Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD) 〇
[0095] 用于確定多肽變體是否折疊成與非變體多肽或片段可比的構象的試驗包括例如 蛋白質與對原生或未折疊的表位具有特異性的單克隆或多克隆抗體反應的能力、配體結合 功能的保留、酶活性的保留（如適用）以及突變型蛋白質對于用蛋白酶消化的敏感性或抗 性（參看Sambrook等，同上）。多肽、變體以及其片段可以在不改變所得蛋白質分子的生 物活性的情況下（即，在不以統(tǒng)計上顯著或生物學上顯著的方式改變一種或多種功能活性 的情況下）制備。舉例來說，所述取代一般通過將一個氨基酸與包括在同一組內的另一個 氨基酸互換來進行，所述組諸如極性殘基、帶電殘基、疏水殘基和/或小殘基等的組。任何 氨基酸取代的影響可以僅僅通過針對在生物試驗中發(fā)揮功能的能力或結合至同源配體或 靶分子的能力來測試所得經過修飾的蛋白質以經驗方式確定。
[0096] 密碼子優(yōu)化
[0097] 重組蛋白質的表達在其原始宿主外往往很困難。舉例來說，密碼子使用偏性的變 化已經在細菌的不同物種間觀測到（Sharp等，2005, Nucl. Acids. Res. 33:1141-1153)。重 組蛋白質甚至在其原生宿主內的過度表達也可能很困難。在本發(fā)明的某些實施方案中，有 待引入根據本文所公開的實施方案中的任一者的微生物中的核酸（例如，編碼在化學或 環(huán)境應激存在下穩(wěn)定的具有甲烷單加氧酶活性的酶的核酸）可以經歷密碼子優(yōu)化以增強 蛋白質表達。密碼子優(yōu)化指的是改變用于生物體轉型的核酸的基因或編碼區(qū)中的密碼子 以反映宿主生物體的典型密碼子使用而不改變DNA編碼的多肽。用于異源生物體中的最 佳基因表達的密碼子優(yōu)化方法在本領域中是已知的并且先前已有描述（參看例如Welch 等，2009，PL〇S One 4:e7002;Gustafsson 等，2004，Trends Biotechnol. 22:346-353 ;Wu 等，2007, Nucl. Acids Res. 35:D76_79;Villalobos 等，2006, BMC Bioinformatics 7:285; 美國專利公布2011/0111413 ;以及美國專利公布2008/0292918)。
[0098] 伸用非天然存在的微牛物伸烴氣化的方法
[0099] 在某些實施方案中，提供了將甲烷轉化成甲醇的方法，這種方法包括：提供根據本 文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部分；使非 天然存在的微生物暴露于〇 2;包含甲烷的氣體底物；以及還原劑；其中將甲烷氣體轉化成 甲醇。根據本文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物可以作為活的全細 胞（例如，在培養(yǎng)物中、在生物膜上或作為濕細胞漿）、非活的全細胞（例如，凍干的全細 胞制劑、凍干細胞的復原的全細胞制劑），或來源于其的無細胞部分（例如，膜部分）而提 供。甲烷單加氧酶活性可以通過與特定細胞器締合而從全細胞中分離，從而允許使用差速 離心所得到的無細胞部分（參看例如Nguyen等，1994, J. Biol. Chem. 269:14995-15005 ; Scott和Higgins, 1981，Microbiol. 125:63-72)。無細胞部分可以包括離心的無細胞 提取物的細胞裂解物和可溶部分或膜部分。無細胞部分還可以包括含有具有MMO活性 的酶的蛋白質提取物，諸如洗滌劑溶解的部分（參看例如Smith和Dalton, 1989, Eur. J. Biochem. 182:667-671)或純化的酶（參看例如 Lieberman 等，2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3820-3825)。全細胞和無細胞部分可以呈基本上無水狀態(tài)（例如，凍干的） 而提供。具有MMO活性的酶（例如，PMM0)的凍干制劑已經顯示保留催化活性（參看例如 美國專利公布 2002/0168733 ;Nguyen 等，1994, J. Biol. Chem. 269:14995-15005)。
