一種與植物抗逆性相關蛋白GsERF6及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體設及一種與植物抗逆性相關蛋白GsERTO及其編 碼基因與應用。
【背景技術】
[0002] 我國鹽堿地面積多達15億畝，東北地區(qū)達5500余萬畝，僅黑龍江省就高達2800 余萬畝。因此，鹽堿逆境是制約我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重大問題。如果能夠開發(fā)利用運些廣麥的 鹽堿地資源，對保證我國農(nóng)業(yè)持續(xù)高效發(fā)展和糧食安全，具有重大的戰(zhàn)略意義和現(xiàn)實意義， 可創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟效益、社會效益和生態(tài)效益。我國的鹽堿地主要是堿性±壤，面積最大、 造成的危害也最為嚴重，包括東北、華北、西北內(nèi)陸等地區(qū)，其危害是在化+引發(fā)離子毒害的 基礎上，增加肥〇3和C0 32導致抑值升高，引起混合毒害作用。因此，研究開發(fā)堿性±壤尤 為重要。
[0003] 如何提高作物耐堿性是我國乃至全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)亟待解決的重大問題。近年來， 隨著分子生物學的不斷發(fā)展，利用日趨成熟的基因工程技術培育具有優(yōu)良性狀及良好耐逆 功能作物新品種已成為現(xiàn)代作物改良的重要手段之一，作物轉基因技術已然成為當今世界 發(fā)達國家和發(fā)展中國家的優(yōu)先發(fā)展戰(zhàn)略和搶占的科技制高點。隨著現(xiàn)代分子生物學、生物 信息學、基因工程、基因組與蛋白組學等前沿學科的迅猛發(fā)展，為挖掘功能顯著的基因和轉 基因分子育種提供了高效、科學的技術手段。
[0004] 自1987年Paz-Aies首次從玉米中克隆轉錄因子cDNA基因cLC6和CLC28W來， 科研工作者相繼從各種高等植物中分離鑒定出一系列調(diào)控植物應答生物脅迫（如病原反 應）和非生物脅迫（如干旱、鹽堿、低溫、激素）等相關基因表達的轉錄因子已達數(shù)百種。 因此，挖掘抗逆轉錄因子，將為作物轉基因育種提供功能更加顯著的基因資源。東北野生大 豆（GlycinesojaL.)具有適應性廣、抗逆性強等特點，其優(yōu)質(zhì)基因資源豐富，是抗逆基因 克隆的理想材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是如何調(diào)控植物的抗逆性。
[0006] 為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提供了一種蛋白質(zhì)，將其命名為GsERra蛋白。 陽007] 本發(fā)明提供的GsERF6蛋白，是如下a)或b)或C)的蛋白質(zhì)：
[0008] a)氨基酸序列是SEQIDNo. 2所示的蛋白質(zhì)；
[0009] b)在SEQIDNo. 2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)；
[0010] C)將SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加得到的具有相同功能的的蛋白質(zhì)。
[0011] 其中，SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列由278個氨基酸殘基組成。
[0012] 為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在SEQIDNo. 2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或簇 基末端連接上如表1所不的柄簽。
[001引表l、t不簽的序列
[0014]
陽01引上述C)中的蛋白質(zhì)中，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和)或缺失和/或添加 為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0016] 上述C)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。
[0017] 上述C)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將SEQIDNo. 1所示的DNA序列中缺失一 個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5' 端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
[001引為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了與上述GsERTO蛋白相關的生物材料。
[0019] 本發(fā)明提供的與上述GsERTO蛋白相關的生物材料為下述A1)至A20)中的任一 種：
[0020] A1)編碼上述GsERTO蛋白的核酸分子；
[0021] A2)含有A1)所述核酸分子的表達盒；
[0022] A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；
[0023]A4)含有A2)所述表達盒的重組載體；
[0024] A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物； 陽0巧]A6)含有A2)所述表達盒的重組微生物；
[00%] A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；
[0027] A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；
[0028]A9)含有A1)所述核酸分子的轉基因植物細胞系；
[0029] A10)含有A2)所述表達盒的轉基因植物細胞系；
[0030] All)含有A3)所述重組載體的轉基因植物細胞系；
[003UA。）含有A4)所述重組載體的轉基因植物細胞系；
[0032] A13)含有A1)所述核酸分子的轉基因植物組織；
[0033] A14)含有A2)所述表達盒的轉基因植物組織；
[0034] A15)含有A3)所述重組載體的轉基因植物組織；
[0035] A16)含有A4)所述重組載體的轉基因植物組織；
[0036] A17)含有A1)所述核酸分子的轉基因植物器官；
[0037] A18)含有A2)所述表達盒的轉基因植物器官；
[0038] A19)含有A3)所述重組載體的轉基因植物器官；
[0039] A20)含有A4)所述重組載體的轉基因植物器官。
[0040] 上述生物材料中，A1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因： W41] 1)其編碼序列是SEQIDNo. 1的cDNA分子或DNA分子；
[0042] 2)與1)限定的核巧酸序列具有75%或75%W上同一性，且編碼上述蛋白質(zhì)的 cDNA分子或基因組DNA分子；
