等，2009, Sheng wu Gong Cheng Xue Bao 25:1151-9 ;Gou 等，2006, 263:136-141 ;Ramakrishnan 等，2010, Nature 465:115-119)〇
[0075] 雖然甲燒營養(yǎng)菌的遺傳工程改造工具不如其它微生物（例如，大腸桿菌）一樣廣 泛，但如下文所概述，已經(jīng)取得了重大的進展，從而允許甲烷營養(yǎng)菌的遺傳操縱。
[0076] 適用于在甲烷營養(yǎng)菌中表達異源核酸的表達系統(tǒng)和表達載體是已知的。適用于適 合的宿主微生物的轉(zhuǎn)型的載體或盒是可得到的。
[0077] 甲基營養(yǎng)菌的電穿孔先前已經(jīng)描述于Toyama等，1998, FEMS Microbiol. Lett. 166 : 1-7 (扭脫甲基桿菌）；Kim 和 Wood, 1997, Appl. Microbiol. Biotechnol. 48:105-108 (甲基營養(yǎng)型嗜甲基菌 ASl (Methylophilus methylotrophus AS1)) ;Yoshida 等，2001，Biotechnol. Lett. 23:787-791 (甲基菌屬菌株 12S);以及 US2008/0026005(扭脫甲基桿菌）中。
[0078] 細菌綴合，其指的是涉及供體與受體細胞直接接觸的特定類型的轉(zhuǎn)型，更頻繁地 用于將核酸轉(zhuǎn)移至甲烷營養(yǎng)菌中。細菌綴合涉及將"供體"與"受體"細胞彼此緊密接觸地混 合在一起。綴合通過在供體與受體細菌之間形成細胞質(zhì)連接而發(fā)生，其中新合成的供體核 酸單向轉(zhuǎn)移至受體細胞中。綴合反應中的受體是可以通過從供體細菌水平轉(zhuǎn)移來接受核酸 的任何細胞。綴合反應中的供體是含有綴合性質(zhì)粒、綴合性轉(zhuǎn)座子或動員質(zhì)粒的細菌。供體 質(zhì)粒的物理轉(zhuǎn)移可以通過自傳遞質(zhì)?；蚪柚?輔助"質(zhì)粒而發(fā)生。涉及甲烷營養(yǎng)菌的綴合 先前已經(jīng)描述于Stolyar等，1995, Mikrobiologiya 64:686-691 ;Motoyama等，1994, Appl. Micro. Biotech. 42:67-72 ;Lloyd 等，1999, Archives of Microbiologyl71:364-370 ;以及 Odom 等，PCT 公布 TO 02/18617 ;Ali 等，2006, Microbiol. 152:2931-2942 中。
[0079] 異源核酸分子在甲烷營養(yǎng)菌中的表達在本領(lǐng)域中是已知的（參看例如美國專利 6, 818, 424、美國專利公布2003/0003528)。甲基營養(yǎng)菌的基于Mu轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)型已有描述 (參看例如 Akhverdyan 等，2011，Appl. Microbiol. Biotechnol. 91:857-871)。用于異源基 因的單一和多拷貝表達而不會插入滅活甲基桿菌中的宿主基因的mini-Tn7轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)已 有描述（參看例如美國專利公布2008/0026005)。
[0080] 可以使用使甲烷營養(yǎng)菌中的內(nèi)源基因功能滅活、敲除或缺失的各種方 法。使用自殺載體在緩慢生長的甲烷營養(yǎng)菌中構(gòu)建缺失/插入突變體的等位基因 交換也已經(jīng)描述于 Toyama 和 Lidstrom, 1998,Microbiol. 144:183-191 ;Stolyar 等，1999,Microbiol. 145:1235-1244 ;Ali 等，2006,Microbiology 152:2931-2942 ;Van Dien 等，2003, Microbiol. 149:601-609 中。
