專利名稱：草坪草生物技術(shù)育種平臺的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及草坪草生物技術(shù)育種與常規(guī)育種手段相結(jié)合從而實現(xiàn)快速高效育種的一套技術(shù)平臺。
背景技術(shù)：
草產(chǎn)業(yè)在我國是“朝陽產(chǎn)業(yè)”，起步晚但是發(fā)展迅速；而草坪業(yè)的發(fā)展是草業(yè)的一個重要方面，在城市綠化、環(huán)境建設(shè)與運動場草坪建設(shè)中起著重要的作用。我國的草業(yè)育種工作遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于國外發(fā)達(dá)國家；草坪所需的草種基本上都是依賴于進(jìn)口，國家每年為此花費大量外匯。在國外，諸如美國、新西蘭、荷蘭等，將草坪業(yè)的發(fā)展與草坪草育種緊密地聯(lián)系起來，其育種手段以傳統(tǒng)育種為基礎(chǔ)，將新發(fā)展的生物技術(shù)應(yīng)用于其中，以求獲得期望的優(yōu)良草坪草單倍體植株和具有特定外源目的基因的栽培品系，因而每年都能為世界各地提供一批優(yōu)良的草坪草新品種或品系。
我國野生草坪草種質(zhì)資源豐富，草種的抗逆性、抗病力在我國的氣候條件下明顯優(yōu)于國外品種。在草坪草育種工作方面，我國的李俊龍等對多花黑麥草和葦狀羊茅進(jìn)行屬間雜交，獲得屬間雜種，并提出利用葦狀羊茅的抗熱性能改變多花黑麥草的抗旱、耐熱性能的可能性。張新全等進(jìn)行坪用黑麥草‘Derby’和高羊茅‘Houndog’的屬間雜交，未經(jīng)胚培養(yǎng)就獲得雜種，并從染色體配對表明，‘Derby’和‘Houndog’染色體間存在一定程度的親緣關(guān)系，這進(jìn)一步證明對高羊茅和黑麥草的屬間雜交改良是完全可行的。同時，新發(fā)展的組培技術(shù)和體細(xì)胞融合技術(shù)也為草坪草育種提供了另一可能成功的途徑。陳文品等將葦狀羊茅12日齡幼胚接種到MS+3mg/L 2，4-D培養(yǎng)基上，28d后形成愈傷組織，并在這些愈傷組織中成功地誘導(dǎo)出一塊能分化長成具幼葉和根毛的植株。支月娥等以高羊茅為對象研究其組織培養(yǎng)條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以MS附帶一定濃度的BA和2，4-D的培養(yǎng)基對高羊茅愈傷組織有很高的誘導(dǎo)率。朱根發(fā)等以草地早熟禾的幼穗和胚軸為外植體誘導(dǎo)和分化愈傷組織，發(fā)現(xiàn)用幼穗作外植體的適宜長度為0.5～1.0cm，適宜的2，4-D濃度為1mg/L以下；培養(yǎng)基中添加1.5mg/L生物素或?qū)H2PO4濃度提高到400mg/L，可能對草地早熟禾胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和篩選有一定作用。馬忠華等以早熟禾種子成熟胚為外植體，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和分化，發(fā)現(xiàn)3mg/L和0.1mg/L 2，4-D是早熟禾誘導(dǎo)愈傷組織和分化愈傷組織成苗的最佳濃度組合。Kuo等用含1～5mg/L 2，4-D MS基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)鈍葉草，用0.25mg/L 2，4-D+0.5mg/L KT的MS培養(yǎng)基分化鈍葉草，14h/10h的光周期，分化率為33％，最后在1/2MS無激素培養(yǎng)基中分化長根情況良好。Lee Hyoshin等利用鴨茅屬的雞腳草(Dactylis glomerata)的成熟胚誘導(dǎo)培養(yǎng)出愈傷組織并分化得到再生植株。Chaudhury等發(fā)現(xiàn)，用0.044mmol/L的6-BA對雜交狗牙根“Tifgreen”(Cynodon dactylon×Cynodon transvaalensis)和一個普通種狗牙根“Savannah”(Cynodon dactylon)的幼花序作外植體，誘導(dǎo)出致密、結(jié)節(jié)狀胚胎發(fā)生結(jié)構(gòu)，然后再分化效果甚佳。
以上這些實驗說明了草坪草愈傷組織可由種子、幼穗、幼花序等誘導(dǎo)產(chǎn)生，但是產(chǎn)生率很低。本發(fā)明正是針對生物技術(shù)育種中愈傷組織材料供應(yīng)的緊缺而提出的以懸浮細(xì)胞系與體細(xì)胞胚體系的建立來確保優(yōu)良愈傷細(xì)胞與愈傷組織的供應(yīng)。同時，應(yīng)用懸浮細(xì)胞系進(jìn)行育種與篩選，避免了在其他受體的誘導(dǎo)育種、輻射育種、基因工程育種中嵌合體的存在。

