來自長蒴黃麻和圓果種黃麻的編碼wuschel相關(guān)的同源框4(wox4)蛋白的核苷酸序列和其 ...的制作方法
【專利說明】來自長菊黃麻和圓果種黃麻的編碼WUSCHEL相關(guān)的同源框 4(W0X4)蛋白的核音酸序列和其使用方法
[000。 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年11月22日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/907, 617的益處；其全 部內(nèi)容通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明一般設(shè)及分子生物學(xué)領(lǐng)域并且設(shè)及通過調(diào)節(jié)植物中編碼WUSC肥L相關(guān)的 同源框4蛋白（W0X4)多膚的核酸的表達(dá)，增強(qiáng)纖維產(chǎn)率相關(guān)的特性的方法。更具體地，本 發(fā)明提供了分離自兩個(gè)黃麻植物物種，即，長葫黃麻和圓果種黃麻的WUSCHEL相關(guān)的同源 框4 (W0X4)同系物，和其在產(chǎn)生黃麻植物的初皮纖維中的應(yīng)用，W及其轉(zhuǎn)基因黃麻植物。
【背景技術(shù)】
[0004] 黃麻是環(huán)境友好的和生物可降解的天然纖維。其是可再生資源，每單位±地面積 具有高的生物質(zhì)產(chǎn)生。超過100個(gè)黃麻物種（包括野生近親緣類）產(chǎn)生天然初皮纖維。黃 麻由黃麻屬植物產(chǎn)生，其曾經(jīng)歸類為鍛樹科，最近歸類為錦葵科。但是，運(yùn)些物種中的僅僅 兩個(gè)，長葫黃麻和圓果種黃麻，產(chǎn)生適于工業(yè)目的使用的高質(zhì)量纖維。作為天然纖維，黃麻 可用于各種途徑，補(bǔ)充或替換人工合成材料，并且已經(jīng)接收增加來自工業(yè)的注意。隨著全球 對(duì)黃麻纖維需求的增加，需要進(jìn)一步改善黃麻纖維產(chǎn)生。因此，研究纖維生物合成和開發(fā)設(shè) 及該纖維生物合成的分子生物學(xué)非常令人感興趣。
[0005] 黃麻的纖維是木質(zhì)部外纖維，其由兩種類型的纖維組成和/或包括兩種類型的 纖維：（i)在原生初皮部區(qū)域通過細(xì)胞分裂和修飾，由原形成層發(fā)育的主要初皮部纖維，和 (ii)由形成層通過紡鍵狀活性和射線起始發(fā)育的第二初皮部纖維（Maiti和Mitra, 1972. BullBotSocBengal26:79 - 85)。運(yùn)些原形成層和形成層組織通過導(dǎo)管元件分化抑制因子 (TID巧和TDIF受體（TDR)膜蛋白質(zhì)激酶介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞通信，其促進(jìn)原形成層細(xì)胞的增殖 和抑制它們的木質(zhì)部分化（圖l;Hirakawa等，2010).PlantCell，22:2618-2629;Etchells 等，2013.Development140, 2224-2234)。
[0006]WUSC肥L相關(guān)的同源框（WO訝基因家族在啟動(dòng)和/或保持各種胚芽、分生組織和器 官初始細(xì)胞期間進(jìn)行相關(guān)的功能Ofaecker等，2004)。在WUSC肥L相關(guān)的同源框（WO訝基 因家族蛋白質(zhì)中，W0X4用作TDIF信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑化irakawa等2010)并且優(yōu)選 在原形成層和形成層中表達(dá)（Sc虹ader等，2004 ;Ji等，2010和Hirakawa等2010)。例如， TDIF-TDR誘導(dǎo)主轉(zhuǎn)錄因子WUSC肥L相關(guān)的同源框4 (W0X4)的轉(zhuǎn)錄，其促進(jìn)保持?jǐn)M南芥屬和 西紅柿中的原形成層/形成層干細(xì)胞。
[0007]WUSC肥L相關(guān)的同源框4(W0X4)多膚催化植物中初皮纖維的啟動(dòng)。但是，還未有許 多與該多膚相關(guān)的表征報(bào)道或存在現(xiàn)有技術(shù)提供的技術(shù)。美國專利號(hào)2011/0283420A1 (通 過參考并入）已經(jīng)公開了WUSChel相關(guān)的同源框1樣（WOXl樣）多膚，用于改善植物中相 關(guān)的特征的產(chǎn)率。在另一歐洲專利號(hào)1451301B1中，公開了WUSChel基因在促進(jìn)植物中體 細(xì)胞胚芽發(fā)生中的用途。最近，美國專利號(hào)2010/0100981A1(通過參考并入）中公開了一 些wuschel基因同系物。
