由甜菊苷制備萊苞迪甙a的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種由薦糖和甜菊巧作為原料通過(guò)薦糖合成酶和糖基轉(zhuǎn)移酶來(lái)制備 萊巷迪武A的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甜菊是一種高效能甜味劑，甜度為糖的200倍W上，其是經(jīng)熱水提取屬于菊科 (Compositae)的甜葉菊（SteviarebaudianaBe;rtoni)而獲得的。在甜菊提取物的甜味劑 成分中，已知萊巷迪武A具有較少苦味并且具有與糖最相似的甜味劑品質(zhì)，并且萊巷迪武A 比糖甜400倍，在非改造的植物的情況下，萊巷迪武A占提取物的約20%左右。在提取物中 最主要的成分是甜菊巧，其是萊巷迪武A的前體。為了生產(chǎn)高純度萊巷迪武A，有必要對(duì)具 有高含量萊巷迪武A的種子、種植、收獲、培育管理等進(jìn)行改進(jìn)，運(yùn)會(huì)牽設(shè)到時(shí)間和成本方 面的經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。
[0003] 為了解決運(yùn)些問(wèn)題，已經(jīng)進(jìn)行了將甜菊巧轉(zhuǎn)化成萊巷迪武A的研究。典型的例子 包括一種方法：利用衍生自±壤微生物的P-1，3-葡聚糖酶，通過(guò)酶轉(zhuǎn)化，將葡萄糖分子結(jié) 合至甜菊巧，從而將甜菊巧轉(zhuǎn)化成萊巷迪武A(韓國(guó)專利公布2004-0026747A和美國(guó)專利 6469947)。用于酶轉(zhuǎn)化的糖供體底物的典型例子可W包括凝膠多糖（0-1，3-葡聚糖）。凝 膠多糖是一種高成本的材料，其具有低的溶解度并且缺點(diǎn)在于：其工業(yè)應(yīng)用是困難的。此 夕F，雖然有報(bào)道稱該凝膠多糖通過(guò)真菌發(fā)酵將甜菊巧轉(zhuǎn)化成萊巷迪武配糖體，但是微生物 的培養(yǎng)需要花費(fèi)約15天，并且還會(huì)產(chǎn)生其他的甜菊糖巧，如萊巷迪武B等，運(yùn)使得轉(zhuǎn)化至最 終的萊巷迪武A的轉(zhuǎn)化率僅為40 %左右。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 技術(shù)問(wèn)題
[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是克服源自微生物的酶轉(zhuǎn)化中的低產(chǎn)率的限制，提供一種W高 產(chǎn)率制備萊巷迪武A的方法。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于制備萊巷迪武A的方法，該方法具有高工業(yè) 應(yīng)用性，因?yàn)橹苽溥^(guò)程簡(jiǎn)單、節(jié)省成本并且耗時(shí)較短。
[0007] 技術(shù)方案
[000引根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種制備萊巷迪武A的方法，包括：
[0009] (1)在薦糖合成酶的存在下，使薦糖與二憐酸核巧酸反應(yīng)，從而制備結(jié)合有葡萄糖 的二憐酸核巧酸；W及
[0010] (2)在糖基轉(zhuǎn)移酶的存在下，使所述結(jié)合有葡萄糖的二憐酸核巧酸與甜菊巧反應(yīng)， 從而制備萊巷迪武A。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種由甜菊巧制備萊巷迪武A的原位方法，包括： 使薦糖、二憐酸核巧酸、甜菊巧、薦糖合成酶W及糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，從而制備萊巷迪武A。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了通過(guò)本發(fā)明的用于制備萊巷迪武A的方法而制備 的萊巷迪武A。
[0013] 有益效果
