中所提供的非天然存在的微生物。
[0059] 在一些實施方案中,宿主微生物可以是甲基營養(yǎng)菌,其可以使Cl化合物(缺乏 碳碳鍵)氧化;或甲烷營養(yǎng)菌,其一般為專性甲基營養(yǎng)菌,這種細菌具有使作為碳源和 能源的甲烷氧化的能力。甲烷營養(yǎng)菌基于其碳同化途徑和內(nèi)部膜結(jié)構(gòu)被分成三組型 (γ變形菌)、II型(α變形菌以及X型(γ變形菌)。I型甲烷營養(yǎng)菌使用單磷酸核酮 糖(RuMP)途徑用于碳同化,而II型甲烷營養(yǎng)菌使用絲氨酸途徑。X型甲烷營養(yǎng)菌使用 RuMP途徑,但也表達低水平的絲氨酸途徑的酶。甲烷營養(yǎng)菌被分成幾個屬:甲基單胞菌屬 (Methylomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacter)、甲基球菌屬(Methylococcus)、甲基抱囊 菌屬(Methylocystis)、甲基彎菌屬(Methylosinus)、甲基微菌屬(Methylomicrobium)、甲 焼單胞菌屬(Methanomonas)以及甲基胞菌屬(Methylocella)C甲焼營養(yǎng)菌還包括兼性 甲烷營養(yǎng)菌,其天然地具有利用一些多碳底物作為唯一碳源和能源的能力。兼性甲烷營養(yǎng) 菌包括甲基胞菌屬、甲基孢囊菌屬以及甲基莢膜菌屬(Methylocapsa)的一些種類(例如, 森林甲基胞菌(Methylocella silvestris)、沼澤甲基胞菌(Methylocella palustris)、 凍原甲基胞菌(Methylocella tundrae)、道氏甲基抱囊菌菌株SB2 (Methylocystis daltona strain SB2)、布氏甲基抱囊菌(Methylocystis bryophila)以及金色甲基莢 膜菌KYG(Methylocapsa aurea KYG))。示例性甲烷營養(yǎng)菌包括:莢膜甲基球菌Bath菌 株(Methylococcus capsulatus Bath strain)、甲基單胞菌屬 16a(ATCC PTA2402)、發(fā) 抱甲基彎菌 〇B3b (Methylosinus trichosporium 0B3b ;NRRL B-11,196)、生抱甲基彎菌 (Methylosinus sporium;NRRL B-11,197)、小甲基抱囊菌(Methylocystis parvus ;NRRL B_ll,198)、甲焼甲基單胞菌(Methylomonas methanica;NRRL B_ll,199)、白色甲基單胞 菌(Methylomonas albus;NRRL B-11,200)、莢膜甲基桿菌(Methylobacter capsulatus; NRRL B-11,201)、嗜有機甲基桿菌(Methylobacterium organophilum;ATCC 27, 886)、甲基 單胞菌屬AJ-3670(FERM P-2400)、森林甲基胞菌、沼澤甲基胞菌(ATCC 700799)、凍原甲基 胞菌、道氏甲基孢囊菌菌株SB2、布氏甲基孢囊菌、金色甲基莢膜菌KYG、極端嗜酸甲烷營養(yǎng) 菌(Methylacidiphilum infernorum)、培氏甲基細菌(Methylibium petroleiphilum)以及 嗜喊甲基微菌 20Z(Methylomicrobium alcaliphilum 20Z)。
[0060] 甲基營養(yǎng)菌涵蓋多樣化的組,包括革蘭氏陰性與革蘭氏陽性屬。甲基營養(yǎng)菌包 括兼性甲基營養(yǎng)菌(具有使不含碳碳鍵的有機化合物氧化的能力,但還可以利用其它碳 底物,諸如糖和復(fù)合碳水化合物)、專性甲基營養(yǎng)菌(限于使用不含碳碳鍵的有機化合 物)以及甲烷營養(yǎng)菌。甲基營養(yǎng)菌屬的實例包括:嗜甲基菌屬(Methylophilus)、甲基菌 屬(Methylobacillus)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、 黃色桿菌屬(Xanthobacter)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、副球菌屬(Paracoccus)、諾卡氏 菌屬(Nocardia)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)以及假 單胞菌屬(Pseudomonas)。