一種微生物針式育種栽培一體化方法
【專利摘要】一種微生物針式育種栽培一體化方法的技術屬于微生物的人工培養(yǎng)【技術領域】，所要解決的技術問題是：微生物母種（如保藏母種、擴繁母種和生產母種）培養(yǎng)過程所必需的接種及殺菌消毒的一體化問題。其技術方案要點是：創(chuàng)造針孔攪拌器來實現(xiàn)操作環(huán)節(jié)的整合例如粉碎注射器內培養(yǎng)的固體母種，使注射器能直接抽取與注入；組織可控電熱器、柔性密封裝置等進行高溫變壓排氣消殺，并用環(huán)保物質如雙氧水、黃蠟保潔；建立Ｖ液排＝Ｖ氣排＝Ｖ氣回的母種包裝——注射器——目標包裝——通氣導管——母種包裝的內部循環(huán)，降低母種與外部微生物發(fā)生接觸的可能性。其主要用途是：用于一個人單獨完成的操作過程，使微生物能夠在與外部空氣中微生物無接觸的可控條件下，進行高效育種、接種和培養(yǎng)。
【專利說明】一種微生物針式育種栽培一體化方法
【技術領域】
[0001]微生物的人工培養(yǎng)方法。整合微生物培養(yǎng)的育種、栽培及其接種環(huán)節(jié)。
【背景技術】
[0002]液體微生物母種一般比固體微生物母種容易接種，在分散均勻和生長速度等方面有優(yōu)勢，液體微生物母種的栽培技術更受歡迎，但固體母種和液體母種都需要攪拌以及轉移。同時當前常用的液體微生物母種育種技術存在問題，例如搖床制種所需時間長、容易造成菌齡不同而降低品質；發(fā)酵罐制種容易造成制種過程中微生物母種的嚴重退化；吹氧制種細節(jié)較多存在安全隱患等。更重要的是，由于液體微生物母種的育種和接種栽培之間存在其他環(huán)節(jié)，這些環(huán)節(jié)需要更多投資(例如酒精、無菌工作臺），而且容易被雜菌感染(例如接種勺、移液器等消毒不徹底)。因為育種和接種栽培之間的環(huán)節(jié)沒有充分整合，使得微生物母種與不可控物質(如雜菌）接觸的機會較多，從而造成液體微生物母種的稀釋以及消毒操作等的不易控制，在非實驗室特別是農村環(huán)境中不易確保微生物培養(yǎng)所必需的衛(wèi)生條件。上述情況還造成微生物人工培養(yǎng)至少要兩人配合才能順利進行等問題。但是這些問題可以通過育種和栽培的一體化得到解決，只要整合繁瑣環(huán)節(jié)，相應地由這些環(huán)節(jié)產生的問題也就能得到解決。通過應用微生物針式育種和栽培一體化方法的針孔攪拌器和內循環(huán)裝置等，能夠優(yōu)化操作、減少投資和節(jié)約時間。從而實現(xiàn)以較低成本的一體化方法及裝置頂替當前相對復雜的方法及其硬件，例如省去當前液體微生物母種育種的高壓滅菌設備、接種箱、接種勺或移液器等。可見現(xiàn)有技術存在育種與栽培環(huán)節(jié)缺少整合、不易為非專業(yè)人員所掌握等問題，對所需規(guī)模不大的微生物實驗及食用菌生產等造成技術障礙。總之，現(xiàn)有的微生物人工培養(yǎng)技術在育種和栽培方面存在可以整合的環(huán)節(jié)，而正是這些環(huán)節(jié)不易操作，增加污染和成本，不利于提高人工培養(yǎng)效率，不利于增加經濟效益。

【發(fā)明內容】

[0003]解決的技術問題是應用針孔攪拌器實現(xiàn)微生物育種和栽培的一體化，包括三個主要部分：一是準備針孔攪拌器；二是應用注射器或連續(xù)注射器優(yōu)化微生物母種(如保藏母種、擴繁母種和生產母種）的制備或接種；三是建立密閉內循環(huán)完成一體化操作。為改進微生物的人工培養(yǎng)，使其更容易操作和掌握，本發(fā)明的關鍵是解決由微生物育種或栽培過程所必需的接種及其保潔問題。
