了實現(xiàn)多次酶周轉(zhuǎn)，將H 2以等 體積比包括在氣體混合物中。通過在轉(zhuǎn)型與未轉(zhuǎn)型的細胞之間比較80°C下所觀測到的丙烯 氧化活性的差異來確定嗜熱PMMO活性。
[0195] 氣相色譜法.用含有填充有 80 X 100 目 Carbopack C+0. 1% SP-1000 (Supelco)的 玻璃柱（2. 6mm內(nèi)徑，3. Im)的Shimadzu GC-14A型氣相色譜儀來定量環(huán)氧丙烷形成。氣相 色譜儀用A0C-17自動注射器和Shimadzu CR_601Chromatopac記錄器構造。氦氣用作載氣 (20ml/min)。注射器和檢測器（火焰離子化檢測器）溫度分別是20(TC和175°C。將含水 樣品在80°C下等溫操作6分鐘。在單時間點試驗中通過將峰面積與標準回歸曲線相比較來 定量產(chǎn)物形成。
[0196] 實施例7 :在莢膜甲基球菌甲烷營養(yǎng)菌中由熱穩(wěn)定的pMMO產(chǎn)生醇。
[0197] 將上文所描述的熱穩(wěn)定的pMMO轉(zhuǎn)型的莢膜甲基球菌菌株的瓶生長培養(yǎng)物以 1:100接種至3L New Brunswick夾套型發(fā)酵容器中的IL NMS培養(yǎng)基中。在50mL/min甲 燒和100mL/min 02的恒定進料下以800rpm攪拌培養(yǎng)物。適當時通過在線添加 NaOH和HCl 來維持pH。將溫度維持于45°C。NaN03、KHP04、CuSO4以及Fe-EDTA的添加是根據(jù)細胞的生 長速率以一定時間間隔進行。在晚對數(shù)期（0D約15)通過離心收集細胞并且如上述用MOPS 緩沖液洗絳。
[0198] 將細胞固定于固相支撐體上，例如IS0LITE?，其為硅藻土產(chǎn)品（78% Si02、12% Al2O3以及5 % Fe 203)，這種固相支撐體用于固定細胞并且用于土壤通氣。這是對許多有機分 子沒有吸附能力的惰性材料。在去離子水中預先洗滌IS0LITE?以除塵，然后在120°C下在 烘箱中干燥48小時。將再懸浮細胞的300ml樣品添加至燒瓶中的150克IS0LITE?中。然 后，將燒瓶放置在孵育箱/振蕩器上（20rpm，在75°C下）一小時以使細胞結(jié)合至IS0LITE?。 然后從IS0LITE?中去除水相，并且干燥固相并填充至標準的Icm直徑不銹鋼反應器中。將 反應器加熱至80°C并且連接至lOmL/min 10:10:10:10:50甲烷：乙烷：丙烷：丁烷：02的 進料。這種進料與用以再生pMMO催化劑的10mL/min H2氣的進料交替進行。反應器出口 以1:100分割用于通過氣相色譜法進行連續(xù)廢氣分析，而大部分流傳送至冷凝器以捕獲水 與產(chǎn)物醇。通過氣相色譜法以及通過在多個時間點評估冷凝器中捕獲的大批物質(zhì)來實時檢 測混合醇的產(chǎn)生。
[0199] 2012年10月15日提交的美國臨時專利申請序列號61/714, 123的公開內(nèi)容以全 文并入本文中。
[0200] 上文所描述的各種實施方案可以組合以提供更多的實施方案。本說明書中所提及 的和/或申請資料表中所列出的所有美國專利、美國專利申請公布、美國專利申請、國外專 利、國外專利申請以及非專利公布以全文引用的方式并入本文中。必要時可以修改實施方 案的方面以采用各種專利、申請以及公布的概念來提供更多的實施方案。
[0201] 依據(jù)上文詳述的描述可以對實施方案作出這些和其它改變。一般來說，在以上權 利要求書中，所用的術語不應解釋為將權利要求書限于說明書和權利要求書中所公開的特 定實施方案，而應解釋為包括所有可能的實施方案以及所述權利要求書所賦予的等效物的 完整范圍。因此，權利要求書不受本公開所限制。
【主權項】
1. 一種非天然存在的微生物，其包含： 編碼具有甲烷單加氧酶活性的酶的外源核酸，所述酶在化學或環(huán)境應激存在下是穩(wěn)定 的； 其中至少一種醇脫氫酶在所述微生物中被滅活；并且 其中所述微生物能夠?qū)⒓淄檗D(zhuǎn)化成甲醇。
