-E16為單一克隆無細(xì)菌污染后，進(jìn)行化otgun亞克隆文庫構(gòu)建，構(gòu)建過程中分別利用 重測(cè)序、克隆測(cè)序和PCR的方法補(bǔ)低質(zhì)量和單覆蓋，內(nèi)部桐W及外部桐，進(jìn)而得到完成圖。 測(cè)序數(shù)據(jù)平均覆蓋度為8. 7X，拼接成1個(gè)ScafTold，得到插入片段總長(zhǎng)度為80, 266bp。
[0092] (3)基因預(yù)測(cè)與序列分析和Pm-2F基因的獲得
[0093] 與步驟（2)測(cè)序的80, 266bp區(qū)間同源的甜瓜基因組中包含9個(gè)基因，其中基因 MEL03C015353P1編碼NBS-LRR蛋白，全長(zhǎng)2706bp。而步驟（2)測(cè)序的80, 266bp區(qū)間中該 基因的等位基因全長(zhǎng)3255bp(如序列表中序列1所示），將該基因命名為CmPm-2F基因，簡(jiǎn) 稱RH-2F基因。
[0094] 實(shí)施例2、轉(zhuǎn)Pm-2F基因甜瓜的獲得及其鑒定
[0095] 一、構(gòu)建重組農(nóng)桿菌EHA105/pCHF3-Pm-2F
[0096] 1、W人工合成序列表中序列1所示的雙鏈DM分子為模板，用人工合成的引物 化MF：5-TCGAGCTCGATGGCAGAATCAATTCTG-3'(劃線部分為SacI酶切位點(diǎn)）和引物化MR : 5' -CAGGATCCGTTAGTTCATGGTGGGAAGC-3'(劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并回收。
[0097] 25yLPCR反應(yīng)體系包括 50ng模板DNA、2. 5yLlOXBuffer(含 15mMMgCy、 l.OyLdNTPs(濃度為 2. 5mM)、lUTaqDNA聚合酶、lyL引物PcMF(10yM)、lyL引物 PcMR(10yM)和d地2〇。其中hqDM聚合酶、lOXBuffer(含 15mMMgClz)和dNTPs均為 北京全式金生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。
[0098] PCR反應(yīng)程序：94°C3min;94°C30s，64°C30s，72°C2min，共循環(huán) 30 次；72°C延伸 lOmin;4°C保持。
[0099] 2、將步驟1回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與載體祀ASY-Tl(北京全式金生物技術(shù)有限公司 產(chǎn)品）連接，得到重組質(zhì)粒，命名為祀ASY-Pm-2F。
[0100] 3、將重組質(zhì)粒祀ASY-Pm-2F用SacI和BamHI雙酶切、回收，得到約3300bp的 DNA片段。
[0101] 4、將載體PCHF3用SacI和BamHI雙酶切、回收，得到約10化左右的載體骨架。
[0102] 5、將步驟3的DNA片段和載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒，命名為重組質(zhì)粒 pCHF3-Pm-2F(pCHF3-Pm-2F的載體示意圖見圖2)，將重組質(zhì)粒pCHF3-Pm-2F轉(zhuǎn)入大腸桿菌 D冊(cè)a中，得到含有重組質(zhì)粒pCHF3-Pm-2F的重組大腸桿菌，命名為D冊(cè)a/pCHF3-Pm-2F。所 述重組質(zhì)粒D冊(cè)a/pCHF3-Pm-2F含有序列表中序列1所示的DNA分子，編碼序列表中序列2 所示的蛋白質(zhì)。
[0103] 6、將重組質(zhì)粒D冊(cè)a/pCHF3-Pm-2F用電擊法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105,挑取重組農(nóng) 桿菌，將該重組農(nóng)桿菌命名為EHA105/pCHF3-Pm-2F。
[0104] 按照上述步驟5和6的方法，將pCHF3-Pm-2F替換為載體PCHF3,其它步驟均不變， 得到含有質(zhì)粒PCHF3的重組農(nóng)桿菌EHA105/PCHF3,作為空白對(duì)照。
[0105] 二、轉(zhuǎn)Pm-2F基因甜瓜的獲得
[0106] 甜瓜離體再生的過程見圖3,具體實(shí)驗(yàn)過程如下：
[0107] 1、獲得外植體