[0004]本發(fā)明采用如下技術方案：準備針孔攪拌器如圖I所示①電鉆是根據(jù)攪拌對象所需選用的，必須自帶固定裝置如螺套及周邊裝置；②鉆尾螺套是指電鉆用來安裝鉆頭的尾部及螺套，但不用鉆頭而用曲鋼針工作；③曲鋼針是指為達到攪拌要求而彎曲成一定弧度和一定長度的低碳鋼針，弧度在90 - 180度之間能夠通過針尖插入進行攪拌；④針尾是曲鋼針的變形后的尾部，形變必須保證通過螺套固定到電鉆在攪拌時曲鋼針不松動，成多邊形或圓弧形。準備針孔攪拌器必須按攪拌要求選擇相應硬度、弧度和長度的曲鋼針，必須把曲鋼針固定在電鉆上之后再進行消殺以達到衛(wèi)生要求。[0005]應用注射器優(yōu)化微生物母種的制備：把無菌注射器應用到培育微生物母種，進行微生物母種的注射器培養(yǎng)，配之以粗針、針孔攪拌器，使母種能直接注入到液體微生物母種培養(yǎng)器皿。①根據(jù)微生物母種的不同配置相應的培養(yǎng)基和條件，把注射器內母種和培養(yǎng)基的總體積控制在注射器容積的5% - 50%之間放平注射器，調節(jié)其推進器，使液面低于針管出口，保潔密封后連同注射器在所需溫度、光照和磁場等條件下培養(yǎng)固體母種注射器內培育的母種成熟后，用針孔攪拌器攪拌注射器內母種直接通過無菌粗針針頭注入到微生物母種培養(yǎng)器皿。如果注射器內培養(yǎng)的是液體微生物母種，那么直接用注射器注入到培養(yǎng)器皿。如果是試管或其他器皿培育的固體母種，那么也用針孔攪拌器攪拌粉碎以達到通過粗針針頭由注射器無菌抽出培育或轉移。與此同時，準備液體微生物母種培養(yǎng)器皿及其柔性密封裝置，確保在外形、酸堿度、溫度和壓力等方面達到操作要求，并根據(jù)微生物母種的不同需要配置相應的培養(yǎng)基、環(huán)境條件、針頭和導管等。①按照液體微生物母種培養(yǎng)器皿的開口大小以及液體微生物母種培養(yǎng)對溫度、酸堿度等的要求，配好相應的柔性密封裝置，確保在與培養(yǎng)基一起高溫消毒時不產生其他物質危害液體微生物母種，并且塞緊培養(yǎng)器皿配合可控電熱器進行高溫變壓排氣消殺；②使用相應的導管把內徑夠大的粗針針頭連接到連續(xù)注射器，保證液體微生物母種培養(yǎng)器皿內的成熟液體生產母種能夠通過連續(xù)注射器直接輸出；③從柔性密封裝置上插入連續(xù)注射器的粗針針頭，保證通過針頭能夠隨時輸出培養(yǎng)器皿內液體微生物母種，從而能確保做到不接觸外部空氣而直接取樣或接種等。在抽取母種時，調節(jié)好注射器或連續(xù)注射器輸入端的粗針針頭，使液體微生物母種能夠盡量全部輸出。
[0006]建立密閉內循環(huán)進行一體化消殺及接種：在用無菌導管接好連續(xù)注射器和液體微生物母種培養(yǎng)器皿后，直接通過連續(xù)注射器輸出端針頭插穿微生物栽培包裝接種。①在上述微生物母種培養(yǎng)器皿加入所需培養(yǎng)基等作高溫變壓排氣滅菌時，使高溫蒸汽通過導管從連續(xù)注射器及其針頭排出，一起達到高溫滅菌消毒目標，確保液體微生物母種從培養(yǎng)器皿到由針頭插穿栽培包裝而注入到培養(yǎng)基的通道暢通，不受雜菌污染。②在通過用連續(xù)注射器把液體微生物母種接種到培養(yǎng)基時，對針頭和預插入處進行徹底消殺。