[0100] 在某些實施方案中，非天然存在的微生物是甲烷營養(yǎng)菌。在某些實施方案中，具有 甲烷單加氧酶活性的酶是pMM〇、sMMO、氨單加氧酶或P450。在其它實施方案中，pMMO酶包 含如由SEQ ID NO:644-648提供的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1-643提供的氨基酸序列的 遺傳工程改造的穩(wěn)定變體。在其它實施方案中，AMO酶包含選自SEQ ID N0:652-654的氨基 酸序列或包含SEQ ID N0:649-651中的任一者的氨基酸序列的遺傳工程改造的穩(wěn)定變體。
[0101] 在某些實施方案中，使用根據本文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的 微生物或來源于其的無細胞部分將甲烷轉化成甲醇的方法在化學或環(huán)境應激下進行。在其 它實施方案中，化學或環(huán)境應激是至少60°c的溫度、至少9的pH、或者5或低于5的pH?；?學或環(huán)境應激可以是至少40°C、至少45°C、至少50°C、至少55°C、至少60°C、至少65°C、至 少70 °C、至少75 °C、至少80 °C、至少85 °C、至少90 °C或至少95 °C的溫度。在另一個實例中， 化學應激可以是至少8、至少8. 5、至少9、至少9. 2、至少9. 4、至少9. 6、至少9. 8、至少10的 pH或至多6、至多5. 5、至多5、至多4. 8、至多4. 6、至多4. 4、至多4. 2、至多4的pH。
[0102] 在某些實施方案中，醇脫氫酶通過化學或環(huán)境應激被滅活。在一些實施方案中，醇 脫氫酶通過化學或環(huán)境應激被滅活，這種化學或環(huán)境應激是>60°C的溫度、>9的pH或〈5的 pH?；蛘?，醇脫氫酶可以通過遺傳修飾被滅活。至少一種在非天然存在的微生物中被滅活 的醇脫氫酶可以包括甲醇脫氫酶。在甲烷營養(yǎng)菌中可以被滅活的醇脫氫酶的示例性氨基酸 序列由 SEQ ID NO:655-665 提供。
[0103] 使根據本文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物或來源于其的 無細胞部分暴露于包含甲烷的氣體底物，其提供了用于轉化成甲醇的甲烷底物。包含甲烷 的氣體底物可以是基本上純化的形式，諸如管道質量天然氣。在某些實施方案中，包含甲烷 的氣體底物是氣體的混合物，諸如濕天然氣。氣體混合物可以包含低碳烷烴（例如，選自由 甲烷、乙烷、丙烷以及丁烷組成的群組的兩種或更多種烷烴的任何組合）。
[0104] 二氧（O2)作為氧化劑提供，其中一個氧原子被還原以形成H2O,而另一個并入至甲 烷中以形成甲醇。O 2的來源可以是空氣、純O2或包含O2的合成氣體混合物（例如，〇2與N 2 的混合物）。在某些實施方案中，O2與包含甲烷的氣體底物混合。氣態(tài)〇2可以在注入容納 非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部分的生物反應器中之前與氣體底物混合，或氣 體可以同時但獨立地注入生物反應器中，其中混合在通過生物反應器期間發(fā)生?；蛘?，將O 2 在包含甲烷的氣體底物之前提供給非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部分。在〇2在 包含甲烷的氣體底物之前提供的某些實施方案中，〇 2向生物反應器中的進料可以在將氣體 底物引入生物反應器中之后繼續(xù)進行，或可以在添加之后或添加氣體底物之前停止。在O 2 在包含甲烷的氣體底物之前提供的某些實施方案中，使非天然存在的微生物或來源于其的 無細胞部分暴露于O2-段足夠的時間以使得很大一部分具有MMO活性的酶已經使二氧活 化。