示例性甲基營養(yǎng)菌包括:扭脫甲基桿菌(Methylobacterium extorquens)、耐福射甲基桿菌(Methylobacterium radiotolerans)、楊樹甲基桿菌 (Methylobacterium populi)、嗜中溫甲基桿菌(Methylobacterium chloromethanicum)、 結(jié)瘤甲基桿菌(Methylobacterium nodulans)、克萊拉甲基單胞菌(Methylomonas clara)、培氏甲基細菌、鞭毛甲基菌(Methylobacillus flagellates)、波氏娃桿菌 DSS-3(Silicibacter pomeroyi DSS-3)、瘤狀伯克霍爾德菌 STM815 (Burkholderia phymatumSTM815)、致病乙酸細菌NIHl·l(GranulibacterbethesdensisNIHl·l)以及脫 氮畐1J球菌(Paracoccus denitrificans) 〇
[0061] 所選的甲烷營養(yǎng)性宿主細菌還可以在選擇性條件下經(jīng)歷菌株馴化以鑒別具有用 于生產(chǎn)的改善的特性的變體。改善的特性可以包括增加的生長速率、所需產(chǎn)物的產(chǎn)率以及 對可能存在的過程污染物的耐受性(參看例如U. S. 6, 689, 601)。在特定實施方案中,選擇 高度生長的變體甲烷營養(yǎng)菌,其為能夠在作為唯一碳源和能源的甲烷上生長的生物體并且 具有比親本、參考或野生型細菌更快的指數(shù)期生長速率(即,更短的倍增時間)。
[0062] 在某些實施方案中,具有甲烷單加氧酶活性的酶是甲烷單加氧酶(MMO)。甲烷 單加氧酶是由甲烷營養(yǎng)菌表達的酶。MMO利用酶相關(guān)的金屬中心使二氧(O 2)的〇-〇鍵分 裂。一個氧原子被還原以形成H2O,而另一個氧原子攻擊甲烷的C-H鍵并且合并至甲烷中 以形成甲醇。還原劑是完成氧化反應(yīng)并且再生MMO所需要的。存在兩種類型的在甲烷營 養(yǎng)菌中發(fā)現(xiàn)的MMO :可溶性MMO(sMMO),其使用NADH作為體內(nèi)還原劑;和顆粒性或膜結(jié)合 的MMO(pMMO),其生理還原劑目前尚未確定。在體外已經(jīng)使用許多其它還原劑用于ΜΜ0,包 括甲酸鹽、杜氫醌(duroquinol)以及H 2,并且測試還原劑用于驅(qū)動MMO活性的方法在本 領(lǐng)域中是已知的(參看例如 Shiemke 等,1995, Arch. Biochem. Biophys. 321:421-8 ;美國 專利公布2003/0203456)。pMMO-般在除了甲基胞菌屬以外的幾乎所有的甲烷營養(yǎng)菌中 發(fā)現(xiàn),而甲烷營養(yǎng)菌的一個小子組,諸如莢膜甲基球菌Bath和發(fā)孢甲基彎菌0B3b,可以表 達sMMO或pMMO,這取決于培養(yǎng)基中的銅濃度。sMMO包含三種組分:由mmoXYZ編碼的羥 化酶(MMOH)、由mmoC編碼的還原酶(MMOR)以及由mmoB編碼的調(diào)控蛋白(MMOB)。包含活 性位點的MMOH由三個多肽組成,以α 2β2γ2二聚體排列。mmoX編碼含有活性位點的α 亞單元。pMMO由三個亞單元組成:a (pmoB)、β (pmoA,含有活性位點)以及γ (pmoC),以 α 3β 3γ 3三聚體排列。MMO具有大范圍的底物,不過sMMO具有比pMMO更寬范圍的底物活 性。pMMO還可以使諸如乙烷、丙烷、丁烷以及戊烷的其它烷烴氧化成其對應(yīng)的醇(在Jiang 等,2010,Biochemical Engineering Journal49:277_288 中評述)。pMMO 還可以使丙稀氧 化成環(huán)氧丙烷;丁 -1-烯氧化成1,2-環(huán)氧丁烷;1,3- 丁二烯氧化成1,2-環(huán)氧丁 -3-烯; 順-丁 -2-烯氧化成順-2, 3-環(huán)氧丁烷和丁烯醛;以及反-丁 -2-烯氧化成反-2, 3-環(huán)氧 丁烷、丁烯醇以及丁烯醛。sMMO可以使乙烷、丙烷、丁烷、己烷、辛烷以及2-甲基丙烷氧化 成其相關(guān)的醇(Jiang等,同上)。sMMO還可以使乙稀氧化成環(huán)氧乙燒;丙稀氧化成環(huán)氧 丙烷;丁 -1-烯氧化成1,2-環(huán)氧丁烷;順-丁 -2-烯氧化成順-2, 3-環(huán)氧丁烷和順-2- 丁 烯-1-醇;以及反-丁 -2-烯氧化成反_2, 3-環(huán)氧丁烷和反-2- 丁烯-1-醇(Jiang等,同 上;Colby等,1977, Biochem J. 165:395-402)。pMMO相較于sMMO具有更高的比活性和穩(wěn) 定性。在某些實施方案中,具有甲烷單加氧酶活性的酶是pMMO或sMMO。