同時用另一根通氣導管兩端配上針頭連接好液體微生物母種培養(yǎng)器皿，使其另一端通過針頭插穿微生物培養(yǎng)基的栽培包裝進行通氣，保證回流氣體無污染。①在上述加入相應所需物質使用無明火方便控溫的可控電熱器進行高溫變壓排氣滅菌時，調節(jié)好針頭、導管和微生物母種培養(yǎng)器皿保證使部分高溫蒸汽通過這根導管從針頭排出，調節(jié)氣通量一起做排氣消毒，確保液體微生物母種注入到培養(yǎng)基包裝所擠出氣體的回流通道暢通，不受雜菌污染。②在用連續(xù)注射器把液體微生物母種接種到培養(yǎng)基時，對這根導管的針頭和預插入處進行徹底消毒殺菌。最后注意按照不同微生物栽培所需要的最佳液體微生物母種或培養(yǎng)基的比例，調好連續(xù)注射器的每次注射量，形成內部循環(huán)：微生物母種培養(yǎng)器皿——連續(xù)注射器——栽培包裝——通氣導管——微生物母種培養(yǎng)器皿。此時，V液排=V氣排=V氣回，沒有與外部空氣產生交換，從而實現(xiàn)最大限度保證微生物母種不受空氣中的雜菌污染。接種好一次后，要先拔出栽培包裝上的連續(xù)注射器針頭，頭朝上放好，然后再拔出通氣導管針頭，準備下一次接種，要先插入通氣導管針頭到培養(yǎng)基包裝，再插入連續(xù)注射器針頭到培養(yǎng)基包裝接種。如果接下來一段時間不用，必須依次清潔，連同導管保潔后放好冷藏以備下次使用。
[0007]這種微生物針式育種栽培一體化方法具備如下優(yōu)點：所需器材僅需注射器、微生物母種培養(yǎng)器皿和相應的柔性密封裝置、導管、針頭以及連續(xù)注射器、可控電熱器等簡易、實惠儀器。本發(fā)明的有益效果與現(xiàn)有技術比較主要包括：使微生物母種從育種到栽培過程中與外部空氣的直接接觸次數(shù)減少到O次，并且使每次接種簡化到僅需要2次插拔針頭。同時，通過整合工藝而節(jié)約了相關環(huán)節(jié)上的輔料例如酒精和消殺熏劑等，減少了操作難度、時間和人力物力。正確使用本方法，整個微生物人工培養(yǎng)過程可以由一個人單獨完成。普通食用菌專業(yè)戶只要買到培育好的母種，就能在與外部空氣中雜菌無接觸的條件下高效育種、接種和培養(yǎng)。上述發(fā)明能優(yōu)化微生物的人工培養(yǎng)特別是食用菌如冬蟲夏草真菌的培養(yǎng)，只要微生物育種無污染，就能夠保證擴繁和接種等無污染，有利于避免后續(xù)環(huán)節(jié)的問題特別是因為接種感染雜菌而浪費?？傊?，這種微生物育種栽培一體化方法能夠提高微生物培養(yǎng)效率和質量，更好地降本增效。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]【專利附圖】

【附圖說明】如下：圖I.針孔攪拌器①電鉆是帶固定裝置如螺套及周邊裝置的手持式電鉆；②鉆尾螺套是指電鉆用來安裝鉆頭的尾部及螺套曲鋼針是弧度、長度和粗細不等的一套低碳鋼針；④針尾是曲鋼針的變形后的尾部，通過螺套固定到電鉆。圖2.攪拌示意圖①攪拌注射器是針孔攪拌器從注射器出口插入曲鋼針，通過攪拌粉碎母種以便從粗針針頭輸出；②攪拌培養(yǎng)基是針孔攪拌器插入較長的曲鋼針到培養(yǎng)器皿，通過攪拌培養(yǎng)基等以達到溶解度、均勻度或顆粒度等要求；③攪拌母種是針孔攪拌器插入母種密封包裝如試管，通過攪拌運動使固體母種或液態(tài)母種達到粉碎、接種等要求。