[0105] 提供還原劑用于推動甲烷氧化并且再生具有甲烷單加氧酶活性的酶，并且可以是 能夠驅動甲烷單加氧酶活性的任何還原劑，包括例如H 2、甲酸鹽以及氫醌。在某些實施方案 中，利用H2氣作為還原劑。在其它實施方案中，將!1 2氣與包含甲烷的氣體底物混合提供給 非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部分。氣態(tài)H2可以在注入容納非天然存在的微生 物或來源于其的無細胞部分的生物反應器中之前與氣體底物混合，或氣體可以同時但獨立 地注入生物反應器中，其中混合在通過生物反應器期間發(fā)生?；蛘?，將％氣在包含甲烷的 氣體底物之后依序提供給非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部分。在4在包含甲 烷的氣體底物之后提供的某些實施方案中，氣體底物向生物反應器中的進料可以在將4引 入生物反應器中之后繼續(xù)進行，或可以在添加之后或添加4之前停止。在H 2在包含甲烷的 氣體底物之后提供的某些實施方案中，使非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部分暴 露于包含甲烷的氣體底物一段足夠的時間以使得很大一部分具有MMO活性的酶已經使甲 烷氧化并且被鎖定于氧結合的狀態(tài)。包含甲烷的氣體底物和H 2氣的依序添加可以將甲烷 氧化反應分成兩個催化步驟（見圖1)，從而允許對生物反應器進行更好的熱控制。
[0106] 在某些實施方案中，還原劑是甲酸鹽。
[0107] 在某些實施方案中，本文所描述的方法使用固定于固體基質上、固體基質內或固 體基質背面的根據本文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物或來源于其 的無細胞部分。在其它實施方案中，非天然存在的微生物或來源于其的無細胞提取物呈基 本上無水狀態(tài)（例如，凍干的）。非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部分暫時或永久 地附著于生物反應器內的固體基質上、固體基質內或固體基質背面。將養(yǎng)分、底物以及其它 所需因子供給固體基質以使得細胞可以催化所需反應。非天然存在的微生物可以在固體基 質的表面（例如，呈生物膜形式）上生長。非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部分 可以附著于固體基質的表面上或固體基質內，而沒有細胞生長或呈非活的狀態(tài)。微生物的 示例性固體基質支撐體包括聚丙烯環(huán)、陶瓷生物環(huán)、陶瓷鞍、纖維支撐體（例如，膜）、多孔 玻璃珠、聚合物珠、木炭、活性碳、干燥硅膠、顆粒氧化錯、渥太華砂（Ottawa sand)、粘土、聚 氨酯細胞支撐片以及流化床粒子載體（例如，砂、粒狀活性碳、硅藻土、海藻酸鈣凝膠珠）。
[0108] 非天然存在的甲烷營養(yǎng)菌可以使用本領域中已知的多種方法來培養(yǎng)。在某些實施 方案中，使培養(yǎng)物在控制培養(yǎng)單元中生長，諸如發(fā)酵罐、生物反應器、中空纖維膜生物反應 器、填充床生物反應器，等等。經典的分批培養(yǎng)方法是封閉系統(tǒng)，其中在培養(yǎng)開始時設定培 養(yǎng)基的組成，并且在培養(yǎng)過程中不會經受外部改變。因此，在培養(yǎng)過程開始時，用所需生物 體或生物體接種培養(yǎng)基，并且在不向系統(tǒng)中添加任何物質的情況下允許生長或代謝活性發(fā) 生。通常，然而，"分批"培養(yǎng)是關于添加碳源的批次，并且常常在諸如PH和氧濃度的控制因 素下進行嘗試。在分批系統(tǒng)中，系統(tǒng)的代謝物和生物質組成不斷地變化直至終止培養(yǎng)的時 間。在分批培養(yǎng)物內，細胞緩和通過靜態(tài)停滯期至高度生長對數期并且最終到達靜止期，在 靜止期中生長速率減小或停止。如果未加處理，那么在靜止期中的細胞將最終死亡。在對 數期中的細胞常常負責一些系統(tǒng)中的最終產物或中間物的大量生產。靜止期或后指數期生 產可以在其它系統(tǒng)中獲得。