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的制備萊巷迪武A的方法提供高純度的萊巷迪武A，幾乎不產(chǎn)生副產(chǎn) 物，并且產(chǎn)量高。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的用于制備萊巷迪武A的方法適于大量生產(chǎn)，運(yùn)是因?yàn)?，該方法使?了廉價(jià)原料，并且過(guò)程簡(jiǎn)單且耗時(shí)較短，因此該方法是經(jīng)濟(jì)的。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1示出了HPLC分析結(jié)果，其證明了果糖和結(jié)合有葡萄糖的二憐酸尿巧是通過(guò)薦 糖合成酶制成的。在圖1中，（a)示出了甜菊巧（1)只有在反應(yīng)時(shí)間為0小時(shí)是存在的，化） 示出了在反應(yīng)時(shí)間1小時(shí)完成之后，結(jié)合有葡萄糖的二憐酸尿巧（2)通過(guò)薦糖合成酶產(chǎn)生。
[0017] 圖2示出了HPLC分析結(jié)果，其證明了：通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶，甜菊巧轉(zhuǎn)化成了萊巷迪武 A。在圖2中，（a)示出了甜菊巧（1)只有在反應(yīng)時(shí)間為0小時(shí)是存在的，化）示出了甜菊巧 (1)和萊巷迪武A(2)兩者在反應(yīng)時(shí)間為0.5小時(shí)之后存在，W及（C)示出了在反應(yīng)時(shí)間為 1小時(shí)之后，所有甜菊巧（1)被轉(zhuǎn)化為萊巷迪武A(2)。
[0018] 圖3示出了HPLC分析結(jié)果，其證明了：萊巷迪武A(2)是由甜菊巧（1)通過(guò)薦糖 合成酶和糖基轉(zhuǎn)移酶制備的。在圖3中，（a)示出了當(dāng)甜菊巧底物濃度為IOOmM時(shí)，甜菊 巧（1)只有在反應(yīng)時(shí)間為0小時(shí)是存在的，化）示出了當(dāng)甜菊巧底物濃度為IOOmM時(shí)，萊巷 迪武A(2)只有在反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)之后是存在的，W及（C)示出了當(dāng)甜菊巧底物濃度為 250mM時(shí)，甜菊巧（1)和萊巷迪武A(2)兩者在反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)之后是存在的。
[0019] 圖4示出了證明用于薦糖合成酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的合適的抑評(píng)價(jià)結(jié)果的圖表。
[0020] 圖5示出了證明用于薦糖合成酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的合適的溫度評(píng)價(jià)結(jié)果的圖表。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案設(shè)及一種用于制備萊巷迪武A的方法，包括：
[0022] (1)在薦糖合成酶的存在下，使薦糖與二憐酸核巧酸反應(yīng)，從而制備結(jié)合有葡萄糖 的二憐酸核巧酸；W及
[0023] (2)在糖基轉(zhuǎn)移酶的存在下，使所述結(jié)合有葡萄糖的二憐酸核巧酸與甜菊巧 反應(yīng)，從而制備萊巷迪武A。步驟（1)和步驟似是原位相繼（sequentially)或連續(xù) (consecutively)進(jìn)行的，優(yōu)選是原位連續(xù)進(jìn)行的。
[0024] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案設(shè)及一種由甜菊巧制備萊巷迪武A的方法，包括：使薦 糖、二憐酸核巧酸、甜菊巧、薦糖合成酶W及糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，從而制備萊巷迪武A。薦糖、二 憐酸核巧酸、甜菊巧、薦糖合成酶W及糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)可W是原位進(jìn)行的。
[0025] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"原位"是指反應(yīng)是在單個(gè)反應(yīng)體系中連續(xù)進(jìn)行的。
[00%] 在植物糖代謝中，薦糖合成酶通過(guò)可逆地將結(jié)合至二憐酸核巧酸的葡萄糖轉(zhuǎn)化至 果糖而在薦糖生產(chǎn)中發(fā)揮作用。在本發(fā)明中，薦糖合成酶顯示了 ：在抑5至抑10的范圍 內(nèi)使薦糖與二憐酸核巧酸反應(yīng)，將結(jié)合有葡萄糖的二憐酸核巧酸與果糖分開(kāi)的活性。