[0008] 鑒于WUSC肥L相關(guān)的同源框4蛋白可在黃麻纖維的生物合成途徑中其重要作用的 事實(shí)，期望通過開發(fā)和利用WUSC肥L相關(guān)的同源框4 (W0X4)的分子生物學(xué)和遺傳信息，工業(yè) 提供植物中與纖維的生物合成相關(guān)的遺傳方法。另外，因?yàn)橹参锩總€(gè)物種的纖維生物合成 途徑和遺傳組成通常不同，所W物種特異性方法也是優(yōu)選的W便優(yōu)化從黃麻植物的纖維產(chǎn) 率，并且獲得兼容的結(jié)果，W確保工業(yè)中的使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的一個(gè)方面等是提供基因編碼蛋白質(zhì)，源自長葫黃麻和圓果種黃麻，其參 與催化它們初皮纖維形成的啟動(dòng)，并且具有WUSC肥L相關(guān)的同源框4(W0X4)樣序列。更具 體而言，本發(fā)明提供了具有誘導(dǎo)初皮部纖維能力的基因，因此提供了從而編碼的蛋白質(zhì)，W 及其用途。
[0010] 本發(fā)明的另一目的提供了待開發(fā)/使用而用于改善長葫黃麻和圓果種黃麻植物 W及其他產(chǎn)生初皮纖維的植物中纖維的生產(chǎn)、生長、強(qiáng)度和產(chǎn)率的WUSC肥L相關(guān)的同源框 4 (W0X4)的分子生物學(xué)和遺傳信息。
[0011] 仍本發(fā)明的另一目的是通過調(diào)節(jié)WUSC肥L相關(guān)的同源框4 (W0X4)在植物中的生物 合成，獲得具有增加的纖維產(chǎn)生的長葫黃麻和圓果種黃麻的轉(zhuǎn)基因植物。
[0012] 本發(fā)明的仍另一目的是提供分離的多核巧酸，其具有特定的核巧酸序列，其可利 于公開方法的表現(xiàn)，并且提供對(duì)轉(zhuǎn)基因長葫黃麻和圓果種黃麻植物的利用。
[0013] 本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供潛在的商業(yè)上可行的方式，W增加用于黃麻纖維基產(chǎn) 品的纖維的生產(chǎn)。
[0014] 本發(fā)明提供了分離自長葫黃麻的基因，其編碼具有如SEQ ID NO :3中闡釋的氨 基酸序列的蛋白質(zhì)，其參與催化初皮部纖維形成的啟動(dòng)并且具有WUSC肥L相關(guān)的同源框 4(W0X4)樣序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有通過添加或缺失 一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或用如SEQ ID NO :3中闡釋的氨基酸序列的其他氨基酸替換而修 飾的氨基酸序列，其參與催化初皮部纖維的形成的啟動(dòng)并且具有WUSC肥L相關(guān)的同源框 4(W0X4)樣序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了與SEQ ID NO :1中闡釋的核酸雜交的基因，尤其其 DNA或其一部分，并且編碼參與催化初皮部纖維的形成的啟動(dòng)并且具有WUSC肥L相關(guān)的同 源框4(W0X4)樣序列的蛋白質(zhì)。
[0015] 本發(fā)明也提供了分離自圓果種黃麻的基因，其編碼具有如SEQ ID NO :6中闡釋的 氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其參與催化初皮部纖維的形成的啟動(dòng)并且具有WUSC肥L相關(guān)的同源 框4(W0X4)樣序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有通過添加或 缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或用如SEQ ID NO :6中闡釋的氨基酸序列的其他氨基酸替換 而修飾的氨基酸序列，其參與催化初皮部纖維的形成的啟動(dòng)并且具有WUSC肥L相關(guān)的同源 框4(W0X4)樣序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了與SEQ ID NO :4中闡釋的核酸雜交的基因，尤其 其DNA或其一部分，并且編碼參與催化初皮部纖維的形成的啟動(dòng)并且具有WUSC肥L相關(guān)的 同源框4 (W0X4)樣序列的蛋白質(zhì)。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式，使用的長葫黃麻的植物是品種0-4,和使用的 圓果種黃麻的植物是品種CVkl。
[0017] 本發(fā)明的另一實(shí)施方式公開重組基因構(gòu)建體包括具有SEQIDNO:2和/或SEQID NO:5中闡釋的核巧酸序列的多膚，其中多核巧酸在宿主細(xì)胞中是可表達(dá)的，W分別在長葫 黃麻和圓果種黃麻的植物中產(chǎn)生WUSC肥L相關(guān)的同源框4 (W0X4)的同系物。
