一種甜菊苷生物轉(zhuǎn)化制備的甜菊糖衍生物、制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種甜菊苷生物轉(zhuǎn)化制備的甜菊糖衍生物、制備方法及其應(yīng)用，屬于 食品化工技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 甜菊糖是從菊科草本植物甜葉菊的葉、莖中提取出的一種新型天然甜味劑，是一 種天然、綠色、保健的功能食品，它有著芬芳、清涼的味道，還具有甜度高、熱能低的特點，其 甜度是蔗糖的200-300倍，而熱值僅為蔗糖額1/300,是一種可替代蔗糖非常理想的甜味 劑。隨著人類對健康、綠色的重視，甜菊糖被食品科學(xué)家稱為是未來世界最具發(fā)展前景的甜 味劑。
[0003] 甜菊糖被國際醫(yī)學(xué)界認(rèn)為是人類良好的營養(yǎng)補充劑和保健藥品。經(jīng)大量科學(xué)實驗 證明，甜菊糖有利于調(diào)節(jié)血糖和血壓，經(jīng)常食用可調(diào)節(jié)血糖水平，預(yù)防高血壓，改善低血壓 癥狀；甜菊糖還具有抑制某些細(xì)菌生長和繁殖及阻止其感染的作用，能夠治療感冒和流感 及預(yù)防齲齒等病癥；甜菊糖能夠降低人對糖和脂肪的需求，調(diào)節(jié)其日常飲食，降低人們對煙 酒的需求，防止了糖尿病、肥胖癥、心臟病等疾病的發(fā)生；同時，甜菊糖還具有對皮膚修復(fù)和 改良作用，它能治療皮膚疾病，消除皺紋，去除疤痕等。
[0004] 甜菊糖可廣泛應(yīng)用于食品、飲料、調(diào)味料、醫(yī)藥、日用化工、釀酒、化妝品等行業(yè)，較 使用蔗糖可節(jié)省成本約60%，且營養(yǎng)價值高。甜菊糖的穩(wěn)定性、代謝途徑及其安全性已被 深入研究，它已經(jīng)我國衛(wèi)生部、輕工業(yè)部批準(zhǔn)使用，且亦被美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)可為 "GRAS(-般認(rèn)為是安全的）"的級別。甜菊糖作為蔗糖的天然替代品，其應(yīng)用前景廣闊。
[0005] 甜菊糖雖有著眾多優(yōu)勢，但是其嚴(yán)重的苦澀后味，卻阻礙了其的廣泛應(yīng)用。目前， 甜菊糖口感的改善可通過酶法生物轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)。已有報道，可以利用環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶改 性甜菊糖，以改善其口感和味質(zhì)，但是該酶轉(zhuǎn)移糖基的位置不專一，產(chǎn)物不純，且其甜度也 嚴(yán)重降低。
[0006] 甜菊雙苷向甜菊苷和萊鮑迪苷B的轉(zhuǎn)化以及甜菊苷轉(zhuǎn)化為萊鮑迪苷A和D的反應(yīng) 等。這些研究相對于甜菊糖的眾多組分而言，仍微乎其微，而且其改性后的口感和味質(zhì)也是 一項龐大的研究。尋求高效的生物轉(zhuǎn)化酶，轉(zhuǎn)化工藝以及新型甜菊糖衍生物仍是甜菊糖未 來的研究趨勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題是：提出一種以甜菊苷為原料，通過酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)甜菊糖 衍生物，從而改善其口感，可以較低的成本和較短的生產(chǎn)周期產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的甜菊苷生物轉(zhuǎn)化 制備的甜菊糖衍生物、制備方法及其應(yīng)用。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案是：一種甜菊苷生物轉(zhuǎn)化制備的 甜菊糖衍生物，結(jié)構(gòu)式如下：
[0009]
[0010] 本發(fā)明提出的另一技術(shù)方案是：一種甜菊苷生物轉(zhuǎn)化制備的甜菊糖衍生物的制備 方法：以甜菊苷為底物，使所述底物在葡萄糖基供體存在下，在UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（尿苷 二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶）的催化作用下反應(yīng)生成甜菊糖衍生物。
[0011] 優(yōu)選的，所述的葡萄糖基供體為UDP-葡萄糖或由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP組成的 UDP-葡萄糖再生循環(huán)體系。
[0012] 優(yōu)選的，所述的UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶M301，蔗糖合成酶M302,都由南京諾云生物 科技有限公司發(fā)酵生產(chǎn)部提供。
[0013] 優(yōu)選的，UDP-葡萄糖的用量為0· 0135~5. 41g/L;蔗糖的用量為34. 23~68. 46g/ L;蔗糖合成酶的用量按濕菌體計為18. 92~94. 59g/L，
[0014] 優(yōu)選的，在微生物宿主中表達(dá)UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，所述微生物宿主選自大腸桿 菌、芽胞桿菌、酵母、曲霉菌或畢赤酵母。
[0015] 優(yōu)選的，所述反應(yīng)在MgCl2濃度為0~0· 286g/L，溫度為20~37°C，pH5. 0~9. 0 的水相體系中進(jìn)行，反應(yīng)時間為〇. 5~72h。
[0016] 優(yōu)選的，所述反應(yīng)在pH8. 0的Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行。
[0017] 優(yōu)選的，所述反應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶的添加量為18. 92~227. 03g/L，底物起始濃度為 0· 676 ~54. 05g/L，輔酶的添加量為 0· 0135 ~5. 41g/L。