[0081] 可以利用用于外源核酸的高度表達的適合的同源或異源啟動子。舉例來說，美國 專利7, 098, 005描述了使用在甲烷或甲醇存在下高度表達的啟動子用于甲烷營養(yǎng)菌中的 異源基因表達?？梢允褂玫念~外的啟動子包括脫氧木酮糖磷酸合成酶甲醇脫氫酶操縱子 啟動子（Springer 等，1998, FEMS Microbiol. Lett. 160:119-124);用于 PHA 合成的啟動 子（Foellner 等 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:284-291);或從甲基營養(yǎng)菌中的 原生質(zhì)粒鑒別的啟動子（EP296484)。非原生啟動子包括Iac操縱子Plac啟動子（Toyama 等，1997, Microbiology 143:595-602)，或雜合啟動子，諸如 Ptrc (Brosius 等，1984, Gene 27:161-172)。還可以利用在宿主Cl代謝生物體中外源核酸分子的表達的調(diào)控。舉例來 說，甲基營養(yǎng)菌和甲烷營養(yǎng)菌中重組蛋白質(zhì)表達的可誘導/可調(diào)控系統(tǒng)已經(jīng)描述于美國專 利公布 2010/0221813 中。
[0082] 如本文所提供的非天然存在的微生物還包含至少一種滅活的醇脫氫酶（ADH)。如 本文所用的醇脫氫酶指的是催化醇可逆地轉(zhuǎn)化成對應的醛或酮，同時NAD +還原成NADH的 任何酶。如果醇脫氫酶與野生型或參考酶相比具有小于25 %的活性或在暴露于化學或環(huán) 境應激期間或之后與在正常條件期間相比具有小于25%的活性，那么這種醇脫氫酶被滅 活。舉例來說，滅活的ADH(例如，遺傳滅活）與野生型ADH相比可以具有24%、20%、15%、 10%、5%或1%或更小的活性。在另一個實例中，滅活的ADH在暴露于化學或環(huán)境應激（例 如，熱>60°C )期間或之后與不存在化學或環(huán)境應激的情況（例如，在常溫下）相比可以具 有24 %、20 %、15 %、10 %、5 %或1 %或更小的活性。根據(jù)本文所公開的實施方案中的任一 者，至少一種醇脫氫酶包括甲醇脫氫酶。甲醇脫氫酶（MDH)催化甲醇轉(zhuǎn)化成甲醛。ADH基 因已經(jīng)在許多微生物中鑒別到（參看例如Harms等，1987, J. Bacteriol. 169:3969-3975 ; de Vries 等，1992,J. Bacteriol. 174:5346-5353 ;Anderson 等，1990, Gene 90:173-176 ; Anthony 和 Williams，2003，Biochim.Biophys.Acta 1647:18-23 ;Ward 等，2004, PLoS Biol. 2:e303;Bennetzen 和 Hall,1982,J.Biol.Chem. 257:3018-3025 ;Reid 和 Fewson，1994, Crit. Rev. Microbiol. 20:13-56)ο
[0083] 醇脫氫酶可以顯示出廣泛的或非特異性的氧化活性（參看例如Anthony和 Zatman, 1965, Biochem. J. 96:808 ;Lu 等，2010, J. Am. Chem. Soc. 132:15451-5)。由具有甲 烷單加氧酶活性的酶產(chǎn)生的醇或環(huán)氧化物產(chǎn)物（包括甲醇）可以被內(nèi)源醇脫氫酶進一步氧 化成不合需要的產(chǎn)物。本文所提供的非天然存在的微生物由于甲醇、其它醇產(chǎn)物（例如， 乙醇、丙醇以及丁醇）或環(huán)氧化物的下游代謝可能展現(xiàn)較差產(chǎn)率。通過使至少一種醇脫氫 酶（例如，甲醇脫氫酶）滅活，可以實現(xiàn)醇或環(huán)氧化物產(chǎn)物損失的減少和產(chǎn)物產(chǎn)率的改善。 