W版本1.82進(jìn)行核 巧酸序列比對(duì)。然后編輯比對(duì)。手動(dòng)選擇基因特異性引物（正向和反向）或通過(guò)Primer Splus工具并且定制合成引物。
[01巧]合成在該研究中使用的所有寡核巧酸并且通過(guò)供應(yīng)商HPLC純化W及從整合DNA技術(shù)（IDT)獲得。在高壓滅菌d地20中制備約10化mol的原料液并且儲(chǔ)存在約-20°C，W等 分試樣待用。
[0126] 用作PCR引物的寡核巧酸序列
[0127] CN 10bl64z：6z：A WL wu丄4/i丫貝
[012引實(shí)施例2來(lái)自長(zhǎng)葫黃麻和圓果種黃麻的WUSCHEL相關(guān)的同源框4的擴(kuò)增、克隆和 測(cè)序
[0129] 從MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的S天齡秩苗分離總RNA，如先前化omczynskiP和Sacchi N描述，通過(guò)酸脈鹽硫氯酸鹽-苯酪-氯仿提取的RNA分離的單步方法。（AnalBiochem 1987,162 :156-159)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的質(zhì)量或完整性并且使用Thermo ScientificNanoDrop2000根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序來(lái)量化。使用SuperscriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶 (Invitrogen)按照制造商的指導(dǎo)合成CDNA第一鏈。通過(guò)PCR使用基因特異性引物從CDNA 擴(kuò)增基因。PCR反應(yīng)（50化）包含IyL的cDNAJOpmoles的每個(gè)引物，5yL的IOXPCR緩沖 液，5yL的 2.SmMdNTP混合物和 1.0 單位的PfWaqDNA聚合酶。在I'hermal切cler(Applied Biosystems)中使用下述條件進(jìn)行PCR:在約95 °C下初始變性約5min隨后35個(gè)下述循 環(huán)：在約95°C下變性約30sec、在約59-erC下退火約SOsec和在約72°C下延伸約Imin, 在約72°C下最終延伸約7min。通過(guò)1 %瓊脂糖凝膠使用IXTAE緩沖液分析PCR產(chǎn)品并 且從凝膠使用QIAGEN凝膠提取試劑盒根據(jù)制造商的指導(dǎo)洗脫擴(kuò)增子。純化的PCR產(chǎn)品連 接至pCR飯8,''GW/T0P0@TA克隆試劑盒（Invitrogen)和轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞 (Invitrogen)。從推定克隆使用QIApripSpinMiniprep試劑盒（QIAGEN)按照制造商指 導(dǎo)分離質(zhì)粒。通過(guò)使用基因特異性引物檢查插入物的存在并且對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。
[0130] 連施例3序巧I分析
[0131] 分別通過(guò)BLASTN和BLASTP程序分析核巧酸序列和氨基酸序列。從其他植物報(bào)道 的序列用ClustalW比對(duì)。使用Nei曲hour化ining(NJ)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。
[0132] 連施倆I4纖維牛物合成的旅巧構(gòu)律
[0133] 顯示W(wǎng)USC肥L相關(guān)的同源框4 (W0X4)在纖維生物合成中作用的自動(dòng)代謝途徑重 建通過(guò)鑒定來(lái)自長(zhǎng)葫黃麻和圓果種黃麻的直向同源基因構(gòu)建的蛋白質(zhì)與Arbidopsis基因 組比較。使用酶反應(yīng)構(gòu)建長(zhǎng)葫黃麻和圓果種黃麻基因組中編碼的WUSC肥L相關(guān)的同源框 4 (W0X4)催化酶反應(yīng)，所述酶反應(yīng)在用于途徑工作室的Resnet-Plant3.0數(shù)據(jù)庫(kù)W及來(lái)自 代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)可用。
[0134] 通過(guò)參考并入
[0135] 本文引用的所有的美國(guó)專(zhuān)利、美國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)，和公開(kāi)的PCT申請(qǐng)通過(guò)參考并 入本文。
[0136] 等同原則