[0063] 用于測量MMO活性的試驗在本領(lǐng)域中是已知的。舉例來說,比色萘試驗可以用 于監(jiān)測 sMMO 活性(參看例如 Brusseau 等,1990, Biodegradation 1:19-29)。純化的 sMMO或在銅缺乏培養(yǎng)基中生長的細胞可以使萘氧化成1-萘酚與2-萘酚的混合物,其通 過與四氮化的鄰二甲氧基苯胺反應(yīng)形成具有大的分子吸收能力的紫色重氮染料來檢測。 sMMO和pMMO活性可以通過使用氣相色譜法監(jiān)測全細胞、細胞提取物、可溶部分或膜部分 中丙烯的氧化來測量(參看例如 Prior 和 Dalton, 1985, J. Gen. Microbiol. 131:155-163 ; Dispirito 等,1992,Biodegradation 2: 151-164 ;Zahn 和 Dispirito,1996,J. Bacterioll78:1018-1029) ο
[0064] 已經(jīng)對來自許多甲烷營養(yǎng)菌的sMMO和pMMO基因進行測序和表征(參看例 如 Stainthorpe 等,1989,Arch. Microbiol. 152:154-159 ;Stainthorpe 等,1990,Gene 91:27-34 ;Coufal 等,2000,Eur. J.Biochem. 267:2174-2185 ;Cardy 等,1991,]?〇1· Microbiol. 5:335-342 ;Cardy 等,1991,Arch. Microbiol. 156:477-483 ;Semrau等,1995, J. Bacteriol. 177:3071-3079 ;Stolvar 等,1999,Microbiol. 145:1235-1244 ;Gilbert 等,2000,Appl.Environ.Mic;robiol· 66:966-975 ;Bodrossy 等,1995,Applied Environ. Microbiol. 61:3549-3555 ;Bodrossy 等,1999,FEMS Microbiol. Lett. 170:335-341 ;Lin 等,2005, Appl. Environ. Microbiol. 71:6458-6462 ;Hou 等 2008, Biol. Direct. 3:26)??梢?在根據(jù)本文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物中使用的示例性pMMO氨 基酸序列提供于SEQIDN0:l-643 和SEQIDN0:644-648 中。
[0065] 在某些實施方案中,具有甲烷單加氧酶活性的酶是氨單加氧酶。氨單加氧酶 (AMO)是通過使催化氨氧化成羥胺的細菌硝化而表達的膜結(jié)合的酶。AMO是pMMO同源 物,也已知其使甲烷和其它烷烴(至多C 8)氧化成其對應(yīng)的醇(Hyman等,1988, Applied Environ. Microbiol. 54:3187-3190)。AMO 操縱子由 amoC、amoA 以及 amoB 基因組成,其中 amoA含有活性位點。AMO活性試驗在本領(lǐng)域中是已知的(參看例如Moir等,1996, FEBS Lett. 387:71-74 ;Ensign 等,1993, J. Bacteriol. 175:1971)。已經(jīng)在許多細菌中對 AMO 進行測序和表征(參看例如 McTavish 等,1993, J. Bacteriol. 175:2436-2444 ;Norton 等,2002, Arch. Microbiol. 177:139-149)??梢栽诟鶕?jù)本文所公開的實施方案中的任一者 的非天然存在的微生物中使用的示例性AMO氨基酸序列提供于SEQ ID N0:649-654中。
[0066] 在某些實施方案中,具有甲烷單加氧酶活性的酶是P450。P450,也稱為細胞色素 P450或CYP,指的是催化有機化合物氧化的酶的超家族。P450具有大范圍的底物,包括脂 質(zhì)、類固醇激素以及異生物質(zhì)。由P450催化的最常見反應(yīng)是單加氧酶反應(yīng),其中將一個氧 原子插入有機底物(R-H)中,而將另一個氧原子還原成水。P450酶已經(jīng)在大范圍的生物體 中發(fā)現(xiàn),包括動物、植物、真菌、細菌(不包括大腸桿菌(E. coli))以及古生菌。來自分枝桿 菌屬(Mycobacterium sp.)HXN_1500、CYP153A6 以及巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium) CYP102A1 (BM3)的可溶性細胞色素 P450已經(jīng)顯示使小烷烴氧化成其對應(yīng)的醇,包括對 于 CYP153A6 的甲烷(Chen 等,2012,Protein Eng. Design Selection 25:171-178; Chen, Mike Ming Yu, 2011, Directed evolution of cytochrome P450for small alkane hydroxylation. Dissertation(Ph. D. ), California Institute of Technology)。