)道蜘蛛蟹Crustins對(duì)谷氨酸棒桿菌C. glutamicum的半致死濃度為3mM ；Zhang (2007)等報(bào)道中國(guó)對(duì)奸重組Crustins對(duì)S. aureus、M. Iuteus及三種Bacillus的半致死濃度為2 8mM。在前期研究中，我們從三撫梭子蟹(Portunus trituberculatus)血細(xì)胞克隆了一個(gè)I型Crustin基因，并構(gòu)建了真核表達(dá)載體pVT102U/ a -rCrustinl，轉(zhuǎn)化釀酒酵母S18菌株得到表達(dá)重組抗菌肽rCrustinl的基因工程酵母菌[見申望，葉茂，石戈，王日昕，2010，三撫梭子蟹(Portunus trituberculatus) I型Crustin抗菌肽的基因克隆與真核重組表達(dá)，海洋與湖沼，41 (3) :371-377]，但目前還沒就三疣梭子蟹I型Crustin抗菌肽基因轉(zhuǎn)化釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)重組抗菌肽rCrustinl的方法及重組抗菌肽rCrustinl純化制備技術(shù)有公開文獻(xiàn)出版。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)上述的技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種操作簡(jiǎn)單、成本經(jīng)濟(jì)的重組抗菌肽rCrustinl的酵母發(fā)酵生產(chǎn)方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種重組抗菌肽rCrustinl的酵 母發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于包括如下步驟①種子培養(yǎng)凍存的含重組真核表達(dá)載體pVT102U/ a -crustin的釀酒酵母工程菌菌種劃YSD選擇培養(yǎng)基平板，挑取單菌落轉(zhuǎn)接于YSD液體培養(yǎng)基中，250C，250rpm培養(yǎng)24h得到一級(jí)種子，再將一級(jí)種子繼續(xù)在YSD培養(yǎng)液中，25°C，250rpm擴(kuò)大培養(yǎng)48h，得到二級(jí)種子；②發(fā)酵罐培養(yǎng)按1%的接種量將二級(jí)種子液接種于發(fā)酵罐的Yro培養(yǎng)液中，初始發(fā)酵參數(shù)攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，通氣量為1V/V ·π η，罐壓O. 05MPa，溫度25°C，pH 6. 5，通過調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量及罐壓，使發(fā)酵過程中DO值維持在20 35%，培養(yǎng)3天，收集發(fā)酵液；③發(fā)酵液中重組抗菌肽rCrustinl純化制備發(fā)酵液離心后收集上清液，30%飽和度硫酸銨室溫靜置30min，再次離心，沉淀得rCrustinl 粗品。作為優(yōu)選，步驟③中第一次離心速率為4000rpm，離心時(shí)間為lOmin，再次離心速率為IOOOOrpm,離心時(shí)間為lOmin。進(jìn)一步，步驟③還包括得到的rCrustinl粗品先經(jīng)724弱酸性陽(yáng)離子樹脂層析富集，再經(jīng)C18反向高效液相層析得重組抗菌肽rCrustinl純品。進(jìn)一步，所述的724弱酸性陽(yáng)離子樹脂層析富集如下724弱酸性陽(yáng)離子樹脂的預(yù)處理(I)先用清水浸泡并用浮選法除去細(xì)小顆粒，漂洗干凈，濾干；⑵重量百分比為80% 90%工業(yè)乙醇浸泡24h，洗去樹脂內(nèi)的醇溶性有機(jī)物，濾干；(3) 40 45°C的水浸泡2h，洗滌，洗去樹脂內(nèi)的水溶性雜質(zhì)和乙醇，濾干；(4)用4倍樹脂量的2mol/L鹽酸溶液浸泡2h，攪拌，洗去酸溶性雜質(zhì)，水洗至中性，濾干；(5)用4倍樹脂量的2mol/L氫氧化鈉溶液浸泡2h，攪拌，洗去堿溶性雜質(zhì)；(6)用4倍樹脂量的O. 02mol/L pH 6. 