定示意圖；
[003引圖4為SDS-PAGE鑒定重組蛋白包涵體表達示意圖；
[0036] 圖5為SDS-PAGE鑒定重組蛋白純化示意圖；
[0037] 圖6為SDS-PAGE鑒定重組多膚A3純化示意圖；
[0038] 圖7為SDS-PAGE鑒定重組蛋白可溶性表達示意圖。
【具體實施方式】
[0039] 下面將通過具體實施例對本發(fā)明做進一步的具體描述，但不能理解為是對本發(fā)明 保護范圍的限定。
[0040] 實施例1
[0041] 如圖1至圖7所示，圖1為本發(fā)明所構建重組質粒示意圖；圖2為本發(fā)明的重組質 粒PCR鑒定示意圖，泳道M為化10000DNA標樣，泳道1、2、3均為同一 PCR產物（W重組質 粒祀T28a-ESA3 為模板，引物 5' -TTCCTGGAACCGGA-3' 和 5' -CCAAGCCACACGA AAC-3' 為上 下游引物）；圖3為本發(fā)明的重組質粒的雙酶切鑒定示意圖，M為DM Marker,泳道1-5分 別為化0 I/Bam HI、Bam HI/Hind III、Hind IIlAho I、Bam HlAho I、化0 1/化〇 I 雙酶 切產物，泳道6為重組質粒；圖4為SDS-PAGE鑒定重組蛋白包涵體表達示意圖，泳道M為 蛋白標樣，泳道1、2和3分別為誘導后重組菌超聲破碎原液、超聲上清和超聲沉淀；圖5為 SDS-PAGE鑒定重組蛋白純化示意圖，M蛋白質Marker，0透析后的融合蛋白，泳道1、2、3分 別為終濃度1.0、1.5、2.0111〇1/1氯化鋼純化后的融合蛋白；圖6為505斗466鑒定重組多膚 純化示意圖，泳道M為蛋白標樣，泳道1為融合蛋白E1PS-SUM0-A3經SUMO蛋白酶酶解后的 產物，泳道2和3分別為在上述酶解產物中加入終濃度1. Omol/L氯化鋼鹽析后的離屯、上清 和沉淀；圖7為SDS-PAGE鑒定重組蛋白可溶性表達示意圖；泳道M為蛋白標樣，泳道1、2和 3分別為誘導后重組菌超聲破碎原液、超聲上清和超聲沉淀；
[0042] 本發(fā)明的一種重組活性膚，所述重組活性膚是由活性膚單體疊加或定向串聯而 成的，所述活性膚單體包括降血壓膚單體和抗氧化膚單體，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO ;1。
[004引本發(fā)明的一種編碼所述的重組活性膚的核巧酸序列如序列表SEQ ID NO ;2。
[0044]所述的抗氧化膚單體有 DTHK、YPIL、化EPDY、YLEPFR、YLEPDY、YDEPEW、HYRPFW、 Y EPDY 和 IWAPFY ;所述降血壓膚單體有 MRW、WIR、IRA、AMK、MKR、RGY、VAW、D化、IPP、IKP、 IKPFR、IKPVA、AKF、IW、VAF、VSV、IQY 和 IVY。
[0045] 所述活性膚單體部分膚段的N末端為胃蛋白酶酶切位點；所述活性膚單體部分膚 段的C末端為胃蛋白酶或膜蛋白酶或膜凝乳蛋白酶酶切位點；所述重組降血壓膚和抗氧化 膚中部分活性膚單體之間由帶有胃蛋白酶或膜蛋白酶或膜凝乳蛋白酶酶切位點的連接片 段串聯而成。
[0046] 本發(fā)明同步制備所述的重組活性膚的方法，包括如下步驟：
[0047] (1)重組降血壓膚和抗氧化膚及其編碼基因的設計與優(yōu)化；
[004引本發(fā)明的人工合成序列表SEQ ID NO ;2所示的基因；本發(fā)明中的活性膚單體均從 所構建活性膚數據庫中篩選，其中部分活性膚根據復合功能膚前體的設計需要進行人為改 造。所篩選活性膚的總特點為：抗胃腸酶消化；易于胃腸酶的完整釋放；具有高體內生物活 性。經初步篩選，選定 ACE 抑制膚單體為；MRW、WIR、IRA、AMK、MKR、RGY、VAW、D^、IPP、IKP、 IKPFR、IKPVA、AKF、IW、VAF、VSV、IQY、IVY 等；選定抗氧化膚單體為；DTHK、YPIL、化EPDY、 YLEPFR、YLEPDY、YDEPEW、HYRPFW、Y EPDY、IWAPFY 等。
[0049] W活性膚單體理論上易于胃腸消化酶有效釋放為前提，采用直接首尾連接，或采 用合適的連接短膚（2-3氨基酸殘基，具有生物活性），或將含有部分相同氨基酸殘基的不 同活性膚進行疊加，將篩選到的目標活性膚定向串聯組裝成復合功能膚前體重組活性膚， 并利用蛋白質結構預測軟件和基因優(yōu)化軟件指導重組活性膚及其基因的設計，旨在使得重 組活性膚基因理論上能在工程菌細胞中實現穩(wěn)定高效表達。
[0050] 基于W上策略，本發(fā)明所設計重組降血壓膚和抗氧化膚的氨基酸序列如下：
[0051]
【主權項】
1. 一種重組活性肽，其特征在于：所述重組活性肽是由活性肽單體疊加或定向串聯而 成的，所述活性肽單體包括降血壓肽單體和抗氧化肽單體，其氨基酸序列如序列表SEQID NO:1〇