[0109] 補料分批系統(tǒng)是標準分批系統(tǒng)的變化。補料分批培養(yǎng)過程包含具有以下修改 的典型分批系統(tǒng)：隨著培養(yǎng)進行以增量方式添加底物。當降解物阻遏傾向于抑制細胞 代謝時并且在需要培養(yǎng)基中具有有限量的底物的情況下，補料分批系統(tǒng)是適用的。補料 分批系統(tǒng)中實際底物濃度的測量是困難的并且因此基于可測量因素的變化來估計，這 些因素諸如PH、溶解氧以及如C02的廢氣的分壓。分批和補料分批培養(yǎng)方法是常用的 并且在本領域中是已知的（參看例如Thomas D. Brock, Biotechnology :A Textbook of Industrial Microbiology,第 2 版(1989)Sinauer Associates, Inc. , Sunderland, MA ； Deshpande, 1992, Appl. Biochem. Biotechnol. 36:227,以引用的方式并入本文中）。
[oho] 連續(xù)培養(yǎng)是"開放"系統(tǒng)，其中將確定成分培養(yǎng)基連續(xù)添加至生物反應器中并且同 時移出等量的條件培養(yǎng)基以供處理。連續(xù)培養(yǎng)一般將細胞維持于恒定的高液相密度下，其 中細胞主要處于對數期生長中?；蛘?，可以用固定的細胞實施連續(xù)培養(yǎng)，其中連續(xù)添加碳和 養(yǎng)分并且從細胞團中連續(xù)地移出有價值的產物、副產物以及廢產物。細胞固定可以使用大 范圍的由天然和/或合成材料組成的固體支撐體來進行。
[0111] 連續(xù)或半連續(xù)培養(yǎng)允許調節(jié)影響細胞生長或最終產物濃度的一個因素或許多因 素。舉例來說，一種方法將以固定比率維持有限的養(yǎng)分，諸如碳源或氮水平，并且允許調節(jié) 所有其它參數。在其它系統(tǒng)中，可以連續(xù)地改變影響生長的許多因素，同時使通過培養(yǎng)基濁 度測量的細胞濃度保持恒定。連續(xù)系統(tǒng)努力維持穩(wěn)態(tài)生長條件，并且因此由于抽去培養(yǎng)基 而引起的細胞損失必須與培養(yǎng)物中的細胞生長速率保持平衡。調節(jié)連續(xù)培養(yǎng)過程的養(yǎng)分和 生長因子的方法以及使產物形成速率最大化的技術在本領域中是眾所周知的，并且多種方 法由Brock(同上）詳述。
[0112] 液相生物反應器（例如，攪拌槽、填充床、單液相、雙液相、中空纖維膜）在本領域 中是眾所周知的，并且可以用于根據本文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微 生物的生長以及生物催化。然而，甲烷和其它烴在水中相對低的溶解度可能限制具有甲烷 單加氧酶活性的酶的催化速率。
[0113] 通過使用氣相生物反應器，用于生物催化或生物修復的底物被根據本文所公開 的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部分從氣體吸收，而 不是從液體吸收。具有微生物的氣相生物反應器的使用在本領域中是已知的（例如，美 國專利 2, 793, 096 ;U. S. 4, 999, 302 ;美國專利 5, 585, 266 ;U. S. 5, 079, 168 ;美國法定發(fā)明 登記 H1430;美國專利公布 2003/0032170 ;Emerging Technologies in Hazardous Waste Management III，1993, Tedder 和 Pohland 編，第 411-428 頁；美國專利 6, 143, 556)。