，2H)，7. 35-7. 39 (m，2H)，7. 14-7. 18 (m，1H)， 7. 05-7. 08 (m, 4H), 6. 85-6. 93 (m, 1H), 6. 38 (dd,J= 14. 8, 21. 2Hz, 1H),5. 55 (s, 1H),5. 50(s ,1H), 5. 21 (brs, 2H), 4. 60-4. 74 (m, 2H), 3. 92-4. 07 (m, 5H), 3. 61-3. 78 (m, 1H), 2. 98&2. 97(s ,3H), 2. 30-2. 86 (m, 2H).m/z= 525 [M+l] +〇
[0254] 實施例15
[0255] (R，E)-5-氨基-I-(I-(4-羥基丁-2-烯酰基）吡咯烷-3-基）-3-(4-苯氧基苯 基）-IH-吡唑-4-甲酰胺
[0256]
[0257] 實施例15的合成通過使用（R)-5-氨基-3-(4-苯氧基苯基）-1-(哌 啶-3-基）-IH-吡唑-4-甲酰胺，類似于實施例1中所述的步驟來完成。
[0258]1HNMR(400MHz，CDCl3)S7. 45-7. 48 (m，2H)，7. 35(t，J= 8. 0Hz，2H)，7. 14(t，J =7. 6Hz，1H)，7. 03-7. 06 (m，4H)，6. 97-7. 01 (m，1H)，6. 33-6. 43 (m，1H)，5. 56(s，1H)，5 .48(s,1H), 5. 20-5. 41(brs,2H), 4. 62-4. 72 (m, 1H), 4. 33-4. 36 (m, 2H), 3. 89-4. 11 (m, 3 H)，3. 60-3. 74 (m，1H)，2. 67-2. 77 (m，0? 5H)，2. 49-2. 62 (m，0? 5H)，2. 26-2. 44 (m，1H) ?m/z= 448[M+l]+。
[0259] 實施例16
[0260] (R) -5-氨基-3- (4-苯氧基苯基）-I- (1- 丁 -2炔酰胺基吡咯烷-3-基）-IH-吡 唑-4-甲酰胺
[0261]
[0262] 實施例16的合成通過使用（R)-5-氨基-3-(4-苯氧基苯基）-1-(哌 啶-3-基）-IH-吡唑-4-甲酰胺，類似于實施例1中所述的步驟來完成。
[0263]1HNMR(400MHz，CDCl3)S7. 48-7. 51 (m，2H)，7. 35-7. 39 (m，2H)，7. 14-7. 17 (m，1H)， 7. 05-7. 08 (m, 4H),5. 65(s,1H),5. 62(s,1H),5. 30(brs,2H),4. 70-4. 73 (m, 1H),3. 95-4. 15 ( m，2H)，3. 78-3. 87 (m，I. 5H)，3. 58-3. 61 (m，0? 5H)，2. 57-2. 65 (m，1H)，2. 34-2. 39 (m，1H)，2. 0 0&1. 97(s，3H)?m/z= 430 [M+l]+。
[0264] 實施例17
[0265] (R)-5_氨基-3-(4-苯氧基苯基）-1-(1-(丙炔酰基）吡咯烷-3-基）-lH_吡 唑-4-甲酰胺
[0266]
[0267] 實施例17的合成通過使用丙炔酸與（R)-5-氨基-3-(4-苯氧基苯基）-1-(哌 啶-3-基）-IH-吡唑-4-甲酰胺，經(jīng)HOBt及EDCI在DMF中縮合來完成。
[0268] 1H NMR (400MHz，CDCl3) S 7. 48-7. 50 (m，2H)，7. 35-7. 39 (m，2H)，7. 14-7. 17 (m，1H)， 7. 05-7. 08 (m, 4H), 5. 63 (s, 1H), 5. 61 (s, 1H), 5. 30 (brs, 2H), 4. 72-4. 75 (m, 1H), 3. 82-4. 14 ( m, 3. 5H), 3. 61-3. 64 (m, 0. 5H), 3. 08&3. 04 (s, 1H), 2. 58-2. 66 (m, 1H), 2. 35-2. 41 (m, 1H). m/z =416[M+l]+。
[0269] 實施例18
[0270] (R) -5-氨基-I- ((Is，4s) -4- 丁 -2炔酰胺基環(huán)己基）-3- (4-苯氧基苯基）-IH-吡 唑-4-甲酰胺
