因為抗病毒MIP主要通過印跡孔穴保持對靶病毒有特異性吸附，這種吸附特異性不受干擾物的影響。
[0096]試驗例4抗病毒MIP在不同環(huán)境條件下的吸附特性
[0097]病毒顆粒在中性條件下能最好地保持形態(tài)和活性的穩(wěn)定性，因此前期實驗中的緩沖液PH均為7。但MIP可能在不同pH的環(huán)境下使用。為驗證pH對抗病毒MIP吸附特性的影響，將1mg實施例1中制備的抗病毒MIP和對比例I中制備的NIP加入含103pfu/mLf2噬菌體的緩沖液中，緩沖液的pH值分別為5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0和8.5，室溫下震搖2h，雙層瓊脂培養(yǎng)法測定上清中病毒含量，并計算吸附量。從圖6a可見，抗病毒MIP在pH為6.0?8.0的范圍內(nèi)對f2噬菌體的吸附保持穩(wěn)定。過高或過低的pH均會影響病毒分子的結(jié)構(gòu)，從而干擾抗病毒MIP對靶病毒的識別和結(jié)合能力。
[0098]將1mg上述抗病毒MIP和NIP加入含103pfu/mL f2噬菌體的緩沖液中，緩沖液還分別含有不同濃度的氯化鈉，室溫下震搖2h，雙層瓊脂培養(yǎng)法測定上清中病毒含量，并計算吸附量?？蓮膱D6b中看出，在氯化鈉溶液中，抗病毒MIP對噬菌體f2的吸附能力維持在25pfu/mL?32pfu/mL之間，并未隨著氯化鈉濃度的增加而下降，表現(xiàn)出良好的抗鹽干擾性會K。
[0099]血液是具有一定粘稠度的液體。為了模擬血液的粘稠環(huán)境，聚乙二醇(PEG8000)被加入到 SM 緩沖溶液(NaCl 5.8g, MgSO4.7H20 2g, pH 值為 7.5 的 lmol/L 的 Tris-HCL 緩沖液50mL，2%的明膠5mL溶解于去離子水，最后定容至1L)中來增加其粘稠度。用旋轉(zhuǎn)式黏度計對該緩沖液的比粘度進行測量，切變率在20s_1，溫度為37°C時，其比粘度在16?18之間，與血液的比粘度接近。將1mg上述抗病毒MIP和NIP加入含103pfu/mL f2噬菌體的緩沖液中，緩沖液還分別含有5%、10 %、15%、20 %的聚乙二醇。室溫下震搖2h，雙層瓊脂培養(yǎng)法測定上清中病毒含量，并計算病毒MIP的吸附量。圖6c顯示，抗病毒MIP對f2噬菌體的吸附容量在不同濃度PEG8000的緩沖液中均為36pfu/mg?40pfu/mg。雖然PEG8000對病毒顆粒的具有良好的親和力和粘性，但并不能干擾抗病毒MIP對靶病毒的特異性吸附能力。證明本發(fā)明所制備的抗病毒MIP適合在血液等粘稠的液體中使用。
[0100]將已經(jīng)吸附了 f2噬菌體的上述抗病毒MIP和NIP，置于純水中震蕩30分鐘并重復(fù)6次，再次測定其吸附特性；再震蕩重生，再測定吸附特性，分別測定第O次、第2次、第4次和第6次循環(huán)后的吸附容量，實驗結(jié)果如圖6d所示。從圖上可以看出，經(jīng)去離子水洗滌再生的抗病毒MIP，連續(xù)使用6個循環(huán)，MIP的吸附能力并未發(fā)生明顯下降。
[0101 ] 試驗例5抗病毒MIP的抗感染特性
[0102]利用病毒感染靶細胞形成的噬菌斑數(shù)量，檢測被抗病毒MIP吸附的病毒是否具有對宿主菌的感染能力。不同濃度實施例1中制備的抗病毒MIP或?qū)Ρ壤齀中制備的NIP(10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL)與 200uL 含 200pfu f2 噬菌體的緩沖液反應(yīng) 2h后，雙層瓊脂培養(yǎng)法測定上清液中的病毒含量(pfu/mL)，并計算吸附量(pfu/mg)。圖7a顯示，在f2噬菌體的濃度為103pfu/mL條件下，隨著抗病毒MIP濃度增加，其抗病毒感染性能增強，呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系；而陰性對照NIP濃度與抗病毒感染能力無相關(guān)性。這是因為被抗病毒MIP吸附的噬菌體無法再感染其宿主大腸桿菌，因此抗病毒MIP可顯著降低病毒的感染性，用于預(yù)防病毒感染，如圖1所示。
[0103]在200uL含200pfu f2噬菌體的緩沖液中，分別加入10mg/mL和20mg/mL的上述抗病毒MIP和NIP，在不同時間停止反應(yīng)，并利用雙層瓊脂培養(yǎng)法測定上清液中的病毒含量(pfu/mL)以及并計算吸附量(pfu/mg)。描繪不同條件下噬菌體的時間增殖曲線。圖7b顯示，抗病毒MIP組相比于NIP組與空白對照組(只加入f2噬菌體，不加入抗病毒MIP和NIP)，噬菌體到達增殖平臺期的時間被推遲，呈現(xiàn)劑量依賴性生長延遲效應(yīng)，而NIP組與空白對照組的生長曲線近乎吻合，說明抗病毒MIP可有效減緩噬菌體的生長，而NIP則無此效應(yīng)。只有在隨著時間的推移，噬菌體的增殖超過抗病毒MIP的吸附容量時，噬菌體f2的數(shù)量才逐漸恢復(fù)。
[0104]試驗例6抗病毒MIP的細胞毒性
[0105]將10mg/ml實施例1中制備的抗病毒MIP或?qū)Ρ壤齀中制備的NIP加入小鼠紅細胞中，4°C孵育30min后，15000g離心5min，上清液稀釋10倍后，分光光度計測541nm吸光值。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的聚乙二醇辛基苯基醚作為陽性對照，生理鹽水為陰性對照。結(jié)果如圖8a所示，表明無論抗病毒MIP或NIP均未引起紅細胞溶血。