2. 如權利要求1所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物是甲烷營養(yǎng)菌。
3. 如權利要求1或2所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物能夠利用H2作為還 原劑用于將甲烷轉(zhuǎn)化成甲醇。
4. 如權利要求3所述的非天然存在的微生物，其中所述具有甲烷單加氧酶活性的酶能 夠直接利用4作為還原劑用于將甲烷轉(zhuǎn)化成甲醇。
5. 如權利要求3所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含編碼氫化酶的核 酸，所述氫化酶利用4作為還原劑用于將甲烷轉(zhuǎn)化成甲醇。
6. 如前述權利要求中任一項所述的非天然存在的甲烷營養(yǎng)菌，其中所述具有甲烷單加 氧酶活性的酶是pMMO、sMMO、AMO或P450。
7. 如權利要求6所述的非天然存在的甲烷營養(yǎng)菌，其中所述具有甲烷單加氧酶活性的 酶包含與SEQIDNO: 1-654中的任一者的氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列。
8. 如前述權利要求中任一項所述的非天然存在的微生物，其中所述化學或環(huán)境應激是 至少60°C的溫度、至少9的pH、或者5或低于5的pH。
9. 如前述權利要求中任一項所述的非天然存在的微生物，其中所述醇脫氫酶是通過所 述化學或環(huán)境應激被滅活。
10. 如權利要求9所述的非天然存在的微生物，其中所述化學或環(huán)境應激是>60°C的溫 度、>9的pH或〈5的pH。
11. 如權利要求1至8中任一項所述的非天然存在的微生物，其中所述醇脫氫酶是通過 遺傳修飾被滅活。
12. 如前述權利要求中任一項所述的非天然存在的微生物，其中所述至少一種醇脫氫 酶包括甲醇脫氫酶。
13. 如前述權利要求中任一項所述的非天然存在的微生物，其中所述至少一種醇脫氫 酶包含與SEQIDN0:655、656、657、658、659、660、661、662、663、664 以及 665 中的任一者具 有至少70 %同一性的氨基酸序列。
14. 如前述權利要求中任一項所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物能夠?qū)⒁?烷轉(zhuǎn)化成乙醇、丙烷轉(zhuǎn)化成丙醇或丁烷轉(zhuǎn)化成丁醇。
15. 如前述權利要求中任一項所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物能夠?qū)⒁?烯轉(zhuǎn)化成環(huán)氧乙烷、丙烯轉(zhuǎn)化成環(huán)氧丙烷或丁烯轉(zhuǎn)化成環(huán)氧丁烷。
16. 如前述權利要求中任一項所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物能夠?qū)⒒?合烯烴底物轉(zhuǎn)化成混合環(huán)氧化物產(chǎn)物。
17. 如權利要求1至14中任一項所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物能夠?qū)?混合烷烴氣體底物轉(zhuǎn)化成混合醇產(chǎn)物。
18. 如權利要求17所述的非天然存在的微生物，其中所述混合烷烴氣體底物是濕天然 氣或其部分分離的衍生物。
19. 一種將甲烷轉(zhuǎn)化成甲醇、乙烷轉(zhuǎn)化成乙醇、丙烷轉(zhuǎn)化成丙醇或丁烷轉(zhuǎn)化成丁醇的方 法，所述方法包括： 提供如權利要求1至18中任一項所述的非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部 分； 使所述非天然存在的微生物暴露于O2;分別包含甲烷、乙烷、丙烷或丁烷的氣體底物； 以及還原劑； 其中分別將所述甲烷氣體轉(zhuǎn)化成甲醇，將所述乙烷氣體轉(zhuǎn)化成乙醇，將所述丙烷氣體 轉(zhuǎn)化成丙醇，并且將所述丁烷氣體轉(zhuǎn)化成丁醇。