在其它實施方案中，提供了非天然存在的微生物，其中兩種、三種、四種或更多種醇脫氫酶 被滅活。舉例來說，可以在發(fā)孢甲基彎菌〇B3b、莢膜甲基球菌菌株Bath以及嗜堿甲基微 菌20Z中被滅活的ADH序列提供于SEQ ID N0:655-665中。ADH的滅活可以通過本領(lǐng)域中 已知的方法來確認（參看例如 Wadzinski 和 Ribbons, 1975, J. Bacteriol. 122:1364-1374 ; Frank 等，1989,Eur. J. Biochem. 184:187-195 ;Guo 和 Lidstrom，2006,Arch. Microbiol. 186:139-49 ;Anthony 和 Zatman，1967,Biochem. J. 104:960-9 ;Kalyuzhnaya 等，2008, J. Bacteriol. 190:3817-3823 ;Schmidt 等，2010, Microbiol. 156:2575-2586)。
[0084] 在某些實施方案中，醇脫氫酶通過遺傳修飾被滅活。使微生物中的內(nèi)源基因功 能滅活、敲除或缺失的遺傳方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。舉例來說，在有待被滅活的基 因的序列已知的情況下，可以使用靶向的基因破壞，其中將外來DNA插入結(jié)構(gòu)基因中以 破壞轉(zhuǎn)錄。這可以用包含DNA插入物（例如，遺傳標志）的基因盒來實現(xiàn)，這些DNA插 入物側(cè)接有與有待被破壞的基因的一部分具有高度同源性的序列。在將所述盒引入宿 主微生物中之后，原生DNA復制機制將外來DNA插入結(jié)構(gòu)基因中（參看例如Hamilton 等，1989, J. Bacteriol. 171:4617-4622 ;Balbas 等，1993, Gene 136:211-213)?；蚱?壞方法的實例包括轉(zhuǎn)座子誘變（例如，Simon等，1983, Nature Biotechnol. 1:784-791 ; Hayes, 2003, Annual Rev. Genet. 37:3-29);內(nèi)含子插入（例如，Karberg 等，2001，Nat. Biotechnol. 19:1162-7 ;Zhong 等，2003, Nucleic Acids Res. 31:1656-64);使用 PCR 片段 的革巴向敲除（例如，Murphy, 2011，Methods Mol. Biol. 765:27-42 ;Baudin 等，1993, Nucleic Acids Res. 21:3320-30);等位基因交換（例如，Toyama 和 Lidstrom, 1998, Microbi ol. 144:183-191 ;Stolyar等，1999，Microbiol. 145:1235-1244);以及Cre-Iox重組敲除系 統(tǒng)（例如，Gueldener等，2002, Nucleic Acids Res. 30:e23 ;Pomerantsev等，2006, Infect. Tmmun. 74:682-693)。
[0085] 在某些實施方案中，具有甲烷單加氧酶活性的酶穩(wěn)定的化學或環(huán)境應激使醇脫氫 酶滅活。在其它實施方案中，醇脫氫酶通過化學或環(huán)境應激被滅活，這種化學或環(huán)境應激是 至少60°C的溫度、至少9的pH、或者5或低于5的pH。如果針對在特定化學或環(huán)境應激中的 穩(wěn)定性來選擇編碼具有甲烷單加氧酶活性的酶的核酸并且將其引入微生物中，那么轉(zhuǎn)型的 微生物暴露于特定化學或環(huán)境應激可以經(jīng)過設(shè)計以保留MMO活性，同時使至少一種ADH(例 如，MDH)滅活。在一些實施方案中，微生物的大量或大多數(shù)的內(nèi)源酶通過化學或環(huán)境應激 被滅活，但具有MMO活性的酶除外。