[0108] 挑取30粒飽滿的甜瓜K7-2種子，剝?nèi)シN皮，用70% (體積比）乙醇水溶液浸泡 20~30s，用無菌水洗2~3次。然后將甜瓜種子用1 % (質(zhì)量體積比）次氯酸鋼水溶液消 毒lOmin，無菌水洗涂4~5次后，用無菌濾紙吸干多余水分。將消毒后的種子置于MS固體 培養(yǎng)基，26°C(實(shí)際應(yīng)用中25°C~28°C均可），暗培養(yǎng)3天，切除胚根和子葉兩端l-2mm，將 子葉部分切成0. 5cm*0. 5cm的小塊，即為外植體（圖3中A)。
[0109] 2、農(nóng)桿菌侵染外植體
[0110] (1)農(nóng)桿菌侵染液的制備
[01U] 將步驟一構(gòu)建的重組農(nóng)桿菌EHA105/pCHF3-Pm-2F接種到含卡那霉素50mg/L和 利福平50mg/L的YEP液體培養(yǎng)基，28 °C，180巧m振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，500化pm、離屯、lOmin，收集菌體后用MS液體懸浮培養(yǎng)基重懸，得到農(nóng)桿菌侵染液。WMS液體培養(yǎng)基的ODe。。 為參照，調(diào)整農(nóng)桿菌侵染液的ODe。。值為0. 6。
[0112] (2)農(nóng)桿菌侵染外植體
[0113] 用步驟（1)制備的農(nóng)桿菌侵染液侵染外植體15min，侵染后的外植體先在無菌濾 紙上吸去多余菌液，再置于MS共培養(yǎng)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天。
[0114] 共培養(yǎng)條件：26 °C，暗培養(yǎng)。
[011引 3、抗性芽的篩選
[0116] 完成步驟2共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移至初步篩選培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)7~10天，然后 在初步篩選培養(yǎng)基中繼代一次，繼續(xù)光照培養(yǎng)7~10天。將完成初步篩選的外植體轉(zhuǎn)移至 再次篩選培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)7~10天，然后在再次篩選培養(yǎng)基中繼代一次，繼續(xù)光照培養(yǎng) 7~10天，即可得到出抗性芽（圖3中B)。光照培養(yǎng)條件：26°C(實(shí)際應(yīng)用中25°C~28°C 均可），光照強(qiáng)度2000LX(實(shí)際應(yīng)用中1500LX~2500LX)，光照周期16h/?i。
[0117] 4、抗性芽的伸長(zhǎng)
[0118] 將步驟3獲得的抗性芽從再次篩選培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)培養(yǎng)21 天（實(shí)際應(yīng)用中14天~28天均可），誘導(dǎo)芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)（圖3中C和圖3中D)，獲得2-3cm 的不定芽。光照培養(yǎng)條件：26°C(實(shí)際應(yīng)用中25°C~28°C均可），光照強(qiáng)度2000LX(實(shí)際 應(yīng)用中1500LX~2500LX)，光照周期16h/?i。
[0119] 5、生根
[0120] 將步驟4獲得的不定芽切下，置于生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)（圖3中E和圖3中 F)，獲得再生苗，待再生苗根系發(fā)達(dá)后，去掉封口膜煉苗3~5天（圖3中G)，將再生苗從= 角瓶中取出，洗去根上附著的生根培養(yǎng)基，移栽入預(yù)先高壓滅菌的賠石和草炭±1 : 1(體 積比）基質(zhì)中于溫室中培養(yǎng)（圖3中H)，即獲得轉(zhuǎn)Pm-2F基因的抗性植株。
[012。 將上述步驟2中的重組農(nóng)桿菌EHA105/pCHF3-Pm-2F替換為重組農(nóng)桿菌EHA105/PCHF3,重復(fù)步驟1-5,其它步驟均不變，獲得轉(zhuǎn)空載體的植株。
[0122] =、抗性植株的檢測(cè)