20. 如權利要求19所述的方法，其中將所述非天然存在的微生物或來源于其的無細胞 部分呈基本上無水狀態(tài)固定于固體基質(zhì)上。
21. 如權利要求19或20所述的方法，其中所述方法是在化學或環(huán)境應激下進行。
22. 如權利要求21所述的方法，其中所述化學或環(huán)境應激是至少60°C的溫度、至少9 的pH、或者5或低于5的pH。
23. 如權利要求19至22中任一項所述的方法，其中所述還原劑是H2氣。
24. 如權利要求23所述的方法，其中將H2氣與所述氣體底物混合。
25. 如權利要求23所述的方法，其中將所述H2氣在所述氣體底物之后提供給所述非天 然存在的生物體。
26. 如權利要求19至22中任一項所述的方法，其中所述還原劑是甲酸鹽。
27. 如權利要求19至26中任一項所述的方法，其中將02與所述氣體底物混合。
28. 如權利要求19至26中任一項所述的方法，其中將O2在所述氣體底物之前提供給 所述非天然存在的生物體。
29. 如權利要求19至28中任一項所述的方法，其中所述丙醇基本上包含正丙醇。
30. 如權利要求19至28中任一項所述的方法，其中所述丁醇基本上包含正丁醇。
31. 如權利要求19至30中任一項所述的方法，其中所述方法是在氣相生物反應器中進 行。
32. 如權利要求19至30中任一項所述的方法，其中所述方法是在流化床反應器中進 行。
33. -種將混合烷烴氣體底物轉(zhuǎn)化成混合醇產(chǎn)物的方法，所述方法包括： 提供如權利要求1至18中任一項所述的非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部 分； 使所述非天然存在的微生物暴露于包含以下的混合烷烴氣體底物：低碳烷烴；O2;以及 還原劑； 其中將所述混合烷烴氣體底物的所述低碳烷烴轉(zhuǎn)化成對應的醇。
34. 如權利要求33所述的方法，其中將所述非天然存在的微生物或來源于其的無細胞 部分固定于固體基質(zhì)上并且呈基本上無水狀態(tài)。
35. 如權利要求33或34所述的方法，其中所述方法是在化學或環(huán)境應激下進行。
36. 如權利要求35所述的方法，其中所述化學或環(huán)境應激是至少60°C的溫度、至少9 的pH、或者5或低于5的pH。
37. 如權利要求33至36中任一項所述的方法，其中所述還原劑是H2氣。
38. 如權利要求37所述的方法，其中將H2氣與所述氣體底物混合。
39. 如權利要求37所述的方法，其中將所述H2氣在所述包含低碳烷烴的混合烷烴氣體 底物之后提供給所述非天然存在的生物體。
40. 如權利要求33至36中任一項所述的方法，其中所述還原劑是甲酸鹽。
41. 如權利要求33至40中任一項所述的方法，其中將O2與所述混合烷烴氣體底物混 合。
42. 如權利要求33至40中任一項所述的方法，其中將O2在所述包含低碳烷烴的混合 烷烴氣體之前提供給所述非天然存在的生物體。
43. 如權利要求33至42中任一項所述的方法，其中所述方法是在氣相生物反應器中進 行。
44. 如權利要求33至42中任一項所述的方法，其中所述方法是在流化床反應器中進 行。
45. 如權利要求33至44中任一項所述的方法，其中所述包含低碳烷烴的混合烷烴氣體 底物包含至少兩種或更多種選自以下的烷烴：甲烷、乙烷、丙烷以及丁烷。
46. -種將乙烯轉(zhuǎn)化成環(huán)氧乙烷、丙烯轉(zhuǎn)化成環(huán)氧丙烷或丁烯轉(zhuǎn)化成環(huán)氧丁烷的方法， 所述方法包括： 提供如權利要求1至18中任一項所述的非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部 分； 使所述非天然存在的微生物暴露于O2;分別包含乙烯、丙烯或丁烯的氣體底物；以及還 原劑； 其中分別將所述乙烯氣體轉(zhuǎn)化成環(huán)氧乙烷，將所述丙烯氣體轉(zhuǎn)化成環(huán)氧丙烷，并且將 所述丁烯氣體轉(zhuǎn)化成環(huán)氧丁烷。
47. 如權利要求46所述的方法，其中將所述非天然存在的微生物或來源于其的無細胞 部分固定于固體基質(zhì)上并且呈基本上無水狀態(tài)。