[0106]將不同濃度的抗病毒MIP 和 NIP (O, 0.lmg/mL, 0.2mg/mL, 0.5mg/mL, lmg/mL, 2mg/mL, 5mg/mL, lOmg/mL)加入H印G2細胞，暴露24小時后，MTT法測定細胞的存活率。圖8b顯示抗病毒MIP組和NIP組對!fepG2細胞無明顯毒性。
[0107]圖8表明用過硫酸銨作為氧化劑制備的抗病毒MIP不會引起明顯的細胞毒效應(yīng)，具有良好的生物兼容性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有應(yīng)用價值。
[0108]試驗例7不同抗病毒MIP抑制相應(yīng)靶病毒感染性
[0109]將實施例1、實施例6、實施例7、實施例8中制備的抗病毒MIP或?qū)Ρ壤齀中制備的NIP，分別以10mg/mL和40mg/mL的濃度與200uL含200pfu病毒的緩沖液混合，反應(yīng)2h后，雙層瓊脂培養(yǎng)法測定上清液中的病毒含量(Pfu/mL)，并計算吸附量(pfu/mg)。圖7顯示各種病毒的抗MIP均對靶病毒有很好的特異性結(jié)合能力。因此本發(fā)明所公開的抗病毒MIP制備方法適用于包括人類病毒在內(nèi)的多種病毒，在控制病毒的感染和增殖中有很好的應(yīng)用前景。
[0110]本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種抗病毒分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于:首先，在過硫酸銨的催化下，將載體材料表面修飾多巴胺納米膜，形成多巴胺-載體材料復(fù)合體；然后，將靶病毒與多巴胺-載體材料復(fù)合體相結(jié)合，形成病毒-多巴胺-載體材料復(fù)合體；最后從所述復(fù)合體上將所述靶病毒洗脫，即得到抗病毒分子印跡聚合物； 抗病毒分子印跡聚合物表面有所述靶病毒洗脫后形成的印跡孔穴，用于特異性結(jié)合所述靶病毒。2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，具體步驟如下: 步驟一:載體的表面修飾 向多巴胺緩沖液中加入載體材料，緩慢攪拌充分反應(yīng)后棄掉緩沖液，即得到多巴胺-載體材料復(fù)合體； 其中，所述載體材料為納米級微球、微米級微球或濾膜； 所述多巴胺緩沖液的配置方法為，將過硫酸銨與多巴胺以3:2?3:1的摩爾比溶于pH值為7.0?8.5的Tris-HCl緩沖溶液中； 步驟二:病毒-多巴胺-載體材料復(fù)合體的生成 向所述多巴胺緩沖液中加入所述多巴胺-載體材料復(fù)合體和靶病毒，緩慢攪拌充分反應(yīng)后棄掉緩沖液，即得到病毒-多巴胺-載體材料復(fù)合體； 所述靶病毒在緩沖液中的濃度為108pfu/mL?1014pfu/mL ; 步驟三:洗脫靶病毒 反復(fù)洗滌所述病毒-多巴胺-載體材料復(fù)合體，使所述靶病毒洗脫，即得到抗病毒分子印跡聚合物。3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，過硫酸銨與多巴胺的摩爾比為2:1。4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，Tris-HCl緩沖溶液的PH值為7.5。5.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述載體材料為二氧化硅微球。6.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述靶病毒為f2噬菌體、T4噬菌體、流感病毒或手足口病病毒。7.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟三的具體方法為:先用洗滌液洗滌步驟二得到的病毒-多巴胺-載體材料復(fù)合體4次?8次，每次30min?50min，再用三蒸水洗滌4次?8次，每次30min?50min，即得到抗病毒分子印跡聚合物； 所述洗滌液為，含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的醋酸以及摩爾濃度為lmol/L的NaCl的水溶液。8.一種利用權(quán)利要求1所述方法制備的抗病毒分子印跡聚合物。9.一種再生如權(quán)利要求8所述抗病毒分子印跡聚合物的方法，其特征在于，將所述抗病毒分子印跡聚合物置于純水中超聲震蕩20min?40min，更換純水并重復(fù)4次?8次。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗病毒分子印跡聚合物的制備方法，首先在載體材料上修飾多巴胺納米膜，然后將靶病毒與修飾了多巴胺納米膜的載體材料相結(jié)合，形成病毒-多巴胺-載體材料復(fù)合體，最后再從復(fù)合體上將靶病毒洗脫，即得到相應(yīng)的抗病毒分子印跡聚合物。本發(fā)明的抗病毒分子印跡聚合物可利用病毒洗脫后留下的印跡孔穴，特異性結(jié)合靶病毒，并抑制靶病毒增殖以及感染宿主；該抗病毒分子印跡聚合物具有使用特異性好、使用環(huán)境友好以及再生簡單的優(yōu)點，在生物免疫領(lǐng)域有良好的使用前景。
【IPC分類】C08G73/02, B01J20/30, C08J9/26, B01J20/26
【公開號】CN104945623
【申請?zhí)枴緾N201510387979
【發(fā)明人】呂斌, 劉燕婕, 石云, 劉飛, 羅密芳
【申請人】華中科技大學(xué)
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年7月3日