[0271]
[0272] 實施例18的合成通過類似于實施例1中所述的步驟來完成。
[0273]1H NMR (400MHz，CDCl3) S 7. 50-7. 52 (m，2H)，7. 36-7. 40 (m，2H)，7. 14-7. 18 (m，1H)， 7. 04-7. 10 (m, 4H), 6. 09 (d, J = 8. 0Hz, 1H), 5. 44 (s, 2H), 5. 22 (brs, 2H), 4. 22-4. 25 (m, 1H), 3.86-3.88(m，1H)，1.61-2. 13 (m，8H), 1.94 (s，3H).m/z = 458 [M+l]+。
[0274] 生物活性實驗
[0275] 化合物的生物學(xué)活性
[0276] 對BTK的體外抑制活件（1(?倌的測定）
[0277] 本專利中化合物對BTK的半抑制濃度（IC5。值）在酶學(xué)水平和細(xì)胞學(xué)水平都進(jìn)行 了測定：在酶活反應(yīng)中測定其對BTK激酶活性的抑制能力，同時在細(xì)胞學(xué)功能分析中測定 了化合物對細(xì)胞中BCR誘導(dǎo)的鈣流的抑制作用。
[0278] 采取勻相時間分辨熒光（HTRF)方法建立了 BTK的激酶活性檢測平臺，進(jìn)行化合物 活性的測定。將化合物從ImM開始用100%DMS0進(jìn)行3倍的梯度稀釋（共11個濃度），每 個濃度取41^加入到961^的反應(yīng)緩沖液中（5〇1111冊?￡5，口117.4，1〇11111%(：1 2，11111￡6丁八， 0.01%1￥6611-20,0.005%8厶5,2111101'1')，取2.51^加入到 384 孔板（(^衍？13七6-384，購 買于PerkinElmer)，然后加入5 ii L的BTK激酶（購買于Millipore)，離心混勻，再加入 2. 5 ii L 的 ATP (終濃度為 Kni 值）與 TK petide ( HTRjp? KinEASE?-TK，購買于 Cisbio)混 合物啟動反應(yīng)（總反應(yīng)體積為10 U U。將384孔板放于孵育箱中23°C反應(yīng)120分鐘，然后 加入5 ii L的Eu3+穴狀化合物標(biāo)記的抗磷酸酪氨酸抗體（購買于Cisbio)，5 ii L的鏈霉親 和素-XL-665( BTJRJp_' KinEASE?-TK，購買于Cisbio)停止反應(yīng)。在孵育箱中孵育1小時 后，在Envision (購買于PerkinElmer)上讀取突光值（320nm激發(fā)，檢測665nm與615nm的 發(fā)射光，二者比值為酶活性）。每個化合物化合物分別在11個濃度下測定酶的活性，數(shù)據(jù)使 用GraFit6. 0軟件（Erithacus Software)計算得到該化合物的IC50值。
[0279] 鈣流試驗使用 Flu〇-4Direct?Calcium Assay Kits (購買于 Invitrogen)檢測試 劑盒，測定化合物對細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放的抑制能力。按照檢測試劑盒的說明在FlexStation III (購買于Molecular Devices)上進(jìn)行操作，具體操作步驟如下。Ramos細(xì)胞用 RPMI-1640(購買于Invitrogen)加10%胎牛血清（購買于Hyclone)培養(yǎng)，離心沖洗后用 低血清培養(yǎng)基重新鋪到96孔板（購買于Corning)中（IXlO5細(xì)胞/45 ii L/孔），然后加入 45 ii L的熒光染料（購買于Invitrogen) 37°C孵育1小時。待檢測化合物用DMSO進(jìn)行3 倍的梯度稀釋，然后用低血清培養(yǎng)基稀釋100倍，取10 P L加入到鋪好細(xì)胞的96孔板（購 買于Corning)中（DMS0的終濃度為0. 1 % )，將96孔板（購買于Corning)放置在孵箱中 (37°C，5% CO2)孵育30分鐘?；衔锾幚磉^的細(xì)胞加山羊抗人IgM抗體（IOii g/ml ;購買 于SouthernBiotech)刺激后在FlexStation III上讀取突光值（494nm激發(fā)，516nm檢測 90秒）。每個化合物的數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism5 (GraphPad Software)擬合處理，計算得 到相應(yīng)的IC5。值。