發(fā)明內(nèi)容
通過草坪草種子、幼穗、莖尖或根尖、幼花序誘導(dǎo)的愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)獲得草坪草懸浮細(xì)胞體系。在懸浮細(xì)胞體系的基礎(chǔ)上進(jìn)一步誘導(dǎo)培養(yǎng)草坪草體細(xì)胞胚，建立草坪草體細(xì)胞胚培養(yǎng)體系。本發(fā)明建立懸浮細(xì)胞系的目的是可以快速獲得來源于同一細(xì)胞的眾多克隆，為快速育種提供充足的遺傳背景一致的材料。所有育種操作方式即可以此懸浮細(xì)胞系或體細(xì)胞胚為受體材料。具體可用育種手段分別如下1.誘導(dǎo)育種利用懸浮細(xì)胞系和體細(xì)胞胚的高變異特性，通過對懸浮細(xì)胞系或體細(xì)胞胚施加相應(yīng)的誘導(dǎo)選擇壓，穩(wěn)定與我們育種目標(biāo)相一致的變異類型，并通過懸浮培養(yǎng)的高增殖速率達(dá)到擴(kuò)繁的目的。
2.輻射育種將懸浮細(xì)胞或體細(xì)胞胚直接采用一定頻率與強(qiáng)度的射線進(jìn)行照射，對照射后的細(xì)胞進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)。
3.倍性育種在懸浮細(xì)胞系中施加秋水仙素等抑制劑抑制細(xì)胞的分裂，將細(xì)胞停留在染色體加倍階段。從而獲得染色體倍性增加的細(xì)胞。
4.體細(xì)胞雜交通過纖維素酶、果膠酶等消化去除細(xì)胞壁，得到原生質(zhì)體，進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融合得到雜交細(xì)胞。再經(jīng)過細(xì)胞壁再生形成懸浮細(xì)胞系。
5.基因工程通過導(dǎo)入外源基因獲得遺傳性狀改良的新細(xì)胞系。
通過草坪草懸浮細(xì)胞系或體細(xì)胞胚體系的分化培養(yǎng)，獲得再生小植株或小胚芽，再進(jìn)一步固定培養(yǎng)，得到再生植株。
具體實施例方式
1.結(jié)縷草成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)及改造種子置于離心管中，加入1-2滴表面活性劑吐溫，然后加次氯酸鈉至離心管體積的四分之三左右，放置在90-1雙向磁力攪拌器上攪拌1小時，用無菌水沖洗3-5次，置于4℃冰箱中放置2-3天，每天及時更換無菌水。接種前再用次氯酸鈉消毒20分鐘，然后用無菌水沖洗3-5次，以備接種。
消毒處理過的種子接種在MS2培養(yǎng)基上，28℃黑暗培養(yǎng)，接種10天后進(jìn)行拔芽。接種4周后對誘導(dǎo)出的愈傷進(jìn)行繼代，此時愈傷多為水狀，不適合挑選。將其接種到篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)兩個月以后，愈傷生長狀態(tài)有所改善，但此時愈傷仍多為非胚性愈傷，對其進(jìn)行分塊，繼代。培養(yǎng)三個月，進(jìn)行愈傷挑選。此時的愈傷組織可分為三種I為質(zhì)地堅硬、塊狀、顏色鮮黃的胚性愈傷組織，即通常所說的胚性愈傷組織。II為質(zhì)地疏松、易分散、不分泌黏液的顆粒狀胚性愈傷組織。III為柔軟、水漬、形狀不規(guī)則、顏色淡白的非胚性愈傷組織。棄掉愈傷III，保留愈傷I和II繼續(xù)培養(yǎng)，II型愈傷為適合懸浮培養(yǎng)的愈傷。對I型愈傷繼續(xù)進(jìn)行改良，縮短繼代周期，每20天左右繼代一次，將其逐漸改良為II型愈傷。
將II型愈傷接種于MS2液體培養(yǎng)基中。置于轉(zhuǎn)速為90-110r/min的全溫震蕩培養(yǎng)箱(型號為HZQ-F)中，黑暗條件下振蕩培養(yǎng)，溫度控制在27℃左右。進(jìn)行懸浮培養(yǎng)每3-4天換一次培養(yǎng)液。每次繼代時條件培養(yǎng)基與新鮮培養(yǎng)基的比例為1∶2。待培養(yǎng)1月左右，每5-6天繼代一次，此時對條件培養(yǎng)基與新鮮培養(yǎng)基比例沒有特別要求。