使用化學或環(huán)境應激使下游醇（例如，甲醇）或環(huán)氧化 物代謝酶滅活避免了需要進行ADH和其它非特異性酶的基因敲除，從而改善醇或環(huán)氧化物 的生產(chǎn)效率。舉例來說，非天然存在的微生物可以用編碼在>60°C下熱穩(wěn)定的具有MMO活性 的酶（例如，pMM〇)的外源核酸來轉(zhuǎn)型。微生物中的ADH(包括MDH)以及大多數(shù)其它內(nèi)源 酶在這種高溫下被滅活，其允許有效地產(chǎn)生所需的醇（例如，甲醇）。因為甲烷的氧化是高 度放熱的，所以具有MMO活性的酶的增加的熱穩(wěn)定性的另一個優(yōu)點在于其允許在更高溫度 下操作生物反應器，從而改善冷卻效率并且降低成分，同時使得催化劑更加耐受小的局部 溫度劇增，這種溫度劇增可能在商業(yè)級反應器中發(fā)生。此外，酶反應通常在更高溫度下更快 速地進行，這可以改善總體工藝產(chǎn)率。
[0086] 在優(yōu)選的實施方案中，所選的宿主微生物并不展現(xiàn)出引入微生物中的具有甲烷單 加氧酶活性的酶所展現(xiàn)的特定的化學或環(huán)境應激穩(wěn)定性。
[0087] 環(huán)境或化學應激指的是影響微生物正常代謝、存活的能力，或微生物的蛋白質(zhì)或 酶（例如，甲醇脫氫酶）執(zhí)行其功能的能力的條件。環(huán)境應激條件包括溫度極限（熱或 冷）、光利用率、水利用率以及氧濃度?；瘜W應激條件包括增加的金屬濃度、PH應激（高酸 度或堿度）、增加的鹽濃度、暴露于化學品，以及低養(yǎng)分利用率。舉例來說，環(huán)境應激可以是 至少40°C、至少45°C、至少50°C、至少55°C、至少60°C、至少65°C、至少70°C、至少75°C、至 少80°C、至少85°C、至少90°C或至少95°C的溫度。在另一個實例中，化學應激可以是至少 8、至少8. 5、至少9、至少9. 2、至少9. 4、至少9. 6、至少9. 8或至少10的pH，或至多6、至多 5. 5、至多5、至多4. 8、至多4. 6、至多4. 4、至多4. 2或至多4的pH。根據(jù)本文所公開的實施 方案中的任一者，化學或環(huán)境應激可以是至少60°C的溫度、至少9的pH、或者5或低于5的 pH〇
[0088] 編碼具有甲烷單加氧酶活性的酶的外源核酸的引入向如本文所提供的非天然存 在的微生物賦予將甲烷轉(zhuǎn)化成甲醇的能力。歸因于具有甲烷單加氧酶活性的一些酶（例 如，sMMO和pMMO)的廣泛特異性，根據(jù)本文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的 微生物可能還能夠分別將乙烷、丙烷以及丁烷轉(zhuǎn)化成其對應的醇，即乙醇、丙醇以及丁醇， 或?qū)⒁蚁?、丙烯、丁烯以及丁二烯轉(zhuǎn)化成其對應的環(huán)氧化物。在某些實施方案中，丁醇基本 上包含正丁醇（即，正丁醇占丁醇產(chǎn)物的至少50%或更多）。在某些實施方案中，丙醇基本 上包含正丙醇（即，正丙醇占丙醇產(chǎn)物的至少50%或更多）。在某些實施方案中，根據(jù)本文 所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物能夠?qū)⒒旌贤闊N氣體底物轉(zhuǎn)化成混 合醇產(chǎn)物。混合烷烴氣體底物可以是濕（未處理的）天然氣或其部分分離的衍生物（例如， 在處理期間從濕天然氣中分離的天然氣液）。天然氣液包括乙烷、丙烷以及丁烷。在某些實 施方案中，根據(jù)本文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物能夠?qū)⒌吞纪闊N (即，選自甲烷、乙烷、丙烷以及丁烷的兩種或更多種烷烴的任何組合）轉(zhuǎn)化成其對應的醇。