P450 活性可以通過使用氣相色譜法-質(zhì)譜法測量多種烷烴至醇的生物轉(zhuǎn)化來分析(例如, Kubota 等,2005,Biosci. Biotechnol. Biochem. 69:2421-2430 ;Fujii 等,2004,Biosci. Biotechnol. Biochem. 68:2171-2177)。已經(jīng)對眾多P450基因進行測序和表征(參看例如 Nelson 等,1996, Pharmacogenetics 6:1-42 ;Funhoff 等,2006, J. Bacteriol. 188:5220-7 ; Kubota 等,2005, Biosci. Biotechnol. Biochem. 69:2421-2430) 〇
[0067] 如上文所描述,具有甲烷單加氧酶活性的酶可以包含多種組分。在某些實施方案 中,編碼具有甲烷單加氧酶活性的酶的核酸可以包含編碼具有甲烷單加氧酶活性的酶(例 如,這種酶的所有亞單元)或構(gòu)成這種酶的活性位點的單個亞單元的基因簇或操縱子的多 聚核苷酸。舉例來說,在具有甲烷單加氧酶活性的酶是PMMO的情況下,核酸可以包含有包 含pmoCAB基因簇或pmoA基因(β亞單元)的多聚核苷酸。在另一個實例中,在具有甲燒 單加氧酶活性的酶是sMMO的情況下,核酸可以包含有包含mmoXYZ基因簇或mmoX基因 (α 亞單元)的多聚核苷酸。
[0068] 本公開的非天然存在的微生物包含在化學(xué)或環(huán)境應(yīng)激存在下穩(wěn)定的具有甲烷單 加氧酶活性的酶,意味著這種酶在暴露于化學(xué)或環(huán)境應(yīng)激期間保留實質(zhì)的活性(即,與不 存在應(yīng)激條件的情況相比在應(yīng)激條件下至少25 %的催化活性)。舉例來說,具有MMO活性 并且在化學(xué)或環(huán)境應(yīng)激存在下具有先有的穩(wěn)定性的酶,例如在>60°C下具有溫度穩(wěn)定性的 來自嗜熱甲烷營養(yǎng)菌的PMMO酶,可以被選擇用于轉(zhuǎn)型至宿主微生物中。所選的PMMO酶在 >60°C的溫度下與常溫(例如,25-30°C)相比保留至少25%的MMO活性。在化學(xué)或環(huán)境應(yīng) 激存在下穩(wěn)定的具有甲烷單加氧酶活性的酶與不存在應(yīng)激條件的情況相比可以保留至少 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 99 %的催化活性。
[0069] 在某些實施方案中,編碼天然地在化學(xué)或環(huán)境應(yīng)激存在下具有所需穩(wěn)定性的具 有甲烷單加氧酶活性的酶的核酸用于使根據(jù)本文所公開的實施方案中的任一者的非天 然存在的微生物轉(zhuǎn)型。舉例來說,已經(jīng)分離出嗜熱(例如,Bodrossy等,1995, Applied Environ. Microbiol. 61:3549-3555)、嗜喊(例如,Lin 等,2005, Appl. Environ. Microbiol. 71:6458-6462)以及嗜酸(例如,Hou 等,2008,Biol.Direct 3:26)甲烷營養(yǎng) 菌??梢詫⒕幋a來源于嗜熱、嗜堿或嗜酸甲烷營養(yǎng)菌的MMO的核酸引入其它微生物中,包括 缺乏MMO的微生物和具有沒有所需化學(xué)或環(huán)境穩(wěn)定性的MMO的甲烷營養(yǎng)菌,以提供具有甲 烷單加氧酶活性并且分別在高溫、高PH或低pH存在下具有穩(wěn)定性的酶??梢杂糜诒竟_的 非天然存在的微生物中的來自熱穩(wěn)定的甲烷營養(yǎng)菌的示例性PMMO氨基酸序列提供于SEQ ID N0:644-648中。編碼天然地在化學(xué)或環(huán)境應(yīng)激中具有所需穩(wěn)定性(例如,熱穩(wěn)定性)的 具有甲烷單加氧酶活性的其它酶(例如,ΑΜ0、P450)的核酸的來源可以是展現(xiàn)相同的化學(xué) 或環(huán)境穩(wěn)定性(例如,熱穩(wěn)定性)的微生物。提供了可以用于本公開的非天然存在的微生 物中的來自耐鹽細菌(SEQ ID N0:652、653)和來自高度耐應(yīng)激細菌(SEQ ID N0:654)的示 例性AMO氨基酸序列。