不 例性氣相生物反應器包括單流程系統(tǒng)、封閉回路泵送系統(tǒng)以及流化床反應器。通過利用 氣相生物反應器，甲烷或其它氣態(tài)底物可容易地用于由具有甲烷單加氧酶活性的酶進行 生物催化。此外，甲醇產物從水溶液中的蒸餾，這代表了液相生物反應器中的顯著成本， 可以在氣相生物反應器中得以避免。在某些實施方案中，根據本文所公開的實施方案中 的任一者的方法在氣相生物反應器中進行。在某些實施方案中，根據本文所公開的實施 方案中的任一者的方法在流化床反應器中進行。在流化床反應器中，流體（即，氣體或 液體）向上通過粒子床載體，通常是砂、粒狀活性碳或硅藻土，微生物可以在這些載體上 附著并生長。流體速度是粒子床載體和所附著的微生物懸?。?，床流化）的速度。附 著至粒子床載體的微生物在流體中自由地循環(huán)，從而允許流體中的底物至微生物的有效 質量轉移以及增加的微生物生長。示例性流化床反應器包括推流反應器和完全混合反 應器。具有微生物生物膜的流化床反應器的使用在本領域中是已知的（例如，Pfluger 等，2011，Bioresource Technologyl02:9919_9926;Fennell 等，1992,Biotechnology and Bioengineering40:1218-1232 ;Ruggeri 等,1994,Water Science Technology 29:347-351 ;美國專利4, 032, 407 ;美國專利4, 009, 098 ;美國專利4, 009, 105 ;以及美國專 利 3, 846, 289)。
[0114] 本公開中所提供的甲烷營養(yǎng)菌可以作為分離的純培養(yǎng)物生長，與可以幫助生長的 異源非甲烷營養(yǎng)性生物體或與甲烷營養(yǎng)菌的一種或多種不同菌株/或物種可以組合產生 混合培養(yǎng)物。
[0115] 如本公開中所提到，具有甲烷單加氧酶活性的酶可以具有廣泛的底物特異性，并 且可以將包括乙烷、丙烷以及丁烷的其它低碳烷烴氧化成其對應的醇并且將包括乙烯、丙 烯、丁烯以及丁二烯的低碳烯烴氧化成其對應的環(huán)氧化物。因此，根據本文所公開的實施方 案中的任一者的非天然存在的微生物以及將甲烷轉化成甲醇的方法可以類似地應用于轉 化以下的方法：乙烷轉化成乙醇、丙烷轉化成丙醇、丁烷轉化成丁醇、包含低碳烷烴的混合 烷烴氣體底物轉化成混合醇產物、乙烯轉化成環(huán)氧乙烷、丙烯轉化成環(huán)氧丙烷、丁烯轉化成 環(huán)氧丁烷，或包含低碳烯烴的混合烯烴氣體底物轉化成混合環(huán)氧化物產物。
[0116] 在某些實施方案中，提供了將乙烷轉化成乙醇的方法，這種方法包括：提供根據本 文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部分；使非天 然存在的微生物暴露于〇 2;包含乙烷的氣體底物；以及還原劑；其中將乙烷氣體轉化成乙 醇。
[0117] 在某些實施方案中，提供了將丙烷轉化成丙醇的方法，這種方法包括：提供根據本 文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部分；使非天 然存在的微生物暴露于〇 2;包含丙烷的氣體底物；以及還原劑；其中將丙烷氣體轉化成丙 醇。在其它實施方案中，丙醇基本上包含正丙醇。
[0118] 在某些實施方案中，提供了將丁烷轉化成丁醇的方法，這種方法包括：提供根據本 文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部分；使非天 然存在的微生物暴露于〇 2;包含丁烷的氣體底物；以及還原劑；其中將丁烷氣體轉化成丁 醇。在其它實施方案中，丁醇基本上包含正丁醇。
