一種抗病毒分子印跡聚合物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物免疫技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種抗病毒分子印跡聚合物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人類的很多疾病由病毒引起，免疫法和抗病毒藥物是抗病毒治療的兩種方法，其中免疫法是目前控制病毒感染的最有效方法。免疫法包括免疫接種以及利用含抗體的血清進(jìn)行被動(dòng)免疫，但疫苗、免疫球蛋白等免疫性制劑是蛋白質(zhì)，其制備往往需要活體動(dòng)物，制備過程復(fù)雜，且對(duì)溫度、離子、pH敏感，不易保存。此外，蛋白制劑易于引起過敏反應(yīng)，部分人群不能使用。由于這些特點(diǎn)，某些新發(fā)和高致死性病毒，如埃博拉病毒、HIV病毒等，至今尚缺乏適宜的免疫制劑。因此，開發(fā)有效的非蛋白類免疫制劑，是預(yù)防和治療病毒性疾病的主要方向之一。
[0003]分子印跡技術(shù)可制備在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)上與靶分子(模板分子)匹配的人工抗體，這種人工抗體又被稱為分子印跡聚合物(molecular imprinting polymers, MIP)。分子印跡聚合物是化學(xué)合成的高分子聚合物，通過特定的空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵(包括共價(jià)鍵、離子鍵、氫鍵等)特異性識(shí)別和結(jié)合靶分子，其吸附特異性與天然抗體類似，但耐受有機(jī)溶劑、離子、酸堿、高溫和高壓。分子印跡聚合物已應(yīng)用于天然抗體模擬，模擬酶催化，控緩釋藥物等諸多領(lǐng)域。
[0004]病毒人工抗體已有少量研宄，大部分工作是利用人工抗體對(duì)靶病毒的特異性結(jié)合能力，檢測(cè)革E病毒。如Bolisay等利用聚丙稀胺制備煙草花葉病毒(Tobacco mosaicvirus, TMV)的分子印跡水凝膠(Bolisay, L.D., et al.Molecularly imprinted polymersfor tobacco mosaic virus recognit1n.B1materials.2006，27 (22): 4165-4168.)，可特異性識(shí)別煙草花葉活病毒，而對(duì)死病毒沒有識(shí)別能力(Bolisay, L.D.，et al.0ptimizat1nof virus imprinting methods to improve selectivity and reduce nonspecificbinding.B1macromolecules.2007，8 (12): 3893-3899.)。Cumbo 等利用表面印跡法合成了可特異性結(jié)合花葉病毒(turnip yellow mosaic virus)的分子印跡聚合物，這種分子印跡聚合物在人血清中也展現(xiàn)出很高的吸附能力(Cumbo，A.，et al.A syntheticnanomaterial for virus recognit1n produced by surface imprinting.NatureCommunicat1ns.2013，4:1503.) 0 Sankarakumar等運(yùn)用乳液聚合法合成了大腸桿菌■菌體fr的人工抗體，顯示該人工抗體可以降低■菌體感染祀細(xì)菌的能力(Sankarakumar，N.and Y.W.Tong.Preventing viral infect1ns with polymeric virus catchers: a novelnanotechnological approach to ant1-viral therapy.Journal of Materials ChemistryB.2013，I (15):2031-2037.)。但以上工作中，分子印跡聚合物是在有機(jī)溶液或含水的有機(jī)溶液中制備的，由于病毒是大分子化合物，在有機(jī)溶液中易變性，影響其形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致結(jié)合效果不佳。此外，在有機(jī)溶劑中制備的分子印跡聚合物，生物兼容性差，不適合體內(nèi)使用。目前沒有研宄系統(tǒng)分析病毒分子印跡聚合物的毒性和生物兼容性；可制備植物病毒或細(xì)菌病毒分子印跡聚合物的方法，是否適合用于制備人類病毒的分子印跡聚合物，目前也尚無相應(yīng)的報(bào)道。
[0005]多巴胺在堿性溶液(pH>8.5)中可進(jìn)行自聚合，多巴胺自聚合體系為水溶性合成體系，不使用有機(jī)溶劑，適合制備蛋白質(zhì)等生物大分子的人工抗體，但是該體系尚未用于制備病毒MIP，主要的原因有兩個(gè):(1)多巴胺自聚合膜的厚度在1nm?50nm之間，而大部分病毒直徑大于50nm，直接將病毒與多巴胺自聚合體系混合進(jìn)行自聚合，印跡效果不佳；(2)多巴胺自聚合反應(yīng)需要在堿性(pH>8.5)條件下進(jìn)行，病毒在堿性條件下容易變性，影響印跡效果。因此，以全病毒分子為模板分子制備病毒人工抗體時(shí)，需要對(duì)多巴胺印跡體系進(jìn)行改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷，本發(fā)明提供了一種抗病毒分子印跡聚合物的制備方法，通過對(duì)催化劑的選擇和對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，使得多巴胺能在環(huán)境條件更加溫和的情況下與靶病毒進(jìn)行結(jié)合，從而生成具有優(yōu)良性能的病毒人工抗體。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種抗病毒分子印跡聚合物，其特征在于:
[0008]首先，在過硫酸銨的催化下，將載體材料表面修飾多巴胺納米膜，形成多巴胺-載體材料復(fù)合體；然后，將靶病毒與多巴胺-載體材料復(fù)合體相結(jié)合，形成病毒-多巴胺-載體材料復(fù)合體；最后從所述復(fù)合體上將所述靶病毒洗脫，即得到抗病毒分子印跡聚合物；
[0009]抗病毒分子印跡聚合物表面有所述靶病毒洗脫后形成的印跡孔穴，用于特異性結(jié)合所述靶病毒，并抑制所述靶病毒增殖以及感染宿主。
[0010]優(yōu)選地，具體步驟如下:
[0011]步驟一:載體的表面修飾
[0012]向多巴胺緩沖液中加入載體材料，緩慢攪拌使之充分反應(yīng)后棄掉緩沖液，在此過程中，多巴胺在過硫酸胺的催化下聚合在載體材料表面，得到多巴胺-載體材料復(fù)合體；
[0013]所述多巴胺緩沖液的配置方法為，將過硫酸銨與多巴胺以3:2?3:1的摩爾比溶于PH值為7.0?8.5的Tris-HCl緩沖溶液中；
[0014]步驟二:病毒-多巴胺-載體材料復(fù)合體的生成
[0015]向多巴胺緩沖液中加入步驟一得到的多巴胺-載體材料復(fù)合體和靶病毒，緩慢攪拌使之充分反應(yīng)后棄掉緩沖液，即得到病毒-多巴胺-載體材料復(fù)合體；
[0016]所述靶病毒在緩沖液中的濃度為108pfu/mL?1014pfu/mL ；
[0017]步驟三:洗脫靶病毒
[0018]反復(fù)洗滌步驟二得到的病毒-多巴胺-載體材料復(fù)合體，使所述靶病毒洗脫，即得到抗病毒分子印跡聚合物；靶病毒從復(fù)合體上洗脫后留下的印跡孔穴，可用于特異性結(jié)合靶病毒，使得所述的抗病毒分子印跡聚合物具有抗病毒效果；
[0019]其中，所述載體材料為納米級(jí)微球、微米級(jí)微球或?yàn)V膜，如二氧化硅微球、四氧化三鐵納米微球、硝酸纖維濾膜等；當(dāng)載體材料為微球時(shí)，步驟一和步驟二中可通過離心的方法棄掉緩沖液；當(dāng)載體材料為濾膜時(shí)，步驟一和步驟二中可通過直接取出濾膜的方法棄掉緩沖液。
[0020]作為進(jìn)一步優(yōu)選地，過硫酸銨與多巴胺的摩爾比為2:1。
[0021]作為進(jìn)一步優(yōu)選地，Tris-HCl緩沖溶液的PH值為7.5。
[0022]作為進(jìn)一步優(yōu)選地，所述靶病毒為f2噬菌體、T4噬菌體、流感病毒或手足口病病毒。
[0023]作為進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟三的具體方法為:先用洗滌液洗滌步驟二得到的病毒-多巴胺-載體材料復(fù)合體4次?8次，每次30min?50min，再用三蒸水洗滌4次?8次，每次30min?50min，即得到抗病毒分子印跡聚合物；
[0024]所述洗滌液為，含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3 %的醋酸以及摩爾濃度為lmol/L的NaCl的水溶液。
[0025]本發(fā)明還提供了一種利用該方法制備的抗病毒分子印跡聚合物。
[0026]本發(fā)明還提供了一種再生該抗病毒分子印跡聚合物的方法，其特征在于，將所述抗病毒分子印跡聚合物置于純水中超聲震蕩20min?40min，更換純水并重復(fù)4次?8次。
[0027]總體而言，通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果:
[0028]1、通過將載體材料表面修飾多巴胺，保證了抗病毒分子印跡聚合物的制備效率和特異性；
[0029]2、使用過硫酸銨對(duì)抗病毒分子印跡聚合物的制備條件進(jìn)行優(yōu)化，使修飾了多巴胺聚合物的載體材料與靶病毒結(jié)合的過程，在PH值友好的條件下進(jìn)行，靶病毒不易變形，保證了抗病毒分子印跡聚合物對(duì)靶病毒的特異性識(shí)別能力；
[0030]3、用該方法制備的抗病毒分子印跡聚合物重生方法簡(jiǎn)單，經(jīng)過多次循環(huán)后仍然有著優(yōu)良的性能，可以降低使用成本，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益；
[0031]4、該抗病毒分子印跡聚合物可在多種pH值，氯化鈉濃度以及比粘度的溶液中依然保持良好的吸附性，適用于多種環(huán)境條件；
[0032]5、該抗病毒分子印跡聚合物對(duì)紅細(xì)胞、人胚肝細(xì)胞無明顯毒性。
【附圖說明】
[0033]圖1是本發(fā)明一種抗病毒分子印跡聚合物(MIP)的制備方法的流程圖；
[0034]圖2為實(shí)施例和對(duì)比例中，當(dāng)催化劑過硫酸銨與多巴胺在不同的摩爾比之下制備的抗病毒分子印跡聚合物(MIP)和空白印跡聚合物(NIP)的吸附容量；
[0035]圖3為實(shí)施例1、實(shí)施例2中制備的抗病毒MIP以及對(duì)比例1、對(duì)比例2制備的NIP的掃描電鏡和透射電鏡圖；
[0036]圖4為實(shí)施例1中制備的抗病毒MIP、對(duì)比例I中制備的NIP以及硅膠顆粒的傅里葉變換紅外光譜；
[0037]圖5為實(shí)施例1中制備的抗病毒MIP的吸附動(dòng)力學(xué)曲線以及對(duì)不同噬菌體的吸附容量特性；
[0038]圖6a-圖6d分別為實(shí)施例1中制備的抗病毒MIP在不同的pH值、NaCl濃度、聚乙二醇濃度