[0089] 根據(jù)本文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物可能還能夠分別 將乙烯、丙烯、丁烯、丁二烯轉(zhuǎn)化成其對應的環(huán)氧化物，即環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷、環(huán)氧丁烷以 及丁二烯1，2氧化物。在某些實施方案中，根據(jù)本文所公開的實施方案中的任一者的非天 然存在的微生物能夠?qū)⒒旌舷N氣體底物轉(zhuǎn)化成混合環(huán)氧化物產(chǎn)物?；旌舷N氣體底物可 以是來自石油裂化器的氣流或其部分分離的衍生物。在某些實施方案中，根據(jù)本文所公開 的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物能夠?qū)⒌吞枷N（即，選自乙烯、丙烯、丁烯 以及丁二烯的兩種或更多種烯烴的任何組合）轉(zhuǎn)化成其對應的環(huán)氧化物。
[0090] 如本公開中所提到，具有甲烷單加氧酶活性的酶使用還原劑來催化甲烷和 其它低碳烷烴氧化成其對應的醇或烯烴氧化成其對應的環(huán)氧化物，并且再生這種 酶。SMMO的生理還原劑是NADH。然而，NADH或類似輔因子不太可能用于生物反應器 中。已知具有甲烷單加氧酶活性的酶使用其它還原劑，諸如氫醌（例如，杜氫醌）、甲 酸鹽或 H2 (Shiemke 等，1995,Arch. Biochem. Biophys. 321:421-8 ;Shiemke 等，2004,J. Bacteriol. 186-928-937 ;Patel 等，1982, Appl. Environ.Microbiol.44:1130-1137 ; Hanczar等，2002, Arch. Microbiol. 177:167-172)。在某些實施方案中，根據(jù)本文所公開的 實施方案中的任一者的非天然存在的微生物能夠利用H2作為還原劑用于將甲烷轉(zhuǎn)化成甲 醇。在其它實施方案中，編碼具有甲烷單加氧酶活性的酶的外源核酸已經(jīng)使用本文所描述 的基于系統(tǒng)發(fā)育的方法進行遺傳修飾以能夠直接利用H 2作為還原劑（即，沒有任何輔助蛋 白，諸如氫化酶）。在其它實施方案中，根據(jù)本文所公開的實施方案中的任一者的非天然存 在的微生物包含編碼氫化酶的核酸（外源或內(nèi)源），這種氫化酶能夠使用H 2作為還原劑。 氫化酶催化分子氫的可逆氧化，并且可能是氫驅(qū)動的MMO活性所需要的。使用H2作為MMO 活性的還原劑可以允許更好地控制熱產(chǎn)生，因為甲烷氧化可以作為兩個放熱半反應而發(fā)生 (見圖1)，這兩個放熱半反應可以依序進彳丁，而不是同時進彳?。?，CH 4+02+H2- H 20+CH30H)。 其次，水副產(chǎn)物的產(chǎn)生可以獨立于甲醇產(chǎn)生而進行，從而減少對高成本的甲醇蒸餾的需要。
[0091] 使用可用于幾百種微生物的全基因組序列，在相關(guān)或遠緣物種（包括例如同源 物、直系同源物、間接同源物等）中編碼具有甲烷單加氧酶活性的酶或醇脫氫酶的基因的 鑒別是常規(guī)的并且在本領(lǐng)域中眾所周知。因此，本文中關(guān)于來自特定微生物的特定核酸所 描述的編碼具有甲烷單加氧酶活性的酶的外源核酸可以容易地包括來自其它微生物的編 碼具有甲烷單加氧酶活性的酶的其它核酸。此外，在宿主微生物中有待被滅活的醇脫氫酶 的鑒別可以通過宿主微生物序列與同源或異源微生物中已知的醇脫氫酶蛋白質(zhì)的相似度 來鑒別。