48. 如權利要求46或47所述的方法，其中所述方法是在化學或環(huán)境應激下進行。
49. 如權利要求48所述的方法，其中所述化學或環(huán)境應激是至少60°C的溫度、至少9 的pH、或者5或低于5的pH。
50. 如權利要求46至49中任一項所述的方法，其中所述還原劑是H2氣。
51. 如權利要求50所述的方法，其中將H2氣與所述氣體底物混合。
52. 如權利要求50所述的方法，其中將所述H2氣在所述氣體底物之后提供給所述非天 然存在的微生物。
53. 如權利要求46至49中任一項所述的方法，其中所述還原劑是甲酸鹽。
54. 如權利要求46至53中任一項所述的方法，其中將0 2與所述氣體底物混合。
55. 如權利要求46至53中任一項所述的方法，其中將0 2在所述氣體底物之前提供給 所述非天然存在的微生物。
56. 如權利要求46至55中任一項所述的方法，其中所述丙烯基本上包含環(huán)氧正丙烷。
57. 如權利要求46至55中任一項所述的方法，其中所述丁烯基本上包含環(huán)氧正丁烷。
58. 如權利要求46至57中任一項所述的方法，其中所述方法是在氣相生物反應器中進 行。
59. 如權利要求46至57中任一項所述的方法，其中所述方法是在流化床反應器中進 行。
60. -種將混合烯烴氣體底物轉(zhuǎn)化成混合環(huán)氧化物產(chǎn)物的方法，所述方法包括： 提供如權利要求1至18中任一項所述的非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部 分； 使所述非天然存在的微生物暴露于包含以下的混合烯烴氣體底物：低碳烯烴；O2;以及 還原劑； 其中將所述混合烯烴氣體底物的所述低碳烯烴轉(zhuǎn)化成對應的環(huán)氧化物。
61. 如權利要求60所述的方法，其中將所述非天然存在的微生物或來源于其的無細胞 部分固定于固體基質(zhì)上并且呈基本上無水狀態(tài)。
62. 如權利要求60或61所述的方法，其中所述方法是在化學或環(huán)境應激下進行。
63. 如權利要求62所述的方法，其中所述化學或環(huán)境應激是至少60°C的溫度、至少9 的pH、或者5或低于5的pH。
64. 如權利要求60至63中任一項所述的方法，其中所述還原劑是H2氣。
65. 如權利要求64所述的方法，其中將H2氣與所述氣體底物混合。
66. 如權利要求64所述的方法，其中將所述H2氣在所述包含低碳烯烴的混合烯烴氣體 底物之后提供給所述非天然存在的微生物。
67. 如權利要求60至63中任一項所述的方法，其中所述還原劑是甲酸鹽。
68. 如權利要求60至67中任一項所述的方法，其中將0 2與所述混合烯烴氣體底物混 合。
69. 如權利要求60至67中任一項所述的方法，其中將0 2在所述包含低碳烯烴的混合 烯烴氣體之前提供給所述非天然存在的微生物。
70. 如權利要求60至69中任一項所述的方法，其中所述方法是在氣相生物反應器中進 行。
71. 如權利要求60至69中任一項所述的方法，其中所述方法是在流化床反應器中進 行。
72. 如權利要求60至71中任一項所述的方法，其中所述包含低碳烯烴的混合烯烴氣體 底物包含至少兩種或更多種選自由以下組成的群組的烯烴：乙烯、丙烯、丁烯以及丁二烯。
73. -種將烷烴轉(zhuǎn)化成醇的系統(tǒng)，其包括： 氣相生物反應器，所述氣相生物反應器包含固定于固體基質(zhì)上的如權利要求1至18中 任一項所述的非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部分； 連接器，所述連接器用于將包含至少一種低碳烷烴的氣態(tài)底物從氣源運送至所述生物 反應器中； 其中將所述氣態(tài)底物傳送至緊密靠近所述非天然微生物或來源于其的無細胞部分以 使得所述微生物或無細胞部分將所述低碳烷烴氧化成對應的醇產(chǎn)物。
74. 如權利要求73所述的系統(tǒng)，其進一步包括化學或環(huán)境控制單元，所述控制單元能 夠維持所述生物反應器中的化學或環(huán)境應激條件。