[0280] 所選的部分化合物的生物學(xué)數(shù)據(jù)
[0281] 根據(jù)本文所述的生物學(xué)方法對上述制備的所選化合物進(jìn)行分析。其結(jié)果顯示于下 表：
[0282] 化合物的ICm值。




[0288] 在小鼠皮下異種移棺瘤樽型中有效件的測定
[0289] SPF級CB-17SCID小鼠，雌性，4-5周齡。將無血清培養(yǎng)基混懸的0CI-LY-10細(xì)胞懸 液0.1 ml (含5. OX IO6ceIls, 30 % Matrigel)皮下注射于每只小鼠左右兩側(cè)腋下部位。待 平均腫瘤體積大于IOOmm3時，將各鼠按流水號標(biāo)記，分別測量其腫瘤大小及體重，按腫瘤體 積從小到大隨機(jī)分組，并適當(dāng)調(diào)整使各組動物的平均體重亦處于同一水平。分組當(dāng)天開始 口服給藥，期間每周測量腫瘤體積及體重2次。主要以相對腫瘤增值率（T/C)及腫瘤生長 抑制率（TGI)為檢測指標(biāo)。
[0290] 腫瘤體積計算公式為V = 0. 5XaXb2,其中V為腫瘤體積，a和b分別為腫瘤的長 和寬。根據(jù)腫瘤體積計算相對腫瘤體積（relative tumor volume，RTV)，計算公式為：RTV = Vt/V。，其中V。為分組給藥時測量所得腫瘤體積，Vt為每一次測量時的腫瘤體積。相對腫瘤 增值率計算公式為：T/C(% )=Trtv/Crtv*100%。（Trtv :治療組RTV ;CRTV :陰性對照組RTV)。
[0291] 腫瘤生長抑制率計算公式為TGI (%) = (1_(治療組腫瘤體積-治療組分組時腫 瘤體積）八對照組腫瘤體積-對照組分組時腫瘤體積））*1〇〇 %
[0292]
[0293] 小鼠毒件實駘
[0294] 20只雄性CD-I (ICR)小鼠（來源于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物大 約5周齡，體重范圍從18到24克）分為4組，每組5只動物，分別口服灌胃給與溶媒（20% 磺丁基醚-P-環(huán)糊精溶液），實施例9混懸液（1000mg/kg)，和實施例16混懸液（1000 mg/ kg)。每天一次，連續(xù)7天。每天稱量體重并觀察動物的健康狀況。整個過程所有動物均不
[0295] 經(jīng)過7天的連續(xù)給藥，所有動物都沒有發(fā)現(xiàn)健康異常。下面表1是小鼠平均體重 的數(shù)據(jù)，可見所有動物體重都在增長，而且變化相似。表2是給藥組小鼠平均體重相對于溶 媒對照組體重變化的百分比，可見實施例9和實施例16給藥組跟溶媒對照組比很接近（相 差小于2% )，不顯示毒性。
[0296] 表1?小鼠平均體重數(shù)據(jù)（克）
[0298]表2.給藥組小鼠平均體重相對于溶媒對照組體重變化的百分比（％ )
【主權(quán)項】
1. 式（III)的化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、活性代謝物、多晶型物、酯、異 構(gòu)體或前藥，其中， Y選自未取代或取代的烷基，或者是4元、5元、6元環(huán)烷基環(huán)；且R15選自H或低級燒 基； 或者， Y和R15可以結(jié)合在一起形成一個4元、5元或者6元的雜環(huán)； G選自H、或其中， R7、R8和R9分別獨立地選自H、鹵素、-COOH、未取代或取代的低級烷基、未取代或取代的 低級雜烷基； R6 選自H、s 烷基，-(CH2)nC3 7 環(huán)烷基、-(CH2)nC2 9 雜環(huán)烷基、_ (CH2)n-0H、- (CH2)n-(CHOH)n-H、-(CH2)n-0-(CH2)nCH3、-(CH2)n-S-(CH2)nCH3、_(CH2)n_NH2、s 烷 基）、-(CH2)n_N(Qs 烷基）2、_C(0)Qs 烷基； n是0、1、2、3或 4。