5PBS緩沖液浸泡24h平衡樹脂，濾干待用；724弱酸性陽(yáng)離子樹脂層析富集rCrustinl : (I)吸附將經(jīng)過預(yù)處理的724弱酸性陽(yáng)離子樹脂加入rCrustinl粗品PBS溶液中，樹脂加入量為低于液面，完全被溶液浸泡，攪拌，4°C過夜吸附，抽濾，PBS緩沖液洗滌2次；(2)裝柱在濾干的樹脂中加入I倍體積的PBS緩沖液，邊攪拌邊倒入層析柱內(nèi)，讓樹脂自然沉降；(3)淋洗0. 02mol/LpH 6. 5PBS緩沖液充分淋洗柱內(nèi)樹脂，并使檢測(cè)儀基線平穩(wěn)，徹底除去不被吸附的雜質(zhì)；(4)洗脫先以含O. IM NaCl的PBS緩沖液洗脫雜質(zhì)，再以含O. 5M NaCl的PBS洗脫進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰；
(5)凍干將洗脫峰凍干，凍干后的樣品重溶于蒸餾水中。進(jìn)一步,所述的C18反向高效液相層析如下GraceSmart RP 18色譜柱按照柱子所標(biāo)示方向?qū)⑸V柱與色譜儀連接,用含5 %乙腈的去離子水沖洗色譜柱30min至壓力平衡，將重組抗菌肽rCrustinl溶液上樣，5% -95%乙腈梯度洗脫，收集洗脫峰，凍干、水溶，保留有抑菌活性峰樣品?？咕V的測(cè)定與最小抑菌濃度的測(cè)定本發(fā)明從釀酒酵母工程菌發(fā)酵液中純化出有抑菌活性的重組抗菌肽rCrustinl。 抗菌譜測(cè)定采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法，受試菌種有3種革蘭氏陽(yáng)性菌(G+):藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌；6種革蘭氏陰性菌(G_):大腸桿菌、副溶血弧菌、鰻弧菌、哈維式弧菌、溶藻弧菌、綠膿桿菌。重組抗菌肽rCrustinl抑菌實(shí)驗(yàn)表明rCrustinI對(duì)受試的3種G+菌均有抑菌活性；在G—菌中，對(duì)副溶血弧菌、哈維式弧菌、鰻弧菌有抑菌活性，而對(duì)綠膿桿菌、大腸桿菌、溶藻弧菌則未檢測(cè)到抑菌活性。結(jié)論重組抗菌肽rCrustinl具有廣譜抗菌活性。采用液體生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)定rCrustinl對(duì)以上6種敏感菌最小抑菌濃度。結(jié)果表明重組rCrustinl對(duì)枯草芽孢桿菌活性最強(qiáng)，最小抑菌濃度(MIC)為O. 36uM，對(duì)其它5種菌藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、哈維式弧菌、鰻弧菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為 O. 74uM、0. 74uM、l. 48uM、2. 96uM、2. 96uM。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于整個(gè)生產(chǎn)工藝操作簡(jiǎn)單，成本較低，得到重組抗菌肽rCrustinl可用于制作飼料添加劑、化妝品、保鮮劑和醫(yī)藥產(chǎn)品，具有廣泛用途和良好的經(jīng)濟(jì)效益。


圖I為重組抗菌肽rCrustinl非還原性SDS-PAGE電泳。圖2為重組抗菌肽rCrustinl對(duì)藤黃微球菌的抑制活性試驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。I.工程菌發(fā)酵培養(yǎng)I. I種子培養(yǎng)將保存的含重組真核表達(dá)載體pVT102U/ a -crustin的釀酒酵母工程菌菌種劃YSD 選擇培養(yǎng)基(YSD 培養(yǎng)基Yeast Nitrogen Base 6. 7g, Glucose 20g, Leucine 200mg,AdeninelOOmg, Inositol 200mg，溶解于 IL ddH20 中，NaOHi周 pH 值為 6. 5)平板，25°C恒溫培養(yǎng)72h，挑取單克隆菌落轉(zhuǎn)接于5iriYSD液體培養(yǎng)基中，250C，250rpm培養(yǎng)24h，制成一級(jí)種子。再將一級(jí)種子接種于ILYSD培養(yǎng)液中，25°C，250rpm培養(yǎng)48h，每隔Ih取樣檢測(cè)A600值，并繪制生長(zhǎng)曲線，以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中后期作為二級(jí)種子的培養(yǎng)時(shí)間。1.2發(fā)酵罐培養(yǎng)