[0070] 根據(jù)本文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物可以包含已經(jīng)被 遺傳工程改造成在化學(xué)或環(huán)境應(yīng)激存在下"穩(wěn)定"的具有催化活性的酶,意味著工程改造的 酶在暴露于化學(xué)或環(huán)境應(yīng)激期間與暴露于相同應(yīng)激條件的野生型或參考酶相比保留顯著 的催化活性(即,野生型或參考酶在暴露于應(yīng)激條件期間與不存在應(yīng)激條件的情況相比保 留小于25%的催化活性)。野生型或參考酶在暴露于應(yīng)激條件期間與不存在應(yīng)激條件的情 況相比可以保留24%、20%、15%、10%、5%或更?。ā?5%)的催化活性。具有甲烷單加氧 酶活性的酶在所選的化學(xué)或環(huán)境應(yīng)激存在下的穩(wěn)定性可以使用本領(lǐng)域中已知的多種活性 試驗來測量。
[0071] 編碼具有甲烷單加氧酶活性的酶的參考核酸,也稱為"野生型"或"親本"核酸, 用作具有所需穩(wěn)定性的變體酶的遺傳工程改造的起始分子。舉例來說,在化學(xué)或環(huán)境應(yīng) 激中不會展現(xiàn)特定穩(wěn)定性的來自甲烷營養(yǎng)菌(例如,發(fā)孢甲基彎菌〇B3b)的SMMO或PMMO 編碼核酸可以被選作用于設(shè)計具有所選的化學(xué)或環(huán)境應(yīng)激穩(wěn)定性(例如,溫度>60°C)的 變體MMO酶的參考分子。可以進行遺傳工程改造的示例性參考pMMO氨基酸序列提供于 SEQ ID NO: 1-643中??梢赃M行遺傳工程改造的示例性參考AMO氨基酸序列提供于SEQ ID N0:649-654中。具有甲烷單加氧酶活性的酶的變體(例如,pMMO)和編碼其的核酸的 設(shè)計可以使用基于系統(tǒng)發(fā)育的方法來完成,這些方法描述于例如美國專利號8, 005, 620 和 Gustafsson(Curr. Opin. Biotechnol. 14:366, 2003 ;這些方法以引用的方式并入)以 及 Welch 等(J.R. Soc. Interface. 6:S467, 2009)'Villalobos 等(BMC Bioinformatics 7:285, 2006)、Minshull 等(Curr. Opin. Chem. Biol. 9:202, 2005)、Gustafsson 等(Trends Biotechnol. 22:346, 2004)以及 Minshull (Methods 32:416,2004)中。
[0072] 在宿主微生物中具有甲烷單加氧酶活性的內(nèi)源酶(即,在化學(xué)或環(huán)境應(yīng)激中不穩(wěn) 定的酶)可能不需要被滅活,并且可以與所引入的在化學(xué)或環(huán)境應(yīng)激中穩(wěn)定的具有甲烷單 加氧酶活性的酶一起存在于非天然存在的微生物中。
[0073] 通過基于系統(tǒng)發(fā)育的方法產(chǎn)生的具有甲烷單加氧酶活性的每種變體酶是與具有 甲烷單加氧酶活性的參考或親本野生型酶至少70 %、75%、80%、85%或90% -致(例如, 至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或 至少99%-致)的多肽。在某些實施方案中,變體酶相對于具有甲烷單加氧酶活性的參考 或親本野生型酶在預(yù)定位置處還含有至少一個氨基酸取代(例如,1、2、3、5、6、7、8、9或10 個或更多個或至多20或30個或更多個取代),條件是變體保留甲烷單加氧酶活性。
[0074] 使用本領(lǐng)域中已知的多種方法,可以使如本文所描述的非天然存在的微生物轉(zhuǎn) 型以包含至少一個外源核酸來提供具有新的或增強的活性(即,在化學(xué)或環(huán)境應(yīng)激存在 下穩(wěn)定的甲烷單加氧酶活性)的宿主生物體,或可以進行遺傳修飾以去除或大大降低內(nèi) 源基因功能(例如,甲醇脫氫酶活性)。用于核酸在微生物生物體中的外源表達的重組 方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。所述方法可以發(fā)現(xiàn)描述于例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory, New York(2001);以及 Ausubel 等,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999)中。pMMO或sMMO在異源宿主中的表達先前已有描述(參 看例如 Jahng 等,1996, Biotechnol. Bioeng. 51:349-59 ;Han