75. 如權利要求74所述的系統(tǒng)，其中所述環(huán)境控制單元包括溫度控制單元，所述溫度 控制單元能夠維持所述生物反應器中至少60°C的恒溫。
76. 如權利要求74所述的系統(tǒng)，其中所述化學控制單元包括pH控制單元，所述pH控制 單元能夠維持所述生物反應器中至少9的pH、或者5或低于5的pH。
77. 如權利要求73至76中任一項所述的系統(tǒng)，其進一步包括連接器，所述連接器用于 將4從H2氣源運送至所述生物反應器中。
78. 如權利要求73至77中任一項所述的系統(tǒng)，其進一步包括連接器，所述連接器用于 將空氣從空氣源運送至所述生物反應器中。
79. 如權利要求73至78中任一項所述的系統(tǒng)，其進一步包括連接器，所述連接器用于 將〇2從O2源運送至所述生物反應器中。
80. 如權利要求73至79中任一項所述的系統(tǒng)，其進一步包括收集單元，所述收集單元 用于收集所述醇產(chǎn)物。
81. 如權利要求80所述的系統(tǒng)，其中所述收集單元包括冷凝器。
82. 如權利要求80或81所述的系統(tǒng)，其進一步包括蒸餾單元，所述蒸餾單元用于分離 所述醇產(chǎn)物與水副產(chǎn)物。
83. 如權利要求73至82中任一項所述的系統(tǒng)，其進一步包括再循環(huán)單元，所述再循環(huán) 單元用于將未轉(zhuǎn)化的低碳烷烴再循環(huán)返回至所述生物反應器中。
84. 如權利要求73至83中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述氣態(tài)底物包含甲烷并且所述對 應的醇產(chǎn)物包含甲醇。
85. 如權利要求73至83中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述氣態(tài)底物包含乙烷并且所述對 應的醇產(chǎn)物包含乙醇。
86. 如權利要求73至83中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述氣態(tài)底物包含丙烷并且所述對 應的醇產(chǎn)物包含丙醇。
87. 如權利要求86所述的系統(tǒng)，其中丙醇基本上包含正丙醇。
88. 如權利要求73至83中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述氣態(tài)底物包含丁烷并且所述對 應的醇產(chǎn)物包含丁醇。
89. 如權利要求88所述的系統(tǒng)，其中丁醇基本上包含正丁醇。
90. 如權利要求73至89中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述氣相生物反應器是流化床反應 器。
91. 如權利要求73至90中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述固體基質(zhì)包含聚丙烯、陶瓷、玻 璃、木炭、砂、活性碳或硅藻土支撐體。
92. 如權利要求73至89和91中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述非天然存在的微生物或 來源于其的無細胞部分被固定于固體基質(zhì)上并且呈基本上無水狀態(tài)。
93. -種將烯烴轉(zhuǎn)化成環(huán)氧化物的系統(tǒng)，其包括： 氣相生物反應器，所述氣相生物反應器包含固定于固體基質(zhì)上的如權利要求1至18中 任一項所述的非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部分； 連接器，所述連接器用于將包含至少一種低碳烯烴的氣態(tài)底物從氣源運送至所述生物 反應器中； 其中將所述氣態(tài)底物傳送至緊密靠近所述非天然微生物或來源于其的無細胞部分以 使得所述微生物或無細胞部分將所述低碳烯烴氧化成對應的環(huán)氧化物產(chǎn)物。
94. 如權利要求93所述的系統(tǒng)，其進一步包括化學或環(huán)境控制單元，所述控制單元能 夠維持所述生物反應器中的化學或環(huán)境應激條件。