按I %的接種量將二級(jí)種子液接種于滅菌的盛有5L YPD發(fā)酵培養(yǎng)液(YPD液體培養(yǎng)基Yeast extract 10g, Peptone 20g, Glucose 20g,溶解于 IL ddH20 中，NaOH 調(diào) pH 值為6. 5)的IOL發(fā)酵罐中，設(shè)定初始發(fā)酵參數(shù)攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm，通氣量為I (V/V · min)，罐壓為O. 05MPa，溫度為25°C，控制恒定pH6. 5，通過調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量及罐壓使DO值維持在20 35%,培養(yǎng)3天,基因工程酵母表達(dá)重組抗菌肽rCrustinl并將rCrustinl分泌到發(fā)酵液中。在發(fā)酵過程中，每隔6h取少量發(fā)酵液上清液，采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法，以藤黃微球菌為指示菌，監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中rCrustinl的表達(dá)量。2.發(fā)酵液中重組抗菌肽rCrustinl純化2. I硫酸銨沉淀發(fā)酵液4000rpm離心IOmin收集上清液,在上清液中加入固體硫酸銨粉末至30%飽和度，攪拌、室溫靜置30min, IOOOOrpm離心IOmin收集沉淀,該沉淀為rCrustinl粗品。30%硫酸銨飽和度對(duì)發(fā)酵液中rCrustinl的沉淀效率經(jīng)檢驗(yàn)可達(dá)100%,rCrustinl粗品重 溶于O. 02mol/L pH 6. 5磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)。2. 2 724弱酸性陽(yáng)離子樹脂層析富集rCrustinl724弱酸性陽(yáng)離子樹脂的預(yù)處理⑴先用清水浸泡并用浮選法除去細(xì)小顆粒，漂洗干凈，濾干；(2)工業(yè)乙醇(80% 90% )浸泡24h，洗去樹脂內(nèi)的醇溶性有機(jī)物，濾干；
(3)熱水(40 45°C )浸泡2h，洗滌數(shù)次，洗去樹脂內(nèi)的水溶性雜質(zhì)和乙醇，濾干；(4)用4倍樹脂量的2mol/L鹽酸溶液浸泡2h，不時(shí)攪拌，洗去酸溶性雜質(zhì)，水洗至中性，濾干；(5)用4倍樹脂量的2mol/L氫氧化鈉溶液，同上處理，洗去堿溶性雜質(zhì)；(6)用4倍樹脂量的O. 02mol/L pH 6. 5PBS緩沖液浸泡24h平衡樹脂，濾干即可使用。弱酸性陽(yáng)離子樹脂層析富集rCrustinl (I)吸附將經(jīng)過預(yù)處理的724弱酸性陽(yáng)離子樹脂加入2. I的rCrustinl粗品PBS溶液中，樹脂加入量為稍低于液面，完全被溶液浸泡為宜,攪拌,4°C過夜吸附，抽濾，少量PBS緩沖液洗滌2次，合并濾液經(jīng)2. I回收未吸附的rCrustinl,減低損耗；(2)裝柱在濾干的樹脂中加入I倍體積的PBS緩沖液,邊攪拌邊倒入層析柱內(nèi)，讓樹脂自然沉降；(3)淋洗0. 02mol/L pH 6. 5PBS緩沖液充分淋洗柱內(nèi)樹脂，并使檢測(cè)儀基線平穩(wěn)，徹底除去不被吸附的雜質(zhì)；(4)洗脫先以含O. IM NaCl的PBS緩沖液洗脫雜質(zhì)，再以含O. 5M NaCl的PBS洗脫進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰；(5)凍干將洗脫峰凍干，凍干后的樣品重溶于蒸餾水中；(6)活性監(jiān)測(cè)以藤黃微球菌為指示菌檢測(cè)洗脫峰的抑菌活性。2. 3 C18反相層析純化重組抗菌肽rCrustinl色譜柱的預(yù)處理GraceSmart RP 18色譜柱按照柱子所標(biāo)示方向?qū)⑵渑c色譜儀連接，用含5 %乙腈的去離子水沖洗色譜柱30min至壓力平衡，將2. 2富集的重組抗菌肽rCrustinl溶液上樣，5% -95 %乙腈梯度洗脫，收集洗脫峰，凍干、水溶，以藤黃微球菌為指示菌檢測(cè)每個(gè)洗脫峰的抑菌活性，保留有抑菌活性峰樣品。有抑菌活性峰經(jīng)12. 5%的SDS-PAGE非還原電泳檢測(cè)結(jié)果見附圖1，為單一條帶。