[0137] 盡管本文已經(jīng)描述和闡釋了本發(fā)明的數(shù)個(gè)實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到發(fā) 揮功能和/或獲得本文所述的結(jié)果和/或一種或多種優(yōu)勢(shì)的各種其他方式和/或結(jié)構(gòu)，并 且每個(gè)運(yùn)樣的變型和/或修飾視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員不使用過(guò)多的常規(guī) 實(shí)驗(yàn)認(rèn)識(shí)到，或能夠確定本文所述的本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的許多等價(jià)方式。所W，應(yīng)理解前 述實(shí)施方式僅僅作為例子呈現(xiàn)，并且在所附的權(quán)利要求和其等價(jià)方式的范圍內(nèi)；本發(fā)明可 W如具體描述和要求的其他方式實(shí)踐。
[013引 沈QIDNO: 1
[0139]長(zhǎng)度：1250bp
[0140]類(lèi)型：DNA
[014。特征名/關(guān)鍵字：內(nèi)含子，外顯子--包括15化P5'UTR和15化p3'UTR[0142]生物體：黃麻，長(zhǎng)葫黃麻
[0144]沈QIDNO:2
[0145] 長(zhǎng)度：669bp
[0146]類(lèi)型：DNA
[0147] 生物體：黃麻,長(zhǎng)葫黃麻
[0148] 特征名/關(guān)鍵字：CDS
[0149]位置：（1)…..化 69)
CN 10bl64z：6z：A WL wu丄b/i丫貝
[015。沈QIDNO:3
[0152] 長(zhǎng)度：222
[0153] 類(lèi)型：PRT
[0154] 生物體：黃麻，長(zhǎng)葫黃麻
[0156] SEQIDNO：4
[0157] 長(zhǎng)度：123化P
[015引 類(lèi)型：DNA
[0159] 特征名/關(guān)鍵字：內(nèi)含子，外顯子--包括15化P5'UTR和15化p3'UTR
[0160] 生物體潰麻，圓果種黃麻
[0162] SEQIDNO：5
[0163] 長(zhǎng)度：672
[0164] 類(lèi)型：DNA
[016引生物體潰麻，圓果種黃麻
[0166] 特征名/關(guān)鍵字：CDS
[0167] 位置：（1)…..化 72)

[0169] SEQIDNO:6
[0170] 長(zhǎng)度：223
[0171] 類(lèi)型：PRT
[017引生物體潰麻，圓果種黃麻
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 分離的多核苷酸，其編碼WUSCHEL相關(guān)的同源框4多肽并且源自植物長(zhǎng)蒴黃麻，其包 括選自下述的核酸分子： a) 包括SEQ ID NO 2中闡釋的核苷酸序列的核酸分子，或其互補(bǔ)物；和 b) 包括與SEQ ID NO :2中闡釋的核苷酸序列具有至少95%序列同一性的核苷酸序列 的核酸分子，或其互補(bǔ)物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述分離的多核苷酸編碼，其中所述長(zhǎng)蒴黃麻的植物是品種0-4。3. 分離的多核苷酸，其編碼WUSCHEL相關(guān)的同源框4多肽并且源自植物圓果種黃麻，其 包括選自下述的核酸分子： a) 包括SEQ ID NO :5中闡釋的核苷酸序列的核酸分子，或其互補(bǔ)物；和 b) 包括與SEQ ID NO :5中闡釋的核苷酸序列具有至少95%序列同一性的核苷酸序列 的核酸分子，或其互補(bǔ)物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述分離的多核苷酸，其中所述圓果種黃麻的植物是品種CVL-I。5. 分離的WUSCHEL相關(guān)的同源框4多肽，其包括SEQ ID :N0 :3中闡釋的氨基酸序列， 或其生物活性片段，所述多肽包括選自催化長(zhǎng)蒴黃麻的植物中啟動(dòng)、形成、增強(qiáng)和改變從而 修飾韌皮部纖維組成的功能。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的多肽，其中所述長(zhǎng)蒴黃麻的植物是品種0-4。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的多肽，其中所述多肽包括與SEQ ID NO :3中闡釋的氨 基酸序列至少95 %的序列同一性。8. 分離的WUSCHEL相關(guān)的同源框4多肽，其包括SEQ ID NO :6中闡釋的氨基酸序列， 或其生物活性片段，所述多肽包括選自催化圓果種黃麻的植物中啟動(dòng)、形成、增強(qiáng)和改變從 而修飾韌皮部纖維組成的一個(gè)或多個(gè)功能。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離的多肽，其中所述圓果種黃麻的植物是品種CVL-I。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述分離的多肽，其中所述多肽包括與SEQ ID NO :6中闡釋的氨 基酸序列至少95 %的序列同一性。11. 