[0092] 本文所描述的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)域以及其片段（諸如具有甲烷單加氧酶活性的酶或 醇脫氫酶）的多肽序列和編碼核酸可以包括天然的和重組工程改造的變體。核酸變體指的 是可以含有一個或多個取代、添加、缺失、插入，或可以是或包含參考核酸的片段的核酸。參 考核酸指的是所選的野生型或親本核酸，其編碼具有甲烷單加氧酶活性的酶。變體核酸與 參考核酸可以具有 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%或99%的序列同一性，只要變體核酸編碼仍然可以執(zhí)行必需的功能或生物 活性（例如，使甲烷氧化成甲醇）的多肽即可。變體多肽與參考蛋白可以具有50%、55%、 60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %, 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，只要變體多肽仍然可 以執(zhí)行其必需的功能或生物活性（例如，使甲烷氧化成甲醇）即可。在某些實施方案中， 引入根據(jù)本文所公開的實施方案中的任一者的非天然存在的微生物中的具有甲烷單加氧 酶活性的酶包含與選自 SEQ ID N0:1-643、SEQ ID N0:644-648 以及 SEQ ID N0:649-654 的氨基酸序列具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同 一性的氨基酸序列。在某些實施方案中，在根據(jù)本文所公開的實施方案中的任一者的非天 然存在的微生物中被滅活的醇脫氫酶包含與選自SEQ ID N0:655-665的氨基酸序列具有至 少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的氨基酸序列。這 些變體相比親本（或野生型）蛋白質(zhì)可以具有改善的功能和生物活性（例如，更高的酶活 性或?qū)Φ孜锔纳频奶禺愋裕?。歸因于遺傳密碼中的冗余，核酸變體可能影響或可能不影響 氨基酸序列。核酸變體還可以編碼與參考氨基酸序列相比包含一個或多個保守取代的氨基 酸序列。保守取代可以在多肽中天然地發(fā)生（例如，天然存在的遺傳變體），或當重組產(chǎn)生 多肽時可以被引入。保守取代是一個氨基酸取代具有類似特性的另一個氨基酸，以使得本 領(lǐng)域的技術(shù)人員將預期多肽的二級結(jié)構(gòu)和親疏水性質(zhì)（hydropathic nature)基本上不改 變。氨基酸取代一般可以基于殘基的極性、電荷、可溶性、疏水性和/或兩親性質(zhì)的相似性 來進行，并且在本領(lǐng)域中是已知的?？梢允褂帽娝苤统Ｒ?guī)實施的誘變方法將氨基酸取 代、缺失以及添加引入多肽中（參看例如Sambrook等Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 2001)。寡核昔酸引導的位 點特異性（或區(qū)段特異性）誘變程序可以用于提供改變的多聚核苷酸，其具有根據(jù)所需的 取代、缺失或插入而改變的特定密碼子。蛋白質(zhì)的缺失或截短變體還可以通過使用鄰近于 所需缺失的適宜的限制性核酸內(nèi)切酶位點來構(gòu)建?；蛘?，諸如丙氨酸掃描誘變、易錯聚合酶 鏈反應誘變以及寡核苷酸引導的誘變的隨機誘變技術(shù)可以用于制備多肽變體（參看例如 Sambrook 等，同上）。
[0093] 編碼具有甲烷單加氧酶活性的酶的核酸可以與其它核酸序列組合，諸如啟動子、 多聚腺苷酸化信號、限制酶位點、多克隆位點、其它編碼區(qū)段，等等。
[0094] 野生型（或親本）核酸或多肽與其變體之間的差異可以通過本領(lǐng)域中常規(guī)實 施的方法來確定以確定同一性，這些方法經(jīng)過設(shè)計以在所測試的序列之間得到最大匹 配。用以確定序列同一性的方法可以從公開可用的計算機程序來應用。用以確定兩個 序列之間的同一性的計算機程序方法包括例如BLASTP、BLASTN(Altschul，S. F.等，J. Mol.Biol.215:403-410(1990))以及 FASTA(Pearson *LipmanProc.Natl.Acad.Sci. USA 85 ;2444-2448 (1988))。程序的BLAST系列從NCBI和其它來源公開可用（BLAST Manual,