這些攪拌運動可以通過控制曲鋼針例如插入的長度、方向等，達到調節(jié)圓弧形旋轉的大小或位置等目的。圖3. —體化裝置圖①針孔攪拌器如圖I.所示，解決一體化所需的攪拌或粉碎等問題；②注射器是一般醫(yī)用級注射器，解決一體化所需的育種、注入或抽出等問題；③柔性密封是柔軟的氣密性封蓋，方便針頭鉆孔、插入、抽出或旋轉而不透氣培養(yǎng)基器皿是耐高溫高壓的寬底容器，耐熱急變直接接觸電熱器提供變壓蒸汽；⑤可控電熱器是有開關使用電能調溫的發(fā)熱儀器，功率大小與培養(yǎng)基器皿等相適應一般不少于200瓦；?連續(xù)注射器是連續(xù)進行抽出或注入的耐高溫高壓的注射器，通過手動、電動或氣動完成工作；⑦通氣導管是兩端接有空心針頭的耐高溫高壓的柔性管，長度、內徑或位置等與氣體回流相適應；⑧目標密封包裝是接種或注入的目標包裝 ，材質、氣密性與插入針頭相適應。
【具體實施方式】
[0009]【具體實施方式】以冬蟲夏草真菌的培養(yǎng)為例說明，使用12V手持式電鉆、玻璃注射器、耐高溫玻璃抽濾瓶(具上嘴)、高彈性耐高溫的強密封硅膠塞（即柔性密封裝置)、耐氧化抑菌膠管、手動連續(xù)注射器、家用6升除鍋蓋電飯煲(即可控電熱器)及相應的針頭、培養(yǎng)基、無菌水和PP料培養(yǎng)盒等。本例需要準備長度15CM直徑0. 1麗尾部卷成圓形的不銹鋼曲鋼針，加工磨尖并從近尖端三分之二處開使弧度逐漸彎曲成120度，需要培養(yǎng)冬蟲夏草真菌固體母種、再擴繁成液體生產母種，接種到栽培包裝。首先，培養(yǎng)冬蟲夏草真菌固體母種，按照相應的育種條件使用無菌透明玻璃注射器通過粗針針頭抽入母種及其培養(yǎng)基，進行育種。同時使用電飯煲頂替有明火的酒精燈進行快速高溫變壓消殺，電飯煲發(fā)熱器起石棉網(wǎng)的作用，使玻璃注射器、耐高溫玻璃抽濾瓶均勻受熱。耐高溫玻璃抽濾瓶經高溫變壓排氣完成消殺后，依次封閉各條導管頂端，防止倒吸外部空氣。培養(yǎng)基連續(xù)高溫沸騰5分鐘后，開始高溫變壓排氣消殺，通過開關電飯煲電源完成加熱一一高溫高壓——自動沖開膠管頂端排氣——降溫降壓——封閉導管頂端——加熱周期7次，每次3分鐘，總時間約30分鐘。當導管氣通量接近于0時，才停止加熱以防止倒吸外部空氣，也防止內部氣壓過大而炸開柔性密封裝置等。其次，擴繁成液體生產母種，需要12V手持式電鉆接好上述曲鋼針，從注射器出口插入攪拌粉碎固體母種，同時使培養(yǎng)基溫度降到22攝氏度左右再培養(yǎng)冬蟲夏草真菌液體生產母種。玻璃注射器育種的冬蟲夏草真菌母種經粉碎后有推進器擠壓，能從空心針頭直接注入到玻璃抽濾瓶(即培養(yǎng)基器皿)培養(yǎng)液體生產母種。注意把上述培養(yǎng)基玻璃抽濾瓶正立，才能使用上述注射器直接插穿密封硅膠塞注入母種進行擴繁。要用同一個注射器吸入無菌水從第一次插入的通道注入，以充分排出注射器內的母種并調節(jié)培養(yǎng)基達到相應的要求，確?？傮w積小于培養(yǎng)器皿有效容積的50%。注意成熟液體生產母種的稀釋，也需要使用上述玻璃注射器插穿密封硅膠塞注入無菌水或無菌營養(yǎng)液。最后，接種到栽培包裝也需要使用上述針孔攪拌器、注射器處理生產母種或培養(yǎng)基，然后把玻璃抽濾瓶放倒橫臥，從上支管連接連續(xù)注射器輸出液體生產母種；也可以保持正立而從硅膠塞插入粗針針頭再通過連續(xù)注射器輸出。本例使用雙氧水對針頭和預插入處進行徹底消毒殺菌，所有保潔用黃蠟（醫(yī)用蜂蠟）封口，針頭要戴好針套，在使用時加熱黃蠟使熔化擠出。