[0043] 3)在嚴格條件下與1)或2)限定的核巧酸序列雜交，且編碼上述蛋白質(zhì)的cDNA分 子或基因組DNA分子。 W44] 其中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也 可W是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0045] 其中，SEQIDNo. 1所示的核巧酸序列由837個核巧酸組成，編碼SEQIDNo. 2所 示的氨基酸序列。
[0046] 本領域普通技術人員可W很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的 方法，對本發(fā)明的編碼GSERF6蛋白的核巧酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有 與本發(fā)明分離得到的GsERTO蛋白的核巧酸序列75%或者更高同一性的核巧酸，只要編碼 GsERra蛋白且具有上述蛋白質(zhì)功能，均是衍生于本發(fā)明的核巧酸序列并且等同于本發(fā)明的 序列。
[0047] 運里使用的術語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本 發(fā)明的編碼SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核巧酸序列具有75%或更高， 或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核巧酸序列。同一性可W用肉眼或 計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可W用百分比（％) 表示，其可W用來評價相關序列之間的同一性。 W4引 上述75%或75%W上同一性，可為80%、85%、90%或95%W上的同一性。
[0049] 上述生物材料中，A2)所述的含有編碼GsERTO蛋白的核酸分子的表達盒，是指 能夠在宿主細胞中表達GSERF6蛋白的DNA，該DNA不但可包括啟動GSERF6基因轉錄的 啟動子，還可包括終止GsERTO基因轉錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子 序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動子包括但不限于：組成型啟動子，組織、器官和發(fā)育特異的啟 動子，和誘導型啟動子。啟動子的例子包括但不限于：花挪菜花葉病毒的組成型啟動子 35S:來自西紅柿的創(chuàng)傷誘導型啟動子，亮氨酸氨基膚酶廣LAP",化ao等人（1999)Plant Physiol120:979-992);來自煙草的化學誘導型啟動子，發(fā)病機理相關l(PRl)(由水楊酸 和BTH(苯并嚷二挫-7-硫代徑酸S-甲醋）誘導）；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動子（PIN2) 或LAP啟動子（均可用萊莉酬酸甲醋誘導）；熱休克啟動子（美國專利5,187,267);四環(huán) 素誘導型啟動子（美國專利5,057, 422);種子特異性啟動子，如谷子種子特異性啟動子 PF128 (CN101063139B(中國專利200710099169. 7))，種子膽存蛋白質(zhì)特異的啟動子（例如， 菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的啟動子度eachy等人（198巧EMB0 J. 4:3047-3053))。它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用。此處引用的所有參 考文獻均全文引用。合適的轉錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌姻脂堿合成酶終止子（N0S終 止子）、花挪菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、魏豆rbcSE9終止子和姻脂氨酸和 章魚氨酸合酶終止子。
[0050] 可用現(xiàn)有的表達載體構建含有所述GsERTO基因表達盒的重組載體。所述植物 表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如PAHC25、地in438、 PCAMBIA1302、PCAMBIA2301、PCAMBIA1301、PCAMBIA1300、PBI121、pCAMBIA1391-Xa或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司）等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3'端非翻譯 區(qū)域，即包含聚腺巧酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺巧 酸信號可引導聚腺巧酸加入到mRNA前體的3'端，如農(nóng)桿菌冠瘦瘤誘導（Ti)質(zhì)?；颍ㄈ?姻脂堿合成酶基因Nos)、植物基因（如大豆膽存蛋白基因）3'端轉錄的非翻譯區(qū)均具有類 似功能。使用本發(fā)明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄 增強子，運些增強子區(qū)域可W是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼 序列的閱讀框相同，W保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源 是廣泛的，可W是天然的，也可W是合成的。翻譯起始區(qū)域可W來自轉錄起始區(qū)域或結構基 因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工， 如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基因、蛋光 素酶基因等）、抗生素的標記基因（如賦予對卡那霉素和相關抗生素抗性的nptll基因，賦 予對除草劑麟絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的h地基因，和賦予對氨甲 噪嶺抗性的化化基因，賦予對草甘憐抗性的EPSPS基因）或是抗化學試劑標記基因等（如 抗除莽劑基因）、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-憐酸異構酶基因。從轉基因植物的安全 性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接W逆境篩選轉化植株。
[0051] 上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、隧菌體或病毒載體。
[0052] 上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。
[0053] 上述生物材料中，所述轉基因植物細胞系、轉基因植物組織和轉基因植物器官均 不包括繁殖材料。
[0054] 在本發(fā)明的一個實施例中，GSERF6蛋白的編碼基因（即SEQ IDNo. 1的核巧酸） 通過含有GsERF6蛋白的編碼基因的表達盒的重組載體pCAMBIA 2300-GSERF6導入農(nóng)桿菌 LBA4404中。所述重組載體pCAMBIA 2300-GSERF6為用沈Q IDNo. 1所示的DNA分子插入 pCAMBIA 2300載體的Smal和甜al酶切位點之間，保持pCAMBIA 230