重組基因構(gòu)建體，其包括選自下述的多核苷酸： a) 包括SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :5中闡釋的核苷酸序列的核酸分子，或其互補(bǔ)物； 和 b) 包括與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :5中闡釋的核苷酸序列具有至少95%序列同一 性的核苷酸序列的核酸分子，或其互補(bǔ)物， 其中所述多核苷酸在宿主細(xì)胞中是可表達(dá)的以在長(zhǎng)蒴黃麻和圓果種黃麻的植物中產(chǎn) 生WUSCHEL相關(guān)的同源框4多肽的同系物。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組基因構(gòu)建體，進(jìn)一步包括可操作地連接至a)或b)中 闡釋的核酸分子的啟動(dòng)子區(qū)域，其中所述啟動(dòng)子增強(qiáng)所述核酸分子的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。13. 轉(zhuǎn)化株，其包括能夠表達(dá)多核苷酸的重組基因構(gòu)建體，所述多核苷酸選自下述： a) 包括SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :5中闡釋的核苷酸序列的核酸分子，或其互補(bǔ)物； 和 b) 包括與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :5中闡釋的核苷酸序列具有至少95%序列同一 性的核苷酸序列的核酸分子，或其互補(bǔ)物， 其中所述轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生WUSCHEL相關(guān)的同源框4多肽的同系物。14.產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增加或改善的纖維產(chǎn)率的植物或轉(zhuǎn)基因植物的方法，包 括： a) 在植物細(xì)胞中引入包括多核苷酸的重組基因構(gòu)建體，所述多核苷酸選自： i) 包括SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :5中闡釋的核苷酸序列的核酸分子，或其互補(bǔ)物； 和 ii) 包括與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :5中闡釋的核苷酸序列具有至少95%序列同一 性的核苷酸序列的核酸分子，或其互補(bǔ)物， b) 在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞；和 c) 表達(dá)選自下述的多肽： i) 包括SEQ ID :N0:3或SEQ ID NO :6中闡釋的氨基酸序列的多肽，或其生物活性片 段；和 ii) 與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :6中闡釋的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的 多肽。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了分離的多核苷酸，其編碼來(lái)自?xún)蓚€(gè)黃麻植物物種即長(zhǎng)蒴黃麻(“C.olitorius”)和圓果種黃麻(“C.capsularis”)的WUSCHEL相關(guān)的同源框4蛋白，和源自其的相應(yīng)多肽。公開(kāi)的多核苷酸序列編碼WUSCHEL相關(guān)的同源框4多肽(WOX4)，其具有增強(qiáng)黃麻中纖維生產(chǎn)的催化活性。本發(fā)明也涉及調(diào)制表達(dá)編碼WOX4多肽的核酸的植物，其相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物或其他對(duì)照植物具有改善的纖維產(chǎn)生。也提供了載體、表達(dá)構(gòu)建體和宿主細(xì)胞，其包括和/或由所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列組成。也公開(kāi)了產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法和修飾所述蛋白質(zhì)以便改善它們期望特征的方法。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以各種方式使用，包括誘導(dǎo)、啟動(dòng)、改善或增強(qiáng)植物生長(zhǎng)、植物高度、纖維和種子產(chǎn)生。
【IPC分類(lèi)】C12N15/29, C07K14/415, A01H5/00, C12N15/82
【公開(kāi)號(hào)】CN105164262
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480003587
【發(fā)明人】M.阿拉姆, M.S.伊斯拉姆, B.艾哈邁德, M.S.哈克, M.M.阿拉姆
【申請(qǐng)人】孟加拉朱特研究所
【公開(kāi)日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2014年11月20日
【公告號(hào)】EP2922961A2, EP2922961A4, WO2015077447A2, WO2015077447A3