2. 如權(quán)利要求1所述的化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、活性代謝物、多晶型 物、酯、異構(gòu)體或前藥，其中3. 如權(quán)利要求1所述的化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、活性代謝物、多晶型 物、酯、異構(gòu)體或前藥，其中 G選自其中R7選自H、-COOH以及任選地被 以下基團(tuán)取代的低級烷基：鹵素、-OH、-0-低級烷基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、雜環(huán) 烷基氨基、烷?；趸?、烷基磺酰氨基；其中R7選自H和低級烷基；優(yōu)選地選4. 如權(quán)利要求1所述的化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、活性代謝物、多晶型 物、酯、異構(gòu)體或前藥，其中5. 如權(quán)利要求1所述的化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、活性代謝物、多晶型 物、酯、異構(gòu)體或前藥，其中所述化合物選自：6. 藥用組合物，包含治療有效量的權(quán)利要求1-5中任一項的化合物、或其藥學(xué)上可接 受的鹽、溶劑化物、活性代謝物、多晶型物、酯、異構(gòu)體或前藥，以及任選地藥物可接受的賦 形劑。7. 權(quán)利要求1-5中任一項的化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、活性代謝物、多 晶型物、酯、異構(gòu)體或前藥在制備用于治療或者預(yù)防異種免疫性疾病、炎性疾病、哮喘、關(guān)節(jié) 炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、癌癥例如B細(xì)胞增生癥，優(yōu)選地慢性淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、彌漫 性大細(xì)胞淋巴瘤、濾泡型淋巴瘤或慢性淋巴細(xì)胞白血病的中的用途。8.權(quán)利要求1-5中任一項的化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、活性代謝物、多 晶型物、酯、異構(gòu)體或前藥在制備用于預(yù)防或治療哺乳動物（特別是人）中與過度Btk活性 相關(guān)疾病的藥物中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及式(III)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、活性代謝物、多晶型物、酯、異構(gòu)體或前藥，包含式(III)的化合物的藥物組合物及其作為選擇性布魯頓酪氨酸激酶的不可逆抑制劑用于預(yù)防或治療炎癥、與異常B細(xì)胞增殖相關(guān)的自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)和癌癥的用途。
【IPC分類】C07D231/38, A61K31/4155, A61P19/04, A61K31/5377, C07D401/04, A61P35/00, C07D403/04, A61P19/02, A61P11/06, A61P29/00, A61P37/02, A61K31/454, A61P35/02, A61K31/415
【公開號】CN105085474
【申請?zhí)枴緾N201410191608
【發(fā)明人】韓永信, 祝力, 校登明, 彭勇, 羅鴻
【申請人】北京賽林泰醫(yī)藥技術(shù)有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2014年5月7日
【公告號】WO2015169233A1