[0123] 1、用植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品）分別提 取轉(zhuǎn)Pm-2F基因的抗性植株的葉片的基因組DNA和轉(zhuǎn)空載體的植株的葉片基因組DNA，并W 該基因組DNA為模板，W引物對(duì)1進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用K7-2未轉(zhuǎn)基因的葉片基因組DNA代替 轉(zhuǎn)Pm-2F基因的抗性植株的葉片的基因組DNA，作為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變 性3111111;94°(：變性3〇3,62°(：退火3〇3,72°(：延伸4〇3,30個(gè)循環(huán)；72°(：延伸1〇111111，4°(：保持。
[0124] 用植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品）分別提取 轉(zhuǎn)Pm-2F基因的抗性植株的葉片的基因組DNA，并W該基因組DNA為模板，W引物對(duì)2分別 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用K7-2未轉(zhuǎn)基因的葉片基因組DNA和轉(zhuǎn)空載體的植株的葉片基因組DNA分 別代替轉(zhuǎn)Pm-2F基因的抗性植株的葉片的基因組DNA，作為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C 預(yù)變性3111111;94°(：變性3〇3,56°(：退火3〇3,72°(：延伸21111113〇3,30個(gè)循環(huán)；72°(：延伸1〇111111， 4°C保持。
[01 巧]引物對(duì) 1:NPTIIF:5, -ATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGG-3,和NPTIIR:5,-TCAGAA GAACTCGTCAAGAAGGCGAT-3^ 〇
[0126]引物對(duì) 2 :35S-pro:5, -GAAGTTCATTTCATTTGGAGAGG-3，和p畑F3R: 5> -TTAGTTCATGGTGGGAAGC-3>。
[0127] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4(圖4為用引物對(duì)1PCR擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中M為DMMarker, 泳道1-9為W轉(zhuǎn)Pm-2F基因的抗性植株的葉片的基因組DM為模板的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，10為W轉(zhuǎn) 空載體植株的葉片基因組DNA為模板的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，CK為WK7-2未轉(zhuǎn)基因的葉片基因組DNA 為模板的實(shí)驗(yàn)結(jié)果）和圖5(圖5為用引物對(duì)2PCR擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中M為DNAMarker, 泳道1-9為W轉(zhuǎn)Pm-2F基因的抗性植株的葉片的基因組DM為模板的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，10為W 轉(zhuǎn)空載體植株的葉片基因組DNA為模板的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，CK為WK7-2未轉(zhuǎn)基因的葉片基因組 DNA為模板的實(shí)驗(yàn)結(jié)果），如果轉(zhuǎn)Pm-2F基因的抗性植株的基因組DNA用引物對(duì)1擴(kuò)增出約 790bp的條帶，同時(shí)用引物對(duì)2擴(kuò)增出約3500bp的條帶，則該抗性植株即為甜瓜轉(zhuǎn)基因陽性 植株；而轉(zhuǎn)空載體的植株用引物對(duì)1可W擴(kuò)增獲得790bp條帶，同時(shí)用引物對(duì)2不能擴(kuò)增 出3500bp條帶；K7-2未轉(zhuǎn)基因的植株用引物對(duì)1不能擴(kuò)增獲得790bp條帶，用引物對(duì)2不 能擴(kuò)增出3500bp條帶。
[0128] 2、隨機(jī)選擇轉(zhuǎn)空載體的ML8植株（簡(jiǎn)稱ML8)和步驟1鑒定為陽性的7株株系，分 別命名為甜瓜轉(zhuǎn)基因株系ML1 (簡(jiǎn)稱ML1)、甜瓜轉(zhuǎn)基因株系ML2 (簡(jiǎn)稱ML2)、甜瓜轉(zhuǎn)基因株