[0119] 在某些實施方案中，提供了將混合烷烴氣體底物轉化成混合醇產物的方法，這種 方法包括：提供根據本文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物或來源于其 的無細胞部分；使非天然存在的微生物暴露于O 2;包含低碳烷烴的混合氣體底物；以及還 原劑；其中將低碳烷烴轉化成對應的醇。包含低碳烷烴的混合氣體底物可以包含兩種或更 多種來自由以下組成的群組的烷烴：甲烷、乙烷、丙烷以及丁烷。
[0120] 在某些實施方案中，本公開所提供的將甲烷轉化成甲醇的方法在環(huán)境溫度和壓力 下氧化至少 l、5、10、30、50、70、90、100、150、200、250、300、500nmol 甲烷 /min/mg 催化劑 (例如，全細胞或無細胞提取物）干重。在某些實施方案中，本文所提供的將甲烷轉化成甲 醇的方法產生 >1L、>10L、>100L、>1000L、>10000L 或 >50000L 甲醇 / 天。
[0121] 在某些實施方案中，本公開所提供的將乙烷轉化成乙醇的方法在環(huán)境溫度和壓力 下氧化至少 l、5、10、30、50、70、90、100、150、200、250、300、500nmol 乙烷 /min/mg 催化劑 (例如，全細胞或無細胞提取物）干重。在某些實施方案中，本文所提供的將乙烷轉化成乙 醇的方法產生 >1L、>10L、>100L、>1000L、>10000L 或 >50000L 乙醇 / 天。
[0122] 在某些實施方案中，本公開所提供的將丙烷轉化成丙醇的方法在環(huán)境溫度和壓力 下氧化至少 l、5、10、30、50、70、90、100、150、200、250、300、500nmol 丙烷 /min/mg 催化劑 (例如，全細胞或無細胞提取物）干重。在某些實施方案中，本文所提供的將丙烷轉化成丙 醇的方法產生 >1L、>10L、>100L、>1000L、>10000L 或 >50000L 丙醇 / 天。
[0123] 在某些實施方案中，本公開所提供的將丁烷轉化成丁醇的方法在環(huán)境溫度和壓力 下氧化至少 l、5、10、30、50、70、90、100、150、200、250、300、500nmol 丁烷 /min/mg 催化劑 (例如，全細胞或無細胞提取物）干重。在某些實施方案中，本文所提供的將丁烷轉化成丁 醇的方法產生 >1L、>10L、>100L、>1000L、>10000L 或 >50000L 丁醇 / 天。
[0124] 在某些實施方案中，提供了將乙烯轉化成環(huán)氧乙烷的方法，這種方法包括：提供根 據本文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部分；使 非天然存在的微生物暴露于〇 2;包含乙烯的氣體底物；以及還原劑；其中將乙烯氣體轉化 成環(huán)氧乙烷。
[0125] 在某些實施方案中，提供了將丙烯轉化成環(huán)氧丙烷的方法，這種方法包括：提供根 據本文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部分；使 非天然存在的微生物暴露于〇 2;包含丙烯的氣體底物；以及還原劑；其中將丙烯氣體轉化 成環(huán)氧丙烷。在其它實施方案中，環(huán)氧丙烷基本上包含環(huán)氧正丙烷。
[0126] 在某些實施方案中，提供了將丁烯轉化成環(huán)氧丁烷的方法，這種方法包括：提供根 據本文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物或來源于其的無細胞部分；使 非天然存在的微生物暴露于〇 2;包含丁烯的氣體底物；以及還原劑；其中將丁烯氣體轉化 成環(huán)氧丁烷。在其它實施方案中，環(huán)氧丁烷基本上包含環(huán)氧正丁烷。
[0127] 在某些實施方案中，提供了將丁二烯轉化成包含丁二烯1，2氧化物的環(huán)氧化物產 物的方法。
[0128] 在某些實施方案中，提供了將混合烯烴氣體底物轉化成混合環(huán)氧化物產物的方 法，這種方法包括：提供根據本文所公開的實施方案中