95. 如權利要求94所述的系統(tǒng)，其中所述環(huán)境控制單元包括溫度控制單元，所述溫度 控制單元能夠維持所述生物反應器中至少60°C的恒溫。
96. 如權利要求94所述的系統(tǒng)，其中所述化學控制單元包括pH控制單元，所述pH控制 單元能夠維持所述生物反應器中至少9的pH、或者5或低于5的pH。
97. 如權利要求93至96中任一項所述的系統(tǒng)，其進一步包括連接器，所述連接器用于 將4從H2氣源運送至所述生物反應器中。
98. 如權利要求93至96中任一項所述的系統(tǒng)，其進一步包括連接器，所述連接器用于 將空氣從空氣源運送至所述生物反應器中。
99. 如權利要求93至96中任一項所述的系統(tǒng)，其進一步包括連接器，所述連接器用于 將〇2從O2源運送至所述生物反應器中。
100. 如權利要求93至96中任一項所述的系統(tǒng)，其進一步包括收集單元，所述收集單元 用于收集所述環(huán)氧化物產(chǎn)物。
101. 如權利要求100所述的系統(tǒng)，其中所述收集單元包括冷凝器。
102. 如權利要求100或101所述的系統(tǒng)，其進一步包括蒸餾單元，所述蒸餾單元用于分 離所述環(huán)氧化物產(chǎn)物與水副產(chǎn)物。
103. 如權利要求93至102中任一項所述的系統(tǒng)，其進一步包括再循環(huán)單元，所述再循 環(huán)單元用于將未轉(zhuǎn)化的低碳烯烴再循環(huán)返回至所述生物反應器中。
104. 如權利要求93至103中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述氣態(tài)底物包含乙烯并且所述 對應的環(huán)氧化物產(chǎn)物包含環(huán)氧乙烷。
105. 如權利要求93至103中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述氣態(tài)底物包含丙烯并且所述 對應的環(huán)氧化物產(chǎn)物包含環(huán)氧丙烷。
106. 如權利要求93至103中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述氣態(tài)底物包含丁烯并且所述 對應的環(huán)氧化物產(chǎn)物包含環(huán)氧丁烷。
107. 如權利要求93至103中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述氣態(tài)底物包含丁二烯并且所 述對應的環(huán)氧化物產(chǎn)物包含丁二烯1，2氧化物。
108. 如權利要求93至107中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述氣相生物反應器是流化床反 應器。
109. 如權利要求93至108中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述固體基質(zhì)包含聚丙烯、陶瓷、 玻璃、木炭、砂、活性碳或娃藻土支撐體。
110. 如權利要求93至107和109中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述非天然存在的微生物 或來源于其的無細胞部分被固定于固體基質(zhì)上并且呈基本上無水狀態(tài)。
【專利摘要】本公開涉及用于烴的生物氧化，包括從烷烴產(chǎn)生醇或從烯烴產(chǎn)生環(huán)氧化物的遺傳工程改造的微生物，以及相關方法和系統(tǒng)。
【IPC分類】C12N1-21, C12N15-53, C12P7-04
【公開號】CN104822824
【申請?zhí)枴緾N201380053582
【發(fā)明人】J·西爾弗曼, D·雷吉斯凱
【申請人】凱利斯塔公司
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2013年10月15日
【公告號】US20150232888, WO2014062703A1