在每次使用針頭時都要使針尖朝上，先擠出少許液體以沖去針尖上可能附著的雜菌，再迅速插入完成育種栽培一體化操作。本例實踐操作中是把通氣導管與連續(xù)注射器固定在一起的，接種時不需要單獨插入或抽出通氣導管針頭從而只要一次插拔就能完成一次接種。[0010]這種微生物針式育種栽培一體化方法不受上述實施說明的限制，其他任何未背離本發(fā)明精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種微生物針式育種栽培一體化方法，在微生物培養(yǎng)過程中，使用注射器、培養(yǎng)器皿和相應的柔性密封裝置、導管、針頭以及針孔攪拌器整合操作，其特征是：直接用消毒針頭插穿柔性密封裝置，形成內部循環(huán)，使微生物母種或培養(yǎng)基等不與外部微生物發(fā)生接觸，實現(xiàn)一體化的殺菌消毒、輸入或輸出操作。
2.根據(jù)權利要求1所述微生物針式育種栽培一體化方法，其特征是：以針頭直接注入或抽出為目的，因此使用注射器培育微生物母種例如固體母種，并配之以大內徑粗針針頭及針孔攪拌器來處理。
3.根據(jù)權利要求1所述微生物針式育種栽培一體化方法，其特征是根據(jù)V液排=V氣排=V氣回，使用不少于I根的通氣導管通過針頭連通母種培養(yǎng)器皿和目標包裝的內部氣體，形成內部循環(huán)，同時把通氣 導管針頭與連續(xù)注射器針頭固定在一起方便操作。
4.根據(jù)權利要求1所述微生物針式育種栽培一體化方法，其特征是按一體化殺菌消毒要求，使用通氣導管連接培養(yǎng)器皿，在與培養(yǎng)器皿和相應的柔性密封裝置、導管、針頭以及連續(xù)注射器一起高溫消毒時，調節(jié)各條導管的氣通量進行高溫變壓排氣消殺。
5.所謂氣通量定義為在一個標準大氣壓下測得的單位時間通過截面的氣體總量。
6.根據(jù)權利要求1所述微生物針式育種栽培一體化方法，其特征是按一體化殺菌消毒要求，使用可控電熱器進行高溫變壓排氣滅菌，方法是調節(jié)可控電熱器的溫度使沸騰所產生的氣壓急劇變化一段時間，高低壓交替周期不少于2個以達到內部循環(huán)的消殺目標。
7.根據(jù)權利要求1所述微生物針式育種栽培一體化方法，其特征是按一體化殺菌消毒要求，同時調節(jié)可控電熱器的溫度和各條導管的氣通量，進行高溫變壓排氣滅菌，然后停止加熱，在各導管氣通量接近于O前封閉頂端，氣通量小于3ml/s。
8.根據(jù)權利要求1所述微生物針式育種栽培一體化方法，其特征是通過針孔攪拌器來整合操作達到均勻度、顆粒度等要求，針孔攪拌器由電鉆提供動力，通過鉆尾螺套固定變形的曲鋼針針尾傳遞動力使曲鋼針做圓弧形運動。
9.根據(jù)權利要求1所述微生物針式育種栽培一體化方法，其特征是通過針孔攪拌器來整合操作達到技術要求，針孔攪拌器所用曲鋼針是與要求相適應的一套直徑、弧度、長度和硬度有別的低碳鋼針，通過針尖插入目標并且調節(jié)攪拌效果，直徑在0. 01毫米到3毫米之間，弧度在90度到180度之間，長度在I厘米到100厘米之間，硬度由含碳率表示在0. 0218%到0. 25%之間。
【文檔編號】A01G1/04GK103688743SQ201310186723
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年5月18日 優(yōu)先權日:2013年5月18日
【發(fā)明者】羅青 申請人:羅青