2. -種編碼權利要求1所述的重組活性肽的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2。
3. 根據權利要求1所述的重組活性肽，其特征在于：所述的抗氧化肽單體有DTHK、 YPIL、FLEPDY、YLEPFR、YLEPDY、YDEPEW、HYRPFW、YEPDY和IWAPFY;所述降血壓肽單體有MRW、 WIR、IRA、AMK、MKR、RGY、VAW、DGL、IPP、IKP、IKPFR、IKPVA、AKF、IW、VAF、VSV、IQY和IVY。
4. 根據權利要求1所述的重組活性肽，其特征在于：所述活性肽單體部分肽段的N末 端為胃蛋白酶酶切位點；所述活性肽單體部分肽段的C末端為胃蛋白酶或胰蛋白酶或胰凝 乳蛋白酶酶切位點；所述重組降血壓肽和抗氧化肽中部分活性肽單體之間由帶有胃蛋白酶 或胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶酶切位點的連接片段串聯而成。
5. 同步制備權利要求1所述的重組活性肽的方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 人工合成序列表SEQIDNO:2所示的基因； (2) 構建能高效表達與純化重組降血壓肽和抗氧化肽的表達載體； (3) 用所述表達載體轉化宿主菌構建基因工程菌； (4) 利用所述工程菌表達重組活性肽； (5) 利用標簽純化及標簽去除技術獲取重組活性肽； (6) 采用胃蛋白酶和/或胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶酶解制得降血壓肽和抗氧化肽。
6. 根據權利要求5所述的重組降血壓肽和抗氧化肽的制備方法，其特征在于：在步驟 (2)中，所述表達載體為pET28a，宿主菌為大腸桿菌E.coliBL21(DE3)。
7. 根據權利要求6所述的重組活性肽的制備方法，其特征在于：在步驟（2)中，采用 DNA重組技術，將序列表SEQIDNO:2所示的基因插入pET28a的HindIII和XhoI位點中， 并分別在基因的上游的NcoI和BamHI位點以及BamHI和HindIII位點克隆入類彈性蛋白 純化標簽ELPs基因和SUMO融合標簽基因，獲得重組表達載體pET28a-ESA3。
8. 根據權利要求6所述的重組活性肽的制備方法，其特征在于：在步驟（3)中，并轉化 E.coliBL21 (DE3)，獲得工程菌； 在步驟⑷中，利用IPTG誘導工程菌表達ELPS-SUM0-A3,收集菌體，超聲破碎細胞，收 集超聲上清或包涵體沉淀； 在步驟（5)中，對于可溶表達的如序列表SEQIDNO:1所示的目標蛋白直接進行標簽 技術純化，而對包涵體表達的目標蛋白先進行變性與復性再進行標簽技術純化；通過ELPs 標簽純化技術純化融合蛋白以及采用SUMO蛋白酶裂解及加鹽離心去除二聯體融合標簽 ELPs-SUMO,獲得重組活性肽； 在步驟(6)中，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解重組活性肽，超濾得小肽 混合體，再脫鹽去雜，冷凍干燥樣品，質檢制得活性肽。
9. 按照權利要求1-8任一項所述的重組活性肽在制備治療高血壓藥中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組活性肽及其同步制備方法，所述重組活性肽是由活性肽單體疊加或定向串聯而成的，所述活性肽單體包括降血壓肽單體和抗氧化肽單體，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1。本發(fā)明的一種編碼所述的重組活性肽的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2。本發(fā)明成本低，獲得的重組多肽中的活性肽能被胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶有效釋放，制得的活性肽混合體具有高體內降壓活性及抗氧化活性。CGMCC No.984220141024
【IPC分類】A61P9-12, C12N15-70, C12N15-11, A61P39-06, C07K14-00, A61K38-16
【公開號】CN104725485
【申請?zhí)枴緾N201410665096
【發(fā)明人】饒勝其, 方維明, 楊振泉, 黃阿根, 高璐
【申請人】揚州大學
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2014年11月19日