3.發(fā)酵液中rCrustinl含量與純化效率的計(jì)算在rCrustinl純化過程中，30 %飽和度硫酸銨沉淀與C18反相層析2步?jīng)]有檢測(cè)到抗菌活性成份丟失，而724弱酸性陽(yáng)離子樹脂層析富集rCrustinl過程中有rCrustinl吸附不完全現(xiàn)象，故發(fā)酵液中rCrustinl含量的推算以30 %飽和度硫酸銨沉淀后直接C18反相層析純化的rCrustinl量為準(zhǔn)；純化效率則以經(jīng)30%飽和度硫酸銨沉淀、724弱酸性陽(yáng)離子樹脂富集、C18反相層析純化出rCrustinl量除以發(fā)酵液中rCrustinl總量計(jì)算。蛋白質(zhì)溶液濃度的測(cè)定使用Bradford法，最終推算出發(fā)酵液中rCrustinl含量為I. 087mg/L,純化效率為92%。4.抗菌譜的測(cè)定與最小抑菌濃度的測(cè)定4. I抗菌譜測(cè)定采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法將待測(cè)菌懸液20ul加入到15ml 45°C左右的固體LB培養(yǎng)基中，混勻，倒平板，凝固后在平板上打直徑為6_的小孔，加入待測(cè)的重組表達(dá)產(chǎn)物樣品液4°C放置2h，37°C培養(yǎng)過夜(見圖2所示)。4. 2最小抑菌濃度測(cè)定采用液體生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)定最小抑菌濃度。將重組抗菌肽rCrustinl純品用無(wú)菌水進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋，然后各濃度稀釋后的rCrustinl樣品取20uL置于96孔板中，加入到150uL培養(yǎng)基，再加入20uL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的受試菌液，混勻。對(duì)照組設(shè)2組，空白對(duì)照組 150uL的培養(yǎng)基+20uL rCrustinI+20uL水；陽(yáng)性對(duì)照組150uL的培養(yǎng)基+20uL菌液+20uL水。菌液37°C 150rpm培養(yǎng)12h，自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定0D600，與空白對(duì)照組比較，以含rCrustinl最高稀釋倍數(shù)培養(yǎng)孔中不生長(zhǎng)細(xì)菌者為最小抑菌濃度(MIC)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，計(jì)算重組抗菌肽rCrustinl對(duì)應(yīng)敏感菌的MIC。rCrustinl酵母重組表達(dá)工程菌的制備I.提取三疣梭子蟹血細(xì)胞總RNA健康三撫梭子蟹斷肢采血IOml,加入IOml抗凝劑(抗凝劑NaCl 8. 2g,葡萄糖19.88，檸檬酸6.38，檸檬酸鈉7.68，EDTA 3. 7g，加蒸留水定容至1L，pH 7. 4，121。。滅菌15min), 3000rpm離心 5min,棄上清,用 marine saline洗漆沉淀一次(marine saline NaCl33. 9g, CaCl2 2. 95g, KCl 0. 90g, Na2HPO4 0. 2g, Tris-堿 6. 05g,加水定容至 1L, ρΗ7· 4，121°C滅菌15min)，加入0. 5ml Trizol，按上海生工Trizol試劑盒操作說(shuō)明提取三疣梭子蟹總RNA，提取的總RNA用I %瓊脂糖電泳檢測(cè)。2.克隆三疣梭子蟹I型Crustin成熟肽cDNA帶接頭的RT-PCR 引物上游引物 Xba I crustin :5’_GCTCTAGACAAAAGATCCCTAGTACTTCCATACCCAG-3’ ；下游引物 HindIIIcrustin :5’-CGAAGCTTAAAATCATTAGTAGAAATCAGGAGTCTTGC-3’。RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟按上海捷瑞生物技術(shù)公司AMV —步法RT-PCR試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行:40°C合成 cDNA 30min，94°C預(yù)變性 2min ;94°C變性 15s，60。。