[0018] 本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式是包括重組基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化株，所述重組基因構(gòu)建體 能夠表達(dá)具有SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:5中闡釋的核巧酸序列的多核巧酸，W產(chǎn)生 WUSCHEL相關(guān)的同源框4 (W0X4)蛋白的同系物。
[0019] 本發(fā)明也提供了產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，所述蛋白質(zhì)參與初皮部纖維啟動(dòng)的催化活 性，并且具有WUSC肥L相關(guān)的同源框4 (W0X4)樣序列，所述方法包括培養(yǎng)和/或栽培上述宿 主。
[0020] 本發(fā)明也提供了誘導(dǎo)植物或植物細(xì)胞的初皮部纖維啟動(dòng)的方法；此外，其也公開 了包括和/或由下述組成的方法：將上述基因引入植物或植物細(xì)胞，并且驅(qū)動(dòng)所述基因的 表達(dá)。
[0021] 本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明非常適于進(jìn)行目標(biāo)并且獲得提到的目的和優(yōu) 勢(shì)，W及其中固有的那些。本文所述的實(shí)施方式不旨在限制本發(fā)明的范圍。
[0022] 參考下述說明書和權(quán)利要求，將更容易理解本發(fā)明的運(yùn)些和其他特征、方面和優(yōu) 勢(shì)。
【附圖說明】
[0023] 圖1顯示TDIF-TDR信號(hào)傳導(dǎo)途徑。TDIF-TDR信號(hào)傳導(dǎo)分成兩個(gè)途徑，一個(gè)是參與 初皮部細(xì)胞增殖的W0X4,其促進(jìn)纖維細(xì)胞啟動(dòng)和另一個(gè)是假設(shè)因子X，其抑制脈管干細(xì)胞 的木質(zhì)部分化。
[0024] 圖2顯示系統(tǒng)發(fā)生樹，其比較來自長葫黃麻的SEQIDNO. 3和來自圓果種黃麻的 SEQIDNO. 6,W及產(chǎn)生WUSC肥L相關(guān)的同源框4 (W0X4)蛋白的其他氨基酸序列。
[00幼發(fā)明詳述
[0026] 從下述形成本申請(qǐng)一部分的詳細(xì)說明書和附圖可更充分理解本發(fā)明。
[0027] 本文提供的定義和/或方法限定本發(fā)明并且在本發(fā)明的實(shí)踐中指導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù) 人員。除非W其他方式指明，應(yīng)根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)的用途理解術(shù)語。在任何定義 和/或方法與本文并入的任何專利或非專利參考文獻(xiàn)提供的或其他地方出現(xiàn)的任何參考 文獻(xiàn)的任何定義和/或方法不一致的情況下，應(yīng)理解，本文使用在本申請(qǐng)中已經(jīng)清楚提供/ 改編的所述定義和/或方法。單數(shù)術(shù)語"一個(gè)（a/an)"和"所述"包括復(fù)數(shù)參照物，除非上 下文清楚得另外指出。類似地，詞語"或"旨在包括"和"，除非上下文清楚得另外指出。因 此，"包括A或B"意思是包括A或B，或A和B。進(jìn)一步理解，為核酸或多膚提供的所有基礎(chǔ) 尺寸或氨基酸尺寸，和所有分子量或分子量值是近似的，并且提供為了說明。盡管與本文所 述的那些類似或相同的方法和材料可用于本公開的實(shí)踐或測(cè)試，但是下面描述了適當(dāng)?shù)姆?法和材料。
[0028] 本發(fā)明設(shè)及分離的多核巧酸和源自其的相應(yīng)多膚，所述多核巧酸編碼提取自長葫 黃麻和圓果種黃麻的WUSC肥L相關(guān)的同源框4蛋白。更具體地，本發(fā)明提供了WUSC肥L相 關(guān)的同源框4同系物，和它們?cè)诟纳贫紴辄S麻植物物種的長葫黃麻和圓果種黃麻中纖維產(chǎn) 生的用途，W及相關(guān)的轉(zhuǎn)基因長葫黃麻和圓果種黃麻植物。主要通過比較長葫黃麻和圓果 種黃麻基因組DNA的核巧酸序列和其他植物已知酶基因的核巧酸序列鑒定本發(fā)明編碼酶 的基因組序列。在本發(fā)明之前，f運(yùn)些長葫黃麻和圓果種黃麻基因的核巧酸序列、閱讀框、 外顯子和內(nèi)含子的位置、酶的結(jié)構(gòu)，W及它們?cè)陂_發(fā)高纖維產(chǎn)率潛能的黃麻植物中的潛在 用途是未知的。
[0029] 商業(yè)上栽培的黃麻物種，長葫黃麻和圓果種黃麻的基因組序列的分析掲示兩個(gè)物 種都具有編碼具備優(yōu)選用于增強(qiáng)纖維產(chǎn)生的催化活性的酶的單個(gè)基因。起初由軟件程序， 比如Augustus,半HMM基核酸分析程序（SNAP)、Geneid(GenomeBioInformaticsResearch Lab)注釋核巧酸序列，其可鑒定推定編碼區(qū)域，內(nèi)含子，和拼接接頭。進(jìn)一步進(jìn)行自動(dòng)和手