2.體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)在懸浮體系建立的基礎(chǔ)上，在繼代過程中調(diào)整培養(yǎng)基配方，基本上用MS2液體培養(yǎng)基作為主導(dǎo)培養(yǎng)基，在其中每月用MS2+BA0.1進(jìn)行1-2次穿插培養(yǎng)，提高細(xì)胞分裂能力，保持其胚性。懸浮物顏色淡黃、培養(yǎng)液較澄清、愈傷為顆粒狀且大小均勻。采用固體預(yù)培養(yǎng)和直接再生分化的途徑來誘導(dǎo)愈傷分化。并調(diào)整瓊脂濃度、培養(yǎng)基中大量元素的含量、蔗糖的濃度等來改變滲透勢，讓其盡快適應(yīng)從液體到固體的環(huán)境轉(zhuǎn)變，提高再生頻率。同時在MS基本再生培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加不同的細(xì)胞分裂素來觀察其對再生的影響，在此基礎(chǔ)上確立最佳分化、再生培養(yǎng)基。
隨著懸浮繼代時間的延長，在繼代過程中用加細(xì)胞分裂素的液體培養(yǎng)基進(jìn)行繼代，如(MS2+BA0.1，MS2+KT0.2)調(diào)整培養(yǎng)體系的生長狀態(tài)，并在一定程度上加強(qiáng)了其細(xì)胞同步化，促進(jìn)了細(xì)胞再生。體系中的懸浮物逐漸由原來松散的大顆粒變成顆粒狀的小塊愈傷，大小均一，顏色淡黃，此時狀態(tài)為適合再生。此種狀態(tài)下的體細(xì)胞胚性較高。
權(quán)利要求
1.草坪草生物技術(shù)育種平臺，包括以下技術(shù)體系(1)愈傷組織的誘導(dǎo)；(2)懸浮細(xì)胞體系的建立；(3)體細(xì)胞胚體系的建立；(4)胚性細(xì)胞的芽再生誘導(dǎo)；(5)再生芽的生長與分化培養(yǎng)；(6)再生植株的生根培養(yǎng)；(7)植物輻射育種、誘導(dǎo)育種、倍性育種與基因工程育種。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于本育種平臺應(yīng)用于草坪草，草坪草是指能夠形成草皮或草坪的禾本科植物。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，愈傷組織的誘導(dǎo)由種子、幼穗、根尖或莖尖、幼葉經(jīng)脫分化誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，懸浮細(xì)胞體系由經(jīng)脫分化產(chǎn)生的愈傷組織經(jīng)過液體振蕩培養(yǎng)或過篩后振蕩培養(yǎng)產(chǎn)生。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，體細(xì)胞胚由懸浮細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生；
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，再生芽由體細(xì)胞胚經(jīng)過進(jìn)一步的分化產(chǎn)生；
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，再生芽的生長與分化是進(jìn)行快速繁殖與壯苗形成小植株的過程。。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，再生植株經(jīng)過誘導(dǎo)可以形成自己的根系。
9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，輻射育種、誘導(dǎo)育種、倍性育種與基因工程育種手段可以應(yīng)用于本平臺的懸浮細(xì)胞體系或體細(xì)胞胚體系，從而大大提高育種效率。
全文摘要
本發(fā)明涉及草坪草生物技術(shù)育種與常規(guī)育種手段相結(jié)合從而實現(xiàn)快速高效育種的一套技術(shù)平臺。本發(fā)明通過建立草坪草懸浮細(xì)胞體系來解決禾本科植物愈傷組織再生困難，生物技術(shù)育種中受體材料不足或受體遺傳背景不一致的問題。通過草坪草種子、幼穗、幼花序、幼根等誘導(dǎo)愈傷，獲得可懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞材料，并誘導(dǎo)形成體細(xì)胞胚及再生植株。通過懸浮培養(yǎng)的簡并操作獲得大量生物技術(shù)育種材料；結(jié)合誘導(dǎo)育種、輻射育種、倍性育種、細(xì)胞雜交、基因工程育種等手段，并利用其高變異性，大大加快育種速率。本平臺應(yīng)用于草坪草育種，可與常規(guī)育種手段以及現(xiàn)代生物技術(shù)育種手段相結(jié)合，推動草坪草育種進(jìn)度。
文檔編號A01G1/00GK1663347SQ20051006787
公開日2005年9月7日 申請日期2005年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月29日
發(fā)明者曾會明, 韓烈保, 方文娟 申請人:北京林業(yè)大學(xué), 韓烈保, 曾會明