退火 30s，72。。延伸 lmin,35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，目的片段割膠回收。3.構(gòu)建分泌型重組表達(dá)載體pVT102U/a-crustinl割膠回收的目的基因和分泌型表達(dá)載體質(zhì)粒pVT102U/a分別用限制性內(nèi)切酶XbaI和HindIII雙酶切，割膠回收酶切片段J4 DNA Ligase連接酶切后的載體和目的基因，連接產(chǎn)物70%乙醇沉淀后干燥，重溶于無(wú)菌去離子水，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑轉(zhuǎn)化成功單克隆，過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。DNA測(cè)序檢驗(yàn)重組表達(dá)載體pVT102U/a -crustinl插入序列的正確性，測(cè)序引物位于pVT102U/a載體多克隆位點(diǎn)上游MF a L區(qū)，Pvtl02Fl 5’ -TAAATACTACTATTGCCAGC-3’。4.制備分泌表達(dá)重組抗菌肽rCrustinl的酵母工程菌制備酵母感受態(tài)細(xì)胞劃釀酒酵母S-78 YPD平板，30°C培養(yǎng)2_3天，挑單克隆于3mL YPD溶液中，30°C 250轉(zhuǎn)/min擴(kuò)大培養(yǎng)12h，以I : 25的比例將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50mLYPD溶液中擴(kuò)大培養(yǎng)，測(cè)OD600在O. 4 O. 6之間，停止培養(yǎng)，4000轉(zhuǎn)/min離心5min收集酵母細(xì)胞，收集的酵母重懸于20mL滅菌ddH20中，4000轉(zhuǎn)/min離心5min棄上清，酵母重懸浮于1.5mL混合溶液中(10XTE，1M LiAC，ddH20，以I : I : 8的體積比混合)，此為酵母感受態(tài)細(xì)胞，備用。重組表達(dá)載體pVT102U/ a -crustinl的轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞pVT102U/a-crustinl 質(zhì)粒 DNA I. O μ g, carrierDNA IOug (鮭魚魚精 DNA),釀酒酵母 S-78 感受態(tài)細(xì)胞懸液20yL，混勻，加PEG溶液(10XTE，1M LiAC，50 % PEG4000，以I : I : 8的體積比混合)I. 5mL,混勻，30°C 200 轉(zhuǎn) /min 培養(yǎng) 30min, 42°C熱擊 15min 后，5000 轉(zhuǎn) /min 離心5min，棄上清，細(xì)胞沉淀用200 μ L I X TE洗滌，5000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清，酵母細(xì)胞重懸浮于200 μ L I XTE溶液中，細(xì)胞懸浮液涂YSD板，30°C培養(yǎng)4-6天。平板上生長(zhǎng)的菌落即為重組抗菌肽rCrustinl的酵母工程菌pVT102U/α。pVT102U/ α 的制作方法還可參看文獻(xiàn)，Vernet, T. D. Dignard, andD. i. Thomas. 1987. A family οι yeast expression vectors containing the phage f'丄 intergenic region. Gene52 :225_233。
權(quán)利要求
1.一種重組抗菌肽rCrustinl的酵母發(fā)酵生產(chǎn)方法,其特征在于包括如下步驟 ①種子培養(yǎng) 凍存的含重組真核表達(dá)載體PVT102U/ a -crustin的釀酒酵母工程菌菌種劃YSD選擇培養(yǎng)基平板，挑取單菌落轉(zhuǎn)接于YSD液體培養(yǎng)基中，25°C，250rpm培養(yǎng)24h得到一級(jí)種子，再將一級(jí)種子繼續(xù)在YSD培養(yǎng)液中，250C，250rpm擴(kuò)大培養(yǎng)48h，得到二級(jí)種子； ②發(fā)酵罐培養(yǎng) 按I %的接種量將二級(jí)種子液接種于發(fā)酵罐的Yro培養(yǎng)液中，初始發(fā)酵參數(shù)攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，通氣量為1V/V · min，罐壓O. 05MPa，溫度25°C，pH 6. 