[0027][化學(xué)反應(yīng)U
[0028] L/IN丄^心丄04乙<^ A <" ? * O/丄U夕>；
[0029] 通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶，結(jié)合有葡萄糖的二憐酸核巧酸能夠與甜菊巧反應(yīng)，從而制備萊 巷迪武A。
[0030] [化學(xué)反應(yīng)引
[0031]
[0032] 本發(fā)明中的化學(xué)反應(yīng)1和2可W在分開(kāi)的反應(yīng)器中相繼進(jìn)行，但優(yōu)選在一個(gè)反應(yīng) 器中連續(xù)進(jìn)行。
[0033] 在本發(fā)明中，化學(xué)反應(yīng)1和2可W合并成如下所示的一個(gè)反應(yīng)式：
[0034] [化學(xué)反應(yīng)引
[0035]
[0036] 本發(fā)明提供了連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)，其中，根據(jù)上述化學(xué)反應(yīng)3, 一個(gè)葡萄糖特異性地結(jié) 合至甜菊巧13-0-葡萄糖的C-3'位置，從而W高產(chǎn)量合成萊巷迪武A。
[0037] 在本發(fā)明中，薦糖合成酶可W源自稻米（rice)、玉米（corn)、小麥、竹子、擬南芥 (Ar油idopsisthaliana)、草、大麥化arley)、高梁或馬鈴馨。優(yōu)選地，薦糖合成酶是源自 稻米、玉米、小麥或大麥，特別優(yōu)選源自稻米，尤其是水稻（化yzasativa)。薦糖合成酶可 由利用含有薦糖合成酶基因的載體轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌巧scherichiacoli)、芽抱桿菌 (Bacillus)、酵母、棒狀桿菌（Corynebacterium)或±壤桿菌（Agrobacterium)產(chǎn)生。薦糖 合成酶從大腸桿菌巧scherichiacoli)等產(chǎn)生后可W經(jīng)進(jìn)一步純化。薦糖合成酶是本領(lǐng) 域熟知的現(xiàn)有技術(shù)。雖然沒(méi)有特別的限制，但是薦糖合成酶可W包括在SEQIDN0:3中所 不的基本序列。
[0038] 在本發(fā)明中，薦糖沒(méi)有特別限制，只要它可W作為薦糖合成酶的底物向二憐酸核 巧酸提供葡萄糖即可。薦糖的例子可W包括粗糖或糖。
[0039] 在本發(fā)明中，嚷嶺或喀晚可用作二憐酸核巧酸。優(yōu)選的是，使用二憐酸尿巧作為二 憐酸核巧酸。
[0040] 在本發(fā)明中，在步驟（1)或化學(xué)反應(yīng)1中的反應(yīng)溫度可W是20°C至60°C，并且反 應(yīng)抑可W在抑5至抑10的范圍內(nèi)。優(yōu)選的是，反應(yīng)溫度為30°C至55°C，反應(yīng)抑在抑6 至抑9的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選的是，反應(yīng)溫度為35°C至50°C，并且反應(yīng)抑在抑7至抑8的 范圍內(nèi)。本發(fā)明中，在步驟（1)或化學(xué)反應(yīng)1中的反應(yīng)時(shí)間為30分鐘至48小時(shí)，優(yōu)選為1 小時(shí)至36小時(shí)，特別優(yōu)選為1小時(shí)至24小時(shí)，但不限于此。
[0041 ] 在本發(fā)明中，糖基轉(zhuǎn)移酶可W獲自水稻他Tzasativa)、甜葉菊（Stevia rebaudianaBertoni)、綠竹度ambusa〇1 化amii)，二穗短柄草度rachypodium distachyon)、大麥（Hordeumvulgare)、二色高梁（Sorghumbicolor)、玉蜀泰狂eamays)、 或擬南芥（Ar油idopsisthaliana)。優(yōu)選地，糖基轉(zhuǎn)移酶獲自水稻的ryzasativa)、甜葉 菊（SteviarebaudianaBe;rtoni)或綠竹度ambusa〇1化amii)。特別優(yōu)選地，糖基轉(zhuǎn)移酶 獲自甜葉菊（SteviarebaudianaBertoni)。糖基轉(zhuǎn)移酶可W利用含有糖基轉(zhuǎn)移酶基因 的載體轉(zhuǎn)化的重組大