[0018] 本發(fā)明提出的另一技術(shù)方案是：一種甜菊苷生物轉(zhuǎn)化制備的甜菊糖衍生物的應(yīng) 用：可應(yīng)用于食品，飲料，煙草產(chǎn)品，調(diào)味品，日用化工產(chǎn)品，藥物組分，營養(yǎng)保健產(chǎn)品，口腔 衛(wèi)生產(chǎn)品或化妝品。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：
[0020] (1)所述的葡萄糖基供體可以為UDP-葡萄糖或由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP組成的 UDP-葡萄糖再生循環(huán)系統(tǒng)。其中，優(yōu)選由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP組成的UDP-葡萄糖再生 循環(huán)系統(tǒng)，UDP-葡萄糖價格昂貴，采用UDP-葡萄糖再生循環(huán)系統(tǒng)可以大幅度的降低生產(chǎn)成 本。
[0021] (2)將反應(yīng)所用的全部原料加入到反應(yīng)液中，混勻后，置于設(shè)定的參數(shù)下，搖床震 蕩反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束時其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化效率可達(dá)90%以上。通過對反應(yīng)液分離提純處理即可獲取 達(dá)到要求的甜菊糖衍生物NY101產(chǎn)品。一個具體的分離提純方法是先經(jīng)過樹脂分離處理， 再經(jīng)乙醇反復(fù)結(jié)晶純化，按照該提純方法，可獲得純度高達(dá)95%的甜菊糖衍生物NY101產(chǎn) 品。
[0022] (3)蔗糖作為原料之一，提供糖基，由于其物理化學(xué)性質(zhì)與甜菊糖及其衍生物差異 較大，故反應(yīng)后可以采用樹脂分離和結(jié)晶等方式去除未反應(yīng)的蔗糖和反應(yīng)副產(chǎn)物果糖。
[0023] (4)本發(fā)明以甜菊苷、蔗糖為原料，利用生物轉(zhuǎn)化方法在所述參數(shù)下反應(yīng)獲取甜菊 糖衍生物NY101產(chǎn)品，生產(chǎn)工藝綠色安全，且生產(chǎn)成本低、周期短，極大的提高產(chǎn)品的競爭 力。由于本發(fā)明操作簡便，轉(zhuǎn)化效率高，提純?nèi)菀?，所得產(chǎn)品純度高，可用于食品與飲料業(yè)， 具有重要的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0024] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的作進(jìn)一步說明。
[0025] 圖1 NY101的HPLC譜圖及其MS譜圖
[0026] 圖2 NY101的核磁氫譜圖
[0027] 圖3 NY101的核磁碳譜圖
[0028]圖 4 NY101 的二維COSY譜圖
[0029]圖 5 NY101 的二維HMQC譜圖
[0030]圖 6 NY101 的二維HMBC譜圖
【具體實施方式】
[0031] 本發(fā)明主要提供兩條制備甜菊糖衍生物NY101的路線：
[0032]路線一：
[0033]
[0034]
[0035]
[0036]
[0037] 實施例1:
[0038] 重組大腸桿菌的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)
[0039] 利用分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)等獲得含有目的基因的重組大腸桿菌表達(dá)菌株， 然后將重組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)制備含有目的蛋白的重組細(xì)胞。其具體步驟如 下：
[0040] 1)合成所需的引物片段，通過PCR擴增獲得所需的UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶M301編 碼DNA片段，并通過同源重組技術(shù)，整合到pNYK表達(dá)載體的表達(dá)框中。
[0041] 2)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，獲得含有目的基因的工程菌J301。
[0042] 3)將1ml工程菌J301置于TB培養(yǎng)基中，250rpm、37°C振蕩培養(yǎng)至0D600 = 1. 0， 加入終濃度為0.ImMIPTG于25°C振蕩培養(yǎng)16h。誘導(dǎo)結(jié)束后以10000g，5min離心收集細(xì) 胞，置于-8〇°C儲存?zhèn)溆谩５玫搅撕蠱301蛋白的菌體。
[0043] 同樣的，制備出含有蔗糖合成酶M302蛋白的菌體。
[0044] 實施例2 :
[0045] 以甜菊苷（stevioside)為底物酶法直接制備NY101 (路線一）
[0046] 取實施例1中的菌體M301沉淀，濕菌體重為35mg，用無菌水重懸細(xì)胞，并于冰浴中 超生波破碎細(xì)胞，即為反應(yīng)所用的粗酶液。精密稱取樣品，配制成1. 85mL體系，其中甜菊苷 (stevioside)的終濃度 2. 70g/L、UDP-葡萄糖為 2. 70g/L，并加入 0· 286g/L的MgCl2;然后 加入粗酶液，并加入Tris-HCl緩沖液（0. 1M，pH8. 0)至體系為1. 85ml，起始反應(yīng)。37°C恒溫 搖床以150rpm振蕩24h，100°C煮沸終止反應(yīng)。13000g離心lOmin，取上清作為樣品。使用 LC-MS方法檢測反應(yīng)體系中NY101的含量。實驗結(jié)果表明，NY101的轉(zhuǎn)化率約為73%。
[0047] 實施例3:
[0048] 最佳金屬離子濃度的確定
[0049] 取實施例1中的菌體M301沉淀35mg，按照實施例2中的方法，轉(zhuǎn)移至5ml離 心管中，加入終濃度為2. 70g/L的甜菊苷，UDP-葡萄糖為2. 70g/L及MgCl2，并加入0. 1M Tris-HCl緩沖液（pH8. 0)。按上述方法，取平行樣，加入1%(：12的終濃度分別為0、0.