5，使發(fā)酵過程中DO值維持在20 35 %，培養(yǎng)3天，收集發(fā)酵液； ③發(fā)酵液中重組抗菌肽rCrustinl純化制備 發(fā)酵液離心后收集上清液，30%飽和度硫酸銨室溫靜置30min，再次離心，沉淀得rCrustinl 粗品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟③中第一次離心速率為4000rpm，離心時(shí)間為IOmin,再次離心速率為IOOOOrpm,離心時(shí)間為lOmin。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟③還包括得到的rCrustinl粗品先經(jīng)724弱酸性陽(yáng)離子樹脂層析富集，再經(jīng)C18反向高效液相層析得重組抗菌肽rCrustinl 純品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的724弱酸性陽(yáng)離子樹脂層析富集如下 724弱酸性陽(yáng)離子樹脂的預(yù)處理(I)先用清水浸泡并用浮選法除去細(xì)小顆粒，漂洗干凈，濾干；(2)重量百分比為80% 90%工業(yè)乙醇浸泡24h，洗去樹脂內(nèi)的醇溶性有機(jī)物，濾干；(3) 40 45°C的水浸泡2h，洗滌，洗去樹脂內(nèi)的水溶性雜質(zhì)和乙醇，濾干；(4)用4倍樹脂量的2mol/L鹽酸溶液浸泡2h，攪拌，洗去酸溶性雜質(zhì)，水洗至中性，濾干；(5)用4倍樹脂量的2mol/L氫氧化鈉溶液浸泡2h，攪拌，洗去堿溶性雜質(zhì)；(6)用4倍樹脂量的O. 02mol/LpH 6. 5PBS緩沖液浸泡24h平衡樹脂，濾干待用； 724弱酸性陽(yáng)離子樹脂層析富集rCrustinl (I)吸附將經(jīng)過預(yù)處理的724弱酸性陽(yáng)離子樹脂加入rCrustinl粗品PBS溶液中，樹脂加入量為低于液面，完全被溶液浸泡，攪拌，4°C過夜吸附，抽濾，PBS緩沖液洗滌2次；(2)裝柱在濾干的樹脂中加入I倍體積的PBS緩沖液，邊攪拌邊倒入層析柱內(nèi)，讓樹脂自然沉降；(3)淋洗0. 02mol/LpH 6. 5PBS緩沖液充分淋洗柱內(nèi)樹脂，并使檢測(cè)儀基線平穩(wěn)，徹底除去不被吸附的雜質(zhì)；(4)洗脫先以含O. IMNaCl的PBS緩沖液洗脫雜質(zhì)，再以含O. 5M NaCl的PBS洗脫進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰；(5)凍干將洗脫峰凍干，凍干后的樣品重溶于蒸餾水中。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的C18反向高效液相層析如下 GraceSmart RP 18色譜柱按照柱子所標(biāo)示方向?qū)⑸V柱與色譜儀連接,用含5%乙腈的去離子水沖洗色譜柱30min至壓力平衡,將重組抗菌肽rCrustinl溶液上樣,5 % -95 %乙腈梯度洗脫，收集洗脫峰，凍干、水溶，保留有抑菌活性峰樣品。
全文摘要
一種重組抗菌肽rCrustinI的酵母發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于包括如下步驟①種子培養(yǎng)；②發(fā)酵罐培養(yǎng)；③發(fā)酵液中重組抗菌肽rCrustinI純化制備。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于整個(gè)生產(chǎn)工藝操作簡(jiǎn)單，成本較低，得到重組抗菌肽rCrustinI可用于制作飼料添加劑、化妝品、保鮮劑和醫(yī)藥產(chǎn)品，具有廣泛用途和良好的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12R1/865GK102816815SQ20121008828
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月30日
發(fā)明者